第章下分子生物学基本研究法

1、3/9/2022整理ppt1第六章第六章 分子生物学研究法分子生物学研究法 （下）下）3/9/2022整理整理ppt2本章主要内容基因表达研究技术基因表达研究技术基因敲除技术基因敲除技术蛋白质及蛋白质及RNARNA相互作用技术相互作用技术基因芯片技术基因芯片技术其他分子生物学技术其他分子生物学技术3/9/2022整理整理ppt3 3/9/2022整理整理ppt43/9/2022整理整理ppt5vSAGE是基因表达是基因表达定性和定量研究的一种定性和定量研究的一种有效工具，非常适合于比较不同发育状有效工具，非常适合于比较不同发育状态或疾病状态的生物基因表达。态或疾病状态的生物基因表达。v另外另外

2、SAGE能够接近完整地获得基因组表能够接近完整地获得基因组表达信息，能够直接读出任何一种类型细达信息，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。胞或组织的基因表达信息。 3/9/2022整理整理ppt6lRNARNA选择性剪接选择性剪接是指用不同的剪接方式（选择不同是指用不同的剪接方式（选择不同的剪切位点组合）从一个的剪切位点组合）从一个mRNAmRNA前体产生不同的前体产生不同的mRNAmRNA剪接异构体的过程。剪接异构体的过程。lmRNAmRNA前体的选择性剪接，使一个基因翻译为多种前体的选择性剪接，使一个基因翻译为多种蛋白质序列，极大地增加了蛋白质的多样性和基因蛋白质序列，极大地

3、增加了蛋白质的多样性和基因表达的复杂程度，是基因表达多样性的重要表现形表达的复杂程度，是基因表达多样性的重要表现形式。式。3/9/2022整理整理ppt7类型类型平衡剪接平衡剪接5选择性剪接选择性剪接3 选择性剪接选择性剪接相互排斥剪接相互排斥剪接外显子遗漏外显子遗漏剪接剪接5ss3ss5ss5ss5ss5ss3ss3ss3ss3ss5ss3ss3/9/2022整理整理ppt8 3/9/2022整理整理ppt93/9/2022整理整理ppt10 3/9/2022整理整理ppt11人肌糖原磷酸酶人肌糖原磷酸酶基因在基因在11号染色号染色体的定位结果。体的定位结果。3/9/2022整理整理ppt1

4、23/9/2022整理整理ppt133/9/2022整理整理ppt14以上三种方法虽不同，但原理都一致。以上三种方法虽不同，但原理都一致。3/9/2022整理整理ppt151、寡聚核苷酸介导的、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术突变技术已知序列的环状已知序列的环状DNA人工合成一段引物人工合成一段引物变性变性模板模板定点突变定点突变细菌转化细菌转化延伸诱变寡核苷酸引物延伸诱变寡核苷酸引物DNA聚合酶聚合酶筛选引入突变的环状筛选引入突变的环状DNA3/9/2022整理整理ppt162、重叠延伸技术、重叠延伸技术正向正向诱变诱变引物引物FM反向反向引物引物R2正向正向引物引物F2反向反向诱变诱变引物引

5、物RM已知序列已知序列DNA模板模板在重叠区发生退火在重叠区发生退火PCR3使用引物使用引物F2和和R2扩增扩增PCR4全长突变全长突变DNA片段片段形成全长双链突变形成全长双链突变DNA反向互补反向互补产物产物产物产物21PCR3/9/2022整理整理ppt173、大引物诱变法、大引物诱变法PCR1产物产物正向诱变正向诱变引物引物（M）反向引物反向引物（R1）双链大引物双链大引物退火和野生型基因复性退火和野生型基因复性PCR2正向引物（正向引物（F2）退火温度退火温度PCR2PCR1已知序列已知序列DNA模板模板全长突变全长突变DNA片段片段3/9/2022整理整理ppt183/9/2022

6、整理整理ppt19 P200P200（gene knockout)又称基因打又称基因打靶（靶（gene targeting）。这种技术是通过基因工程）。这种技术是通过基因工程的方法将一个的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除结构已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲入），入），然后从整体上观察实验动物，从而推测相然后从整体上观察实验动物，从而推测相应基因的功能。应基因的功能。这种人为地把实验动物某一种有这种人为地把实验动物某一种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。3/9/2022

7、整理整理ppt20 3/9/2022整理整理ppt213/9/2022整理整理ppt22（图见（图见P203P203）3/9/2022整理整理ppt23图图6-10 正负筛选法（正负筛选法（PNS法法) )筛选已发生同源重组的筛选已发生同源重组的细胞细胞3/9/2022整理整理ppt24构建与靶基因同源构建与靶基因同源 (1015kb)的载体的载体外显子插有新霉素外显子插有新霉素抗性基因抗性基因 （neor）作为正选择的标志作为正选择的标志疱疹病毒胸苷激疱疹病毒胸苷激酶酶(HSV-tk)基因基因作为负选择作为负选择体外培养体外培养新霉素新霉素(G418)和致死核苷类似物和致死核苷类似物(GAN

8、C)作双重筛选作双重筛选将重组体导入将重组体导入ES细胞细胞存活的存活的ES细胞细胞3/9/2022整理整理ppt25v真核生物基因敲除的技术路线主要包括真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重构建重组基因载体组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNADNA导入胚胎干细胞纯系中，导入胚胎干细胞纯系中，使外源使外源DNADNA与胚胎干与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的体中的DNADNA序列整合到内源基因组中并得以表达序列整合到内源基因组中并得以表达。3/9/2022整理整理ppt26方法方法表型

9、分析表型分析构建载体构建载体同源重组同源重组筛选筛选X被敲除的被敲除的ES细胞细胞显微注射显微注射回交得到回交得到X被敲除的动物被敲除的动物3/9/2022整理整理ppt27v显微注射命中率较高，技术难度相对大显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。作使用方便。v胚胎干细胞（胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。基础。3/9/2022整理整理ppt28(2)(2)条件型基因敲除条件型基因敲除 条件型基因剔除是指某一条件型基因剔除是

10、指某一特定特定细胞类型或细胞细胞类型或细胞发育的发育的特定特定阶段剔除某一阶段剔除某一特定特定基因的技术。基因的技术。 常用的条件型基因敲除有：常用的条件型基因敲除有：噬菌体的噬菌体的Cre/LoxP系统、系统、Gin/Gix系统系统酵母细胞的酵母细胞的FLP/FRT系统、系统、R/RS系统系统3/9/2022整理整理ppt293/9/2022整理整理ppt30构建打靶载体构建打靶载体同源重组同源重组筛选中靶筛选中靶ES显微注射显微注射杂交删除杂交删除neor基因基因特定阶段诱导特定阶段诱导Cre酶酶切除目的片段切除目的片段动物观察分析动物观察分析体外培养体外培养3/9/2022整理整理ppt

11、313/9/2022整理整理ppt32（3 3）植物基因敲除技术）植物基因敲除技术 3/9/2022整理ppt333/9/2022整理整理ppt343/9/2022整理整理ppt353/9/2022整理整理ppt363/9/2022整理整理ppt373/9/2022整理整理ppt383/9/2022整理整理ppt39酵母双杂交技术的基本原理已知蛋白编已知蛋白编码基因码基因X编码编码BD基因基因cDNA不不同片段同片段Y编码编码AD基因基因诱饵基因诱饵基因猎物基因猎物基因转化酵母细胞转化酵母细胞报告基因报告基因表达表达不表达不表达X与与Y编编码蛋白码蛋白有无相有无相互作用互作用有有无无3/9/2

12、022整理整理ppt403/9/2022整理整理ppt413/9/2022整理整理ppt423/9/2022整理整理ppt43 3/9/2022整理整理ppt443/9/2022整理整理ppt453/9/2022整理整理ppt463/9/2022整理整理ppt473/9/2022整理整理ppt48基本操作过程为基本操作过程为:cDNA与已知酵母转录激活结与已知酵母转录激活结构域（构域（AD）基因融合）基因融合导入酵母细胞导入酵母细胞基因产物基因产物（蛋白质）（蛋白质）顺式作用元件顺式作用元件激活激活Pmin启动子启动子报告基因得到表达报告基因得到表达筛选阳性克隆筛选阳性克隆测序分析测序分析cD

13、NA替换了编码结合结构替换了编码结合结构域域(BD)蛋白基因蛋白基因3/9/2022整理整理ppt493/9/2022整理整理ppt50 这是一通过抗体来特异性的识别候选蛋白质这是一通过抗体来特异性的识别候选蛋白质的方法的方法 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与抗体发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体能与抗体发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法，在固体基系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法，在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上的底部或微膜上。3/9/202

14、2整理整理ppt51靶蛋白抗体靶蛋白抗体固体基质固体基质待筛选蛋白待筛选蛋白低离心力沉淀或微膜过滤低离心力沉淀或微膜过滤亲和反应亲和反应反应体系反应体系靶蛋白抗体靶蛋白抗体待筛选蛋白待筛选蛋白相互作用相互作用沉淀得到待筛选蛋白沉淀得到待筛选蛋白3/9/2022整理整理ppt523/9/2022整理整理ppt533/9/2022整理整理ppt54RNAi作用机制作用机制Dicer酶酶双链双链RNAsiRNA （21 25个核苷酸的小个核苷酸的小片段双链片段双链RNA）沉默复合体沉默复合体（RISC）的形成的形成切割目的切割目的mRNA分子中与分子中与siRNA反义链互补的区域反义链互补的区域3/

15、9/2022整理整理ppt55RNAiRNAi技术的应用技术的应用：与传统的同源重组基因敲除技术相比与传统的同源重组基因敲除技术相比v高稳定性高稳定性v高效率高效率v易于操作易于操作v可实现多种基因突变可实现多种基因突变3/9/2022整理整理ppt56。 生物芯片生物芯片是高密度固定在是高密度固定在固相支持介质固相支持介质（玻璃片（玻璃片/ /尼龙膜）尼龙膜）上的生物信息分子（如上的生物信息分子（如寡核苷酸、基因片段、寡核苷酸、基因片段、cDNAcDNA片段或多肽、蛋片段或多肽、蛋白质）的白质）的微阵列微阵列。阵列中每个分子的序列及阵列中每个分子的序列及位置都是已知的。位置都是已知的。 基因

16、芯片基因芯片上固定的是核酸类物质，主要上固定的是核酸类物质，主要用于用于DNADNA、RNARNA分析。分析。3/9/2022整理整理ppt57v基因芯片基因芯片（gene chip） : :利用点样机等机械装利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个成千上万个“点点”，每个，每个“点点”含有可与一种基含有可与一种基因杂交的一条因杂交的一条DNA探针。由于芯片上有序地排列探针。由于芯片上有序地排列着着DNA探针，因此也被称为探针，因此也被称为微阵列微阵列。3/9/2022整理整理ppt58v基因芯片是能同时监测大量靶基因表达

17、的基因芯片是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。化规律。3/9/2022整理整理ppt59原理：原理：在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段就与相应的探针杂交。样品中含有的各种核酸片段就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就成正比，

18、也就代表该基因的表达量。代表该基因的表达量。经激光共聚经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯片技术已成为当前况。正因为这种特点，基因芯片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。生命科学研究的热点之一。3/9/2022整理整理ppt603/9/2022整理整理ppt613/9/2022整理整理ppt623/9/2022整理整理ppt633/9/2022整理整理ppt643/9/2022整理整理ppt651. 1. 凝胶阻滞试验凝胶阻滞

19、试验(EMSA)(EMSA)v凝胶阻滞试验（凝胶阻滞试验（EMSA)EMSA)是体外分析是体外分析DNADNA与蛋白与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。是质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。是分离纯化特定分离纯化特定DNADNA结合蛋白的经典方法。结合蛋白的经典方法。3/9/2022整理整理ppt66 原理：原理： 在凝胶电泳中在凝胶电泳中DNADNA朝正极移动的距离与其朝正极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比，因此，没有结合相对分子质量的对数成正比，因此，没有结合蛋白质的蛋白质的DNADNA片段跑得很快，而与蛋白质形成片段跑得很快，而与蛋白质形成复合物的复合物的DNADNA由于受到

20、阻滞而跑得慢。由于受到阻滞而跑得慢。 当特定当特定DNADNA片段与细胞提取物混合后，若复片段与细胞提取物混合后，若复合物在凝胶电泳中的迁移率小，就说明该合物在凝胶电泳中的迁移率小，就说明该DNADNA可能与提取物中某个蛋白质分子发生了相互作可能与提取物中某个蛋白质分子发生了相互作用。用。3/9/2022整理整理ppt673/9/2022整理整理ppt68方法：方法：同位素标记待测的同位素标记待测的DNA片段片段细胞提取物细胞提取物DNA-蛋白质复合物蛋白质复合物探针探针DNA温育温育PAGE电泳电泳放射自显影放射自显影进行进行DNA凝胶分析凝胶分析 3/9/2022整理整理ppt69 噬菌体

21、表面展示技术噬菌体表面展示技术(Phage Display (Phage Display Technology)Technology)是一种研究蛋白质相互作用的方是一种研究蛋白质相互作用的方法。根据蛋白质还可以得到相应的基因片段。法。根据蛋白质还可以得到相应的基因片段。3/9/2022整理整理ppt70感兴趣的蛋白质基因感兴趣的蛋白质基因噬菌体表面蛋白基因噬菌体表面蛋白基因插入到噬菌体载体上插入到噬菌体载体上分离出噬菌体分离出噬菌体插入插入感染大肠杆菌感染大肠杆菌捕获靶蛋白捕获靶蛋白基因表达蛋白质展示在噬基因表达蛋白质展示在噬菌体表面上菌体表面上侵染大肠杆菌侵染大肠杆菌筛选噬菌体筛选噬菌体3/9/2022整理整理ppt71由蛋白质激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白质由蛋白质激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白质可逆磷酸化过程，是生物体内一种普遍且重要的可逆磷酸化过程，是生物体内一种普遍且重要的调节方式，控制着众多的生理生化反应和生物学调节方式，控制着众多的生理生化反应和生物学过程。过程。细胞生长发育、形态建成、细胞周期调控、细胞生长发育、形态建成、细胞周期调控、基因表达