尿液中囊泡的提取和鉴定

1、尿液中exosome的提取和鉴定一、 exosome的提取（一） 实验准备1. 试剂：Sigma P2714，三乙醇胺，NaOH，蔗糖，去离子水耗材：超速离心管50mL，15mL2. 配制Isolation solution 50 mL1. 10 mM Triethanolamine（三乙醇胺）（MW 185.7） 0.093 g2. 250 mM Sucrose（蔗糖）（MW 342.3） 4.28 g3. 加去离子水 至 45 mL4. 1 M NaOH 调pH至7.6 220 L5. 加去离子水 至 50mL6. 加protease inhibitors day of isolation

2、 3. 3. 5×SDS-Laemmli for Western Blot 50 mL 1. SDS 3.75g2. Glycerol 15 mL3. 1 M Tris-HCl， pH 6.8 2.5 mL4. Bromophenol溴酚蓝 dab5. DTT 60 mg/mL6. 去离子水至 50 mL（二） 实验步骤(Pisitkun 2004; Gonzales, Zhou et al. 2010)1. 将80冻存的尿液取出解冻，涡旋，分装在50mL离心管中。2.从-20中取出Sigma P2714 蛋白酶抑制剂，加入5mL二次水混匀。3.每50mL尿液中加入625 L溶解后的

3、蛋白酶抑制剂（12.5 L/mL Urine）。4.于4，17000 × g 离心15 min。（新鲜尿液25离心） （超速离心机型号Hitachi CP 80MX）5.取上清液置于超速离心管中，装3管，每管分装8mL， 4 200 000 × g离心1 h。（同上新鲜尿液25）6.离心后弃上清，再取17000 × g上清各8mL分置3管中，同上述条件离心。7.弃上清，3管中各加50L isolation solution，涡旋混匀30 s，转移到一个1.5 mL Eppendrof离心管中。8.加1 mL 200 mg/mL DTT 95孵育2 min。9. 将

4、上述溶液转移至高速离心管中，并加入8 mL isolation solution 17000 × g超高速离心10min。10.弃上清，加50 L isolation solution溶解沉淀物，在17 000 × g 离心15 min。取上清做1D SDS/PAGE.11. Bradford 法测蛋白总浓度。12.按1:4体积比加入5×SDS-Laemmli 缓冲液（含60 mg/mL DTT），涡旋混匀。13.60加热10 min，-80保存。（for western blot）朱墨桃师姐提取exosome方法(Zhu, Li et al. 2012)1.2,

5、000 g for 10 min at 4 °C ，除去死细胞；2.取上清，4 °C 10,000 g 离心30 min，除去细胞碎片；3.取上清，4 °C 110,000 g离心70 min，弃上清；4.PBS清洗并重新分散，-80 °C保存。5.microbicinchoninic acid assay (Applygen Technologies Inc, China)测定蛋白含量。二、 负染电镜分析（一）实验准备4% paraformaldehyde 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4），1 % Uranyl acetate乙酸双氧铀in dd

6、-H2O，石蜡膜，200 目镍网（二）实验步骤1. 将20L exosomes 小体悬样与4% 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4）1：1混匀。2. 取10L混合物滴于石蜡膜上，将200目镍网置于液滴中悬浮10min。3. 用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。4. 在20L PBS液滴中悬浮5min，重复。5. 在20L 去离子水液滴中悬浮5min，重复。6. 1% 乙酸双氧铀负染液负染1 min，用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。7. 将镍网正面朝上置于滤纸上，在有盖的玻璃皿中干燥15min。8. 样品准备完毕，进行EM分析。三、 1D SDS-PAGE（一）实验准备Ø 储存液配制：（1）

7、2 M Tris-HCl（2）100 g/L SDS 溶液（3）75%（v/v）甘油（4）10 g/L 溴酚蓝溶液Ø 电泳工作液配制：（1）Acr-Bis液（2）4×分离胶缓冲液（3）100 g/L 过硫酸铵溶液（4）TEMED 成品液（5）5×样品缓冲液（6）10×电泳缓冲液Ø 12% 电泳胶的配制Ø 考马斯亮蓝染色液和脱色液（二）实验步骤1.制胶 装好灌胶器，在分别在两个洁净小烧杯（离心管也可）内配制分离胶和浓缩胶混合液（注意灌胶时再加AP和TEMED），配方见SDS-PAGE溶液配制及具体流程。以枪头搅拌约10-20 sec，灌

8、胶分离胶。在胶面上小心地铺上几毫米厚的水层，然后常温凝固30 min（胶面与水层间界面清晰说明胶已凝好）。此时倒出水层，浓缩胶混合液加入AP和TEMED，枪头搅拌均匀，加入灌胶器，上覆水层，然后插入梳子，凝固2h。2.上样跑胶 打开固定玻璃板的塑料夹，取出梳子，取下胶板装入电泳槽，在电泳槽中加入电泳缓冲液，上槽灌满，下槽电泳缓冲液的量根据电泳胶数目参照电泳槽上的刻度线确定。根据蛋白定量结果，每条泳道上样量在15 g左右。2×样品缓冲液与样品1：1混合，上样体积一般为15-20L，插入上样梳上样。电泳条件：step 1: 80V 5min,step 2: 150V 2h,注意观察溴酚蓝

9、的位置，一般半小时左右完成。3.染色及脱色 关闭电源，取出电泳后的胶板，用刮胶板小心撬开玻璃板将胶取下（不可用蛮力，用二次水润湿比较容易取下来），置于带盖的玻璃皿中，加入染色液（以刚没过凝胶即可），于微波炉加热约40-70 sec至染色液微沸（注意盖子不要盖的太紧以防染色液爆沸喷溅），然后于脱色摇床上继续染色约10 min。染色液请倒入专用的回收容器内。淋洗凝胶冲去剩余染料，然后倒入适量的脱色液，微波加热至微沸后于摇床上脱色约10 min，重新换上脱色液室温摇床脱色至完全去除背景色。4.扫描及后处理 脱色后的凝胶置于扫描仪上扫描凝胶图像并保存，不立即酶解的凝胶在二次水中4冰箱保存。（尽快处理，

10、防止蛋白扩散和变质）四、 1D SDS-PAGE蛋白质条带胶内酶解（一）实验准备脱色及脱水1. 25 mM NH4HCO3 100 mg NH4HCO3，50 mL dd H2O2. 25 mM NH4HCO3/50 % ACN 100 mg NH4HCO3，25 mL ACN，25 mL dd H2O3. Stock Solution：1 %甲酸 990 L dd H2O，10 L甲酸4. 0.1 %甲酸 100 L Stock solution，900 L dd H2O还原和烷基化5. 10 mM DTT 1.5 mg DTT/25 mM NH4HCO36. 55 mM 碘乙酰胺 10 m

11、g碘乙酰胺/ 25 mM NH4HCO3胰酶消化7. Trypsin（Promega V5113） 12.5 ng trypsin/25 mM NH4HCO3提取肽段8. 50 % ACN/0.5 甲酸 500 L stock solution，500 L ACN质谱准备9. Millipore ZipTip C18 Pipette Tips ?10. Stock solution：1% 甲酸11. Equilibration and washing：0.1 % 甲酸12. Wetting and elution：50 % ACN/0.1 % 甲酸 100 L stock solution，5

12、00 L ACN, 400 L dd H2O（二）实验步骤1. 将胶条用手术刀片或保险刀片按顺序切下，每条带约1.5 mm3大小，7 cm 胶条约切12 15条；2. 将胶条切成1-2 mm2的小块，置于1.5 mL EP管中，记录条带号及相应的位置；3. 用200 L MilliQ超纯水振荡清洗5 min，重复一次；4. 脱色（1） 加入100 L 25 mM NH4HCO3/50 % ACN，涡旋并孵育10 min,吸干上清；（2） 重复（1）至蓝色褪去，胶粒萎缩变白；（3） 真空干燥胶粒至全干（20min）。5. 还原烷基化（1） 向干胶粒中加入50 L 10 mM DTT/25 mM

13、NH4HCO3，涡旋。56还原反应1 h，冷至室温；（2） 弃掉上清，立即加入50 L 55 mM碘乙酰胺，涡旋后避光室温反应45 min；（3） 弃掉上清，加入100 L 25 mM NH4HCO3 涡旋并孵育10 min清洗胶粒；（4） 弃掉上清，100 L 25 mM NH4HCO3/50 % ACN涡旋并孵育10 min以脱去胶粒中的水分，重复1 次；（5） 真空干燥胶粒至全干（20min）。6. 胶内酶解（1） 加入3倍于胶粒的酶解液冰浴30 min(或放4冰箱)，使胶粒复水；（2） 除去过量的Trypsin溶液后，用50 L 25 mM NH4HCO3清洗胶粒几次，最后用50 L

14、25 mM NH4HCO3覆盖胶粒；（3） 涡旋，37反应过夜。7. 提取肽段（1） 将酶解后上清液转移至1.5 mL离心管中；（2） 向胶粒中加入30 L 50 % 乙腈/0.1 %甲酸，涡旋孵育30min，并超声5 min；（3） 吸取上清与第一次的上清合并；（4） 重复步骤（2）（3）；（5） 涡旋后冷冻浓缩至5-10 L（30min）。加入0.1 %甲酸 15 L，涡旋。五、 质谱鉴定1. ZipTip Protocol ？（1） 将50 L样品加入到96孔板，每个样品一个孔；（2） 将20 L elution solution加入到干净的离心管中，每个样品一个；（3） Wetting

15、 ZipTip：吸10 L wetting solution入针尖，打出，重复操作；（4） Equilibrate ZipTip：吸10 L 平衡液 ，打出，重复操作；（5） Binding：来回吸、打样品10次；（6） Washing：吸washing solution，打掉；重复2次；2. Elution：将离心管中20 L elution solution吸打10次，不要引入空气；3. 将样品浓缩至5 L加入15 L 0.1 % 甲酸，混匀后进样；4. 根据质谱结果搜库。六、 IEF/SDS-PAGE双向电泳（一）第一向等电聚焦（7cm胶条，pH 3-10）1. 从冰箱中取-20冷冻保存

16、的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1mL/管），置室温溶解。2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4/6、5/7各2.5L，充分混匀。3. 从小管中取出200L水化上样缓冲液，加入50L样品，充分混匀。4. 从冰箱取-20冷冻保存的IPG预制胶条（7cm pH 3-10），于室温放置10分钟。5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品(7cm胶条一般加125-250L，10-100g)。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘

17、或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。8. 在每根胶条上覆盖1.5 mL矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。v 7cm胶

18、条水化12小时（18）主动水化（50V）或被动水化v S050V rapid12h 水化（若被动水化，此步省却）v S1250Vlinear30min除盐v S2500Vrapid30min 除盐v S34000Vlinear3h 升压v S44000Vrapid20,000Vhr 聚焦v S5500Vrapid99h 保持10.聚焦结束的胶条应立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20冰箱保存。（二）第二向SDS-PAGE电泳1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶两块。配12mL凝胶溶液，每块凝胶6mL，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ

19、水封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水，用MilliQ水冲洗。3. 从-20冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。4. 配制胶条平衡缓冲液I。5在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入2.5mL胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。7. 配制胶条平

20、衡缓冲液II。8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡

21、液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。17.在低熔点琼脂糖封胶液

22、完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。20.进行染色（按照伯乐染色试剂盒上的操作步骤）Bradford法测蛋白总浓度检测原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测。该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100mL浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至2