分子生物学思考题

1、分子生物学考试重点（前四章+第七、八章）第一章一、DNA重组技术和基因工程技术 （p12）答：DNA重组技术：将不同的DNA片段，按照人们的设计定向连接起来，于特定的受体细胞中和载体一起复制并得到表达，产生影响受体的新的遗传性状的技术。基因工程技术：除DNA重组技术外还包括其他对生物细胞基因组结构进行改造的体系。关键：工具酶的发现和应用前景：1、合成正常细胞中含量很低的多肽 2、定向改造基因组结构 3、进行基础研究二、请简述现代分子生物学的研究内容。（第二版前言、p12标题）答：分子生物学：研究核酸等生物大分子的功能、形态、结构特征的重要性和规律性的科学，主要关心的是核酸在细胞生命过程中的作用

2、，包括核酸的复制和保存、基因的表达和调控。 研究内容：DNA重组技术，基因的调控和表达，生物大分子的功能结构结构分子生物学，基因组、功能基因组和生物信息学。第二章一、核小体（P27）答：核小体：由H2A、H2B、H3、H4各两分子组成的八聚体和约200bp的DNA组成。八聚体在内，DNA盘绕在外。其是DNA压缩的第一步。若用核酸酶降解核小体，只能得到约146bp的核心颗粒。（另：H1在核小体的外面）核心颗粒：除去接头DNA的核小体单体，长度约146bp核小体单体：八聚体+200bpDNA组成，包括接头DNA二、DNA的半保留复制（p38）答：DNA在复制过程中，碱基间的氢键首先断裂，双螺旋解旋

3、解链，每条单链分别作为模板合成新链。新生成的DNA分子与原DNA分子的碱基顺序完全一样，这样每个子代分子的DNA一条单链来自模板链，另一条单链来自新合成的链，这种复制方式成为DNA的半保留复制。三、转座子（p57）答：转座子是存在于DNA上的可以自主复制和移动的基本单位，其可以分为两大类：插入序列和复合型转座子，另外还有TnA家族。四、DNA的一、二、三级结构特征。（P32p37）答：1、各级结构的定义：DNA的一级结构：指四种核苷酸的连接和排列顺序DNA的二级结构：指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构DNA的三级结构：在DNA双螺旋基础上进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。2、各级

4、结构的特点：DNA一级结构：（1）、DNA分子是由两条脱氧核苷酸长链盘绕而形成的。（2）、脱氧核糖和磷酸交替连接，在外侧形成骨架；碱基排列在内侧。 （3）、碱基之间按照互补配对的原则以氢键连接（AT、CG）。DNA二级结构：（1）、右手螺旋（A-DNA、B-DNA） 、双螺旋之间有凹槽，小沟1.2（nm）大沟2.2（nm） 、碱基之间以氢键连接，碱基平面与纵轴垂直，螺旋的轴心穿过氢键的中点、碱基平面距离0.34nm，双螺旋直径2.0nm，每十个核苷酸为一个结构重复周期。 （2）、左手螺旋（Z-DNA）是右手螺旋结构模型的一个补充和发展DNA三级结构：（1）、超螺旋是其三级结构的主要形式，分为正

5、超螺旋与负超螺旋。在不同的拓扑异构酶的作用下可以相互转变。 （2）、DNA分子的变化满足公式：L=T+W（连接数旋转数+超螺旋数） （3）、双螺旋DNA的松开导致负超螺旋、拧紧导致正超螺旋。五、DNA复制通常采取哪些方式？（p40）答：（1）线性DNA双链复制：，复制叉方向：单一起点单向、双向，或多起点双向，特殊机制：I，线性的复制子形成环状或多聚分子 II，末端形成发卡结构 III，特殊蛋白介入，在真正末端启动复制 （2）环状DNA双链复制：型、滚环型、D环型六、真核生物DNA的复制在哪些水平上受到调控？（p51）答：真核细胞生活周期：G1期：复制预备期、S期：复制期、G2期：有丝分裂预备期

6、、M期：有丝分裂期。 调控方式：（1）、细胞生活周期水平调控：决定是否从G1期进入S期 （2）、染色体水平调控：决定不同染色体或者同一染色体的不同部位的复制子按一定顺序在S周期进行复制 （3）、复制子水平调控：决定复制子是否进行复制七、DNA 修复包括哪几种？p51p55答：1、错配修复：通过复制前母链甲基化来识别错配的子链，根据“保留母链，修复子链”的原则，通过两种方式（3端、5端）剪切和合成新链修复。 2、切除修复：（1）、碱基切除修：<1>、糖苷水解酶：水解受损核苷酸上的N糖苷键，形成去碱基位点（即AP位点）<2>、AP核酸内切酶：将受损核酸的糖苷磷酸键切开<

7、;3>、DNA聚合酶：合成新的片段<4>、DNA连接酶：连接，完成修复（2）、核苷酸切除修复：通过DNA切割酶和DNA聚合酶实现修复 <1>、DNA切割酶：切割损伤部位的磷酸糖苷键<2>、DNA聚合酶（原核）或（真核）：合成新片段<3>、DNA连接酶：连接，完成修复3、重组修复：又称复制后修复，复制时跳过损伤部位，之后通过DNA重组修复4、直接修复：不通过切除来修复，如DNA光解酶使环丁烷胸腺嘧啶二聚体或64光化物还原成单体。5、SOS修复：诱导DNA修复，诱变反应，细胞分裂的抑制，溶原性细菌释放噬菌体等。细胞癌变也与SOS修复有关第三章一

8、、Pribnow box（P76）答：为原核生物指导转录的DNA模板链上一段由5个核苷酸（TATAA）组成的共同序列，其为RNA聚合酶紧密结合点，其又位于起始位点上游10bp处，故又称10区。二、编码链（p66）答：将与mRNA序列碱基顺序相同的那条DNA单链称编码链，又称有义链；另一条根据碱基互补配对原则指导mRNA合成的DNA单链称为模板链，又称反义链。三、上升突变（p78）答：细菌中常见两种突变：上升突变、下降突变，上升突变指：增加pribnow box的共同序列的同一性能够提高启动子的效率，从而提高基因的转录水平的一种突变。例如乳糖操纵子中的pribnow区的TATGTT变为TATAT

9、T能够提高操纵子的基因转录水平。四、增强子（p78）答：是除启动子以外与转录起始有关的序列，一般位于200bp处，能够增强转录起始。特点：远距离效应、顺式调节、可对外部信号有反应；无方向、有相位；无物种基因特异性、有组织特异性。五、简述生物体内RNA的种类和功能（P67）答：（1）mRNA：编码特定蛋白质序列 （2）tRNA： 识别mRNA中的遗传信息，将其转化为相应的氨基酸后加入到多肽链中 （3）rRNA： 直接参与核糖体内的蛋白质合成（为最多的RNA）六、什么是DNA模板与mRNA及蛋白质产物之间的共线性关系？（p67）答：书上67页图31七、转录一般被分为哪几个步骤？（p67p69）答：

10、模板识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并结合的过程转录起始：RNA聚合酶与启动子DNA双链结合后，形成转录泡，RNA链上第一个核苷酸键的产生。通过启动子：第一个核苷酸键产生到形成九个核苷酸短链的过程。转录延伸：RNA聚合酶释放因子后，核心酶沿DNA模板链移动并使新生RNA不断延伸的过程转录终止：RNA延伸到终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二脂键，转录泡瓦解，RNA-DNA杂化双链分离，DNA恢复双链，RNA和RNA聚合酶从模板释放。八、转录终止子与翻译终止密码的结构特点？（转录终止子结构p90）答：转录终止子结构：（1）不依赖因子的终止：在终止位点上游一段富含GC二重对称区，

11、通过转录形成RNA容易出现发卡结构，该结构阻止RNA聚合酶的前进，破坏RNA-DNA杂化双链的结构在终止位点上游存在48个A组成的序列，转录产物形成不稳定的rUdA区域，上述两者共同作用，使RNA聚合酶从三元复合物中脱离出来（2）依赖因子的终止：因子为六个相同亚基的聚合物，其能够催化NTP的水解促使新生成的RNA从三元复合物中脱离出来，从而终止转录翻译终止密码结构：待定九、什么是RNA编辑？其生物学意义？（p99、p101）答：定义：RNA编辑是某些RNA，特别是mRNA前体的一种加工方式，通过插入删除或取代一些核苷酸残基，导致mRNA编码的遗传信息发生改变，通过编辑的mRNA序列发生了不同于

12、模板DNA的变化。RNA编辑的机制有两种：位点特异性脱氨基作用和RNA指导的尿嘧啶插入或删除。生物学意义：（1）、校正作用：弥补因突变而缺失的遗传信息。 （2）、调控翻译：通过构建或除去起始密码子和终止密码子来调控翻译。 （3）、扩充遗传信息：能使基因产物获得新的结构功能。第四章一、SD序列（P130）答：原核生物的mRNA上，于翻译起始密码AUG上游约10bp处，有一段5AGGAGGU3的富嘌呤区，称为SD序列。该序列与核糖体30s亚基的16srRNA中的3端一段富嘧啶区互补；通过SD序列，核糖体与mRNA相互作用并结合。二、信号肽(p145)答：定义：在编码分泌蛋白的基因中，大多5'

13、; 端有一段基因用于编码疏水性肽段，这一肽段在成熟的分泌蛋白中并不存在，其功能在于引导随后产生的蛋白质多肽链穿过内质网膜进入腔内。其在蛋白质的内质网高尔基体质膜分泌途径中具有重要作用，并被称之为信号肽。（来源百度）特征：（1）带有1015个疏水性氨基酸 （2）靠近N端常有一个或数个带正电的氨基酸 （3）C端于蛋白酶切割位点附近常有数个极性氨基酸，且离切割位点最近的极性氨基酸常有很短的侧链三、简述tRNA 的结构。（P116p117）答：二级结构：“三叶草”结构，含76个碱基，相对分子量为2.5×104 （1）共同点：、含稀有碱基 、3末端均为CCA-OH （2）五个臂：、受体臂：含C

14、CA-OH 、D臂：因含二氢尿嘧啶得名，并含三个可变核苷酸位点 、反密码子臂：其套索结构中含有三个反密码子 、TC臂：根据三个核苷酸命名，其中为拟尿嘧啶 、多余臂：为tRNA变化最大的部位。 三级结构：L形折叠。特点：、氢键维系 、两个新增双螺旋结构：TC臂、受体臂和D臂 、L的两头：分别为受体臂和反密码子臂 、L的转角处：TC臂和D臂的套索结构 、结构意义：满足翻译时核糖体与mRNA的结构相适应。四、简述核糖体的组成及其功能。（P123p126）答：结构：（1）、由大亚基和小亚基组成，每个亚基都由核糖体蛋白以及rRNA组成 （2）、根据沉降系数不同70S型（原核生物，由50S+30S组成）8

15、0S型（真核生物，由60S+40S组成）（3）、核糖体蛋白：组成活性中心，去除任一蛋白，总体也会失去功能 （4）、rRNA：5S rRNA： 结合50S大亚基、TC臂。 16S rRNA： 结合mRNA、50S大亚基、A（P）位置的tRNA 23S rRNA： 结合tRNAMET 5.8S rRNA： 存在于真核生物中，相当于5S rRNA 18S rRNA： 存在于酵母中，相当于大肠杆菌16S rRNA 28S rRNA： 功能未知 （5）、三个tRNA结合位点：A：结合氨酰tRNA P：结合肽酰tRNA E：移出tRNA tRNA的移动顺序：APE 功能：（1）、所有生物体的核糖体结构相近

16、、功能相同参与蛋白质多肽的合成 （2）、大亚基的功能：肽键的形成、结合氨酰tRNA、结合肽酰tRNA（3）、小亚基的功能：识别mRNA，识别起始部位、识别密码子与反密码子 （4）、核糖体可以根据需要解离为亚基或者合成为颗粒。五、简述肽链合成过程的生物学机制。（P132p136）答：（1）、后续AAtRNA与核糖体结合、起始复合物生成后，AAtRNA与延伸因子EFTu和GTP形成复合物、AAtRNAEFTuGTP复合物进入核糖体A位。同时，GTP水解、通过另一延伸因子EFTs产生GTP，形成EFTuGTP复合物循坏再利用（2）、肽链合成、AAtRNA的AA从A位进入P位，与fMETtRNAMET

17、上的AA形成肽键、形成肽键后的起始tRNA离开P位、A点准备接受新的tRNA（3）、移位：即核糖体沿mRNA的3端方向移动一个密码子、位于A位的二肽酰tRNA2从A位移动到P位、去氨基tRNA进入E位、mRNA上第三位密码子对应A位另：1、氨基酸活化 2、肽链合成的起始 指核糖体与mRNA及起始氨酰-tRNA结合成起始复合物。分为三步：(1) 核糖体的小亚基与mRNA结合小亚基能识别mRNA上的起始密码子AUG，并附着在这个部位，形成“小亚基 - mRNA”复合物。(2) 起始氨酰-tRNA结合上去起始氨酰-tRNA与mRNA上的起始密码子结合，形成了“小亚基 - mRNA - fMet-tR

18、NA”复合物。(3) 大亚基结合上去大亚基与上述复合物结合，形成了起始复合物，即“核糖体 - mRNA - (f)Met-tRNA”复合物。在整个起始过程中，还需有3种蛋白质因子参与，称起始因子(IF)，即IF1、IF2、IF3。另外，起始过程还消耗高能化合物，即1分子GTP。3、肽链的延伸(1) 进位与起始复合物中A位处的密码子相对应的aa-tRNA进入。此时需消耗1分子GTPGDP。(2) 转肽P位的fMet-tRNA上的甲酰甲硫氨酰基转移至A位的aa-tRNA的aa的氨基上，形成肽键。催化此反应的酶叫肽基转移酶，它是核糖体大亚基中的一种酶。此转肽反应不另外消耗高能化合物，因为活化的氨基酸

19、已具有潜在的能量。(3) 移位核糖体沿着mRNA 3端方向移动一个密码子的距离，这样，原来P位空载的tRNA离开了核糖体，原来A位的肽酰-tRNA位于了P位，而A位空了出来。这一步需消耗1分子GTPGDP。通过以上三步，延长了一个氨基酸。在此过程中，还需要一些蛋白质因子的参与，称为延长因子（EF）。每延伸一个氨基酸，需要消耗 2 分子GTPGDP。（进位和移位）接下来，空着的A位又有新的aa-tRNA进入，通过转肽移位，又可延长一个aa。重复上述步骤，随着核糖体从53移动，可使aa按照mRNA上密码子的要求一个个地对号加入，肽链从N端向C端延伸。4、肽链合成的终止与释放 当核糖体由53移动至终

20、止密码子（UAA、UAG、UGA）时，由于没有与之相应的tRNA，终止因子RF进入A位。终止因子使肽基转移酶的活性转变为水解酶活性(使肽基不再转移到氨酰tRNA上，而是转移给水分子)，从而将肽酰tRNA水解。这样肽链被释放。空载的tRNA也离开核糖体。核糖体的大小亚基解离并离开mRNA。5、新合成多肽链的折叠和加工六、蛋白质加工的种类和意义。（P136p140）答：（1）、N端fMET和MET的切除：无论真核、原核细胞，蛋白翻译之后均要切除N端的甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸（2）、二硫键形成：二硫键的正确形成对于形成蛋白质天然空间构象具有重要意义（3）、特殊AA的修饰：、磷酸化：苏氨酸、丝氨酸、酪氨

21、酸（苏西洛） 、糖基化：、真核细胞蛋白的特征 、于内质网内受糖基化酶的作用 、所有分泌蛋白和膜蛋白均为糖基化蛋白 、甲基化、乙基化、羟基化、羧基化（4）、切除新生肽链中的非功能片段：肽类激素或酶的前体大多都要经过此类加工才能成为活性分子七、简述蛋白质转运的种类和机制。P142p153答：1、蛋白质转运分为：翻译转运同步机制，翻译后转运机制2、几种主要蛋白质的转运机制：（1）、分泌蛋白：翻译转运同步机制 （2）、细胞器蛋白：翻译后转运机制 （3）、膜蛋白：两者都有3、翻译转运同步机制：（1）、核糖体组装、翻译开始 （2）、位于N端的信号肽首先被翻译出来 （3）、SRP与含有信号肽的新生肽链以及核

22、糖体及GTP结合，翻译被中止 （4）、膜上受体DP与SRP结合，形成孔道 （5）、GTP水解，SRP释放、翻译继续进行，边翻译边跨膜 （6）、翻译结束，信号肽被切除、核糖体解离并恢复到翻译前起始状态4、翻译后转运：（1）、线粒体转运：、待转运多肽由成熟蛋白质和前导肽组成 、转运需要能量 、先有线粒体外膜上的Tom受体识别Hsp70或MSF等分子伴侣结合的待转运多肽，再通过Tom和Tim组成的通道进入线粒体腔 、前导肽特点：、碱性氨基酸和羟基氨基酸含量多、有形成两条螺旋的能力 （2）、叶绿体转运：叶绿体定位信号肽为两部分：、决定该蛋白能否进入叶绿体基质 、决定该蛋白能否进入叶绿体类囊体 特征：、

23、活性蛋白水解酶位于叶绿体基质中 、叶绿体膜与叶绿体蛋白前体特异性结合 、叶绿体蛋白前体内可降解序列因植物和蛋白种类不同而不同 （3）、核定位蛋白转运：真核生物：、NLS（核定位序列）与核转运因子结合，停留于核孔、依靠GTP水解能量（Ran酶），进入细胞核、亚基解离 原核生物：、新生成蛋白质与分子伴侣SecB结合，形成结合物 、结合物与膜上的SecASecYEG复合物结合 、通过SecA水解ATP将蛋白质分段送出胞外第七、八章一、定义：基因家族。（P282）答：真核细胞中相关基因按功能成套组合，称为基因家族，同一家族的成员有时紧密排列，组成一个基因簇，但大多分布在同一染色体的不同部位，甚至不同的

24、染色体，有各自不同的表达调控模式。二、简述操纵子学说。（P237）答：（1）、1961年，由法国科学提出，最初发现的是大肠杆菌的乳糖操纵子。其由三个结构基因Z、Y、A，以及启动子、控制子和阻遏子等组成，负责调控大肠杆菌的乳糖代谢。（2）、乳糖操纵子结构基因的表达受阻遏蛋白和诱导物的调控，当阻遏蛋白结合到操纵基因之上时，结构基因不产表达，而乳糖（充当诱导物）会与阻遏蛋白结合，使之从操纵基因上脱落下来。这时，操纵基因开启，结构基因表达，细菌就能分解并利用乳糖了。三、简述乳糖操纵子的调控模型。（P240）答：（1）、Z、Y、A的基因产物由同一条多顺反子mRNA编码；Z编码半乳糖苷酶、Y编码半乳糖苷透

25、过酶、A编码半乳糖苷乙酰基转移酶 （2）、启动区（P）位于阻遏基因（I基因）和操纵区（O区）之间，不能主动进行糖苷酶和糖苷透过酶基因的高效表达 （3）、操纵区为一段短DNA链（长约26bp），是阻遏物的结合位点 （4）、阻遏物与操纵区结合后，阻遏lac mRNA的转录 （5）、诱导物与阻遏物结合后，改变阻遏物的空间构象，使其不能结合到操纵区，从而激活lac mRNA的表达四、简述顺式作用元件与反式作用因子。（P299）答：（1）、顺式作用原件：影响自身基因表达活性的非编码DNA，如启动子、增强子、沉默子（2）、反式作用因子：、定义：能够直接或间接识别或结合在顺式作用原件的核心序列，调控靶基因转

26、录效率的蛋白质 、常见的反式作用因子：、 HTH结构（螺旋转折螺旋结构） 、 锌指结构 、bZIP结构（碱性亮氨酸拉件） 、bHLH结构（碱性螺旋环螺旋结构） 、同源域蛋白 、反式作用因子的唯一结构基础：转录活化域 、转录活化域主要结构：、带负电的螺旋结构 、富含谷氨酰胺的结构 、富含脯氨酸的结构五、DNA 甲基化的方式及其作用。（P292）答：1、方式：通过两种甲基化酶 （1）日常型甲基化酶：通过甲基化的母链，将DNA分子中处于半甲基化状态的甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化 （2）、从头合成甲基化酶：无需母链，将未甲基化的CpG进行甲基化。 2、常见的DNA甲基化：5mC（5甲基胞嘧啶），N6

27、mA（N6甲基腺嘌呤），7mG（7甲基鸟嘌呤）。 3、作用：通过甲基化关闭某些基因的活性、改变染色体结构、DNA构象、DNA稳定性，以及和蛋白相互作用来达到调控基因表达。六、简述真核基因转录的过程和调控方式。（P296起）答：1、转录过程：一般转录过程：模板识别、转录起始、转录延伸、转录终止（参见第三章第七问） 真核生物参转录机器的组成： （1）、启动子、核心启动子 、结构：包括转录起始位点以及其上游3525bp处的TATA盒 、作用：确定转录起始位点，产生基础水平转录 、上游启动原件、结构：包括位于70bp的CAAT盒以及GC盒等 、作用：提高转录效率 （2）、转录模板：从转录起始点到RNA

28、聚合酶转录终止处的全部DNA序列。 （3）、RNA聚合酶 （4）、RNA聚合酶基础转录所需的蛋白质因子（TF）： 、TFD、B、F形成初级复合物 、TFH、E加入后形成完整转录复合物 、加入TFA可提高转录效率 、转录时TFD、A滞留在转录起始位点上。 2、调控方式：大多数通过顺式作用原件和反式作用因子相互作用调控 （1）、顺式作用原件：启动子：（见上） 增强子：（定义、功能特点见第三章） 沉默子：为参与基因表达负调控的一种元件，其DNA序列被调控蛋白结合后阻断了转录起始复合物的形成或活化，使基因表达活性关闭。（2）、反式作用因子：（见上）分子生物学考试重点后半部分一、基因工程答：在体外将核酸

29、分子插入载体分子中，使之进入原先不含此类分子的寄主细胞中，并使之进行持续稳定的繁殖和表达的技术。其与其他技术最显著的区别是，基因工程技术跨越了天然生物屏障，能将来自任何生物的基因置于与之毫无亲缘关系的寄主细胞中。二、限制性核酸内切酶答：1、定义：能识别DNA中特定的碱基序列，并从该位点切开DNA分子的酶称。其能够识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA分子失去活性，并限制外来噬菌体的繁殖。2、分类：（1）限制性核酸内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别位点附近的核苷酸切割DNA分子，但切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。代表酶：EcoK EcoB。（2）、限制性核酸内切酶：能够识别

30、专一的核苷酸顺序，并且在该顺序内固定位置切割DNA分子，识别的专一顺序是：回文对称顺序。代表酶：EcoR。（3）、限制性核酸内切酶：能够识别专一的核苷酸顺序，但所识别的顺序并非回文对称顺序，能够在所识别的核苷酸顺序外专一切割DNA分子。3、反应过程：（1）、加DNA（2）、加Buffer（3）、加酶（4）、37一小时或过夜（5）、停止反应，65加热，加EDTA或苯酚4、注意事项：（1）、使用浓缩限制性核酸内切酶时以1×限制酶缓冲液稀释 （2）、每次取酶均应更换无菌吸头，操作要快，操作完立刻放回20冰箱内 （3）、尽量减小反应体积，但酶的体积最多不超过总体积的10% （4）、切割大量D

31、NA时，延长作用时间可以减少所需的酶，反应时可取少量酶，行微量凝胶电泳来检测反应 （5）、注意星号酶切活力：核酸内切酶在一些特殊情况下，对底物DNA特异性降低，将与特定DNA序列不同的碱基切断三、基因组DNA文库和cDNA文库答：1、基因组DNA文库 （1）、概念：将某种生物细胞的基因组DNA切成适当大小，分别与载体分子组合，并导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一份代表），这样的克隆片段的汇总称为基因组的DNA文库 （2）、应用： 、分离特定DNA片段 、分析特定DNA结构 、研究基因的表达调控 、构建全基因组物理图谱、进行全基因组测序 2、c

32、DNA文库：指通过一系列酶的催化作用，将总体ploy（A）mRNA转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌的寄主菌株细胞，构成包含所有基因组编码序列的cDNA文库四、基因克隆的主要过程。答：包含目的基因的分离和鉴定两个主要步骤。简而言之：切、连、转、筛。（1）选择用于克隆的DNA材料，并将其片段化。（2）在体外，将外源DNA分子片段与合适的载体分子进行连接。（3）将人工重组DNA分子导入能使其正常复制的宿主细胞中进行增值。（4）重组分子转化子克隆的选择或筛选。五、用于分子克隆的载体有哪些特点？答：1、具有高度自主复制和繁殖的能力2、能较容易地进入宿主细胞，并且在宿主细胞内

33、具有较高的拷贝数3、具有合适的限制性酶切位点，可以接纳外源性DNA片段的插入，并且不因含有外源性片段而改变本身的基本特性4、具有筛选位点，和识识别位点；以进行筛选和识别片段是否插入六、用于分子克隆的载体有哪些种类？常用的有哪些？答：1、常用载体种类：质粒、噬菌体、病毒2、常用的哪些：（1）、质粒：pSC101、pBR332、pUC、pGEMZ、柯斯质粒 （2）、噬菌体：噬菌体七、简述核酸的凝胶电泳的基本原理答：1、概念：核酸的凝胶电泳就是以按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术 2、迁移率：在电场下，电泳分子向适当电极的移动速度称，其与电场强度和电泳分子所带的净电荷成正比，和分子量大小成反比 3

34、、基本原理：（1）、生理条件下，RNA和DNA分子为多聚阴离子，其在电场中向正电极迁移 （2）、由于糖磷酸骨架在结构上的重复性，相等数量的DNA分子片段的净电荷几乎相同，其在电场中的迁移率也相同 （3）、在一定强度的电场下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型八、简述携带目的基因的重组子的筛选和鉴定。答：1、根据重组载体的标志作为筛选（1）、抗药性筛选：、利用载体DNA上组装的抗药性选择标记进行筛选的方法。、常用筛选剂：氨苄青霉素；氯霉素；卡那霉素；四环素；链霉素。、重组质粒DNA携带特定的抗药性基因，转化后赋予载体的受体菌在含有相应抗生素的培养基上正常生长，而不含此载体的受体菌不

35、能存活。（2）、插入失活筛选法：外源目的基因的插入，会导致如抗药性基因的失活。将转化后的细胞分别培养在含有抗生素的培养基中，便可检出转化子细胞。（3）、插入表达筛选法：外源目的基因插入特定载体后，能激活用于筛选操作的标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。（4）、显色反应筛选法：如蓝白斑试验：lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现-互补。由-互补而产生的细菌在诱导剂作用下，在生色底物存在时产生蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。2、限制性核酸内切酶图谱分析：将重组子限制酶切

36、位点图谱与空载体图谱对比，根据各种酶切所得DNA片段的大小及变化，可推测有无插入，并确定插入位置。 3、利用PCR方法筛选：利用合适的引物，从初选出来的阳性克隆中提取的质粒为模板进行PCR反应，通过对PCR产物的电泳分析来筛选。4、DNA序列测定 ：对重组子测序。九、简述Northern Blot的基本原理。答：1、原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交，分析mRNA的大小及含量。2、应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。3、方法：提取组织细胞总RNARNA定量变性胶电泳转膜干膜预杂交杂交洗膜压片洗片图像分析十、核酸探针的主要标记法及注

37、意条件。答：1、标记物应具备的条件： （1）、标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。 （2）、标记探针的检测方法应简便省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高、稳定性好、 环境污染少、价廉2、主要标记法：（1）、切口平移：利用DNA聚合酶的特点（2）、随机引物延伸法：人工合成的6个核苷酸残基的寡核苷酸片段，4096种排列顺序， klenow大片段作为聚合酶（3）、末端标记法十一、原位分子杂交技术的基本原理。答：（来源百度）利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色

38、体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物。 （老师课件）是将核酸分子杂交技术与组织细胞化学和免疫组织化学技术结合，在组织细胞原位显示某种特定基因，以及观察mRNA表达、定位及其变化规律的一种技术，可进行组织细胞定位。十二、简述PCR技术的原理、特点及过程。答：1、原理：PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 （1）、变性：通过加热使DNA双螺旋

39、的氢键断裂，双链解离形成单链DNA （2）、模板与引物退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA的量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。 （3）、引物延伸：在DNA聚合酶和dNTPmix及Mg2+存在条件下，53的DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。（4）、小结：高温变性低温退火恒温延伸的过程就是一个PCR循环。延伸产物经第二个循环变性后，又作为模板再合成新的DNA。依此类推，每一循环后的模板均比前一个循环增加1倍。因此，经过n个循环后，产量为2n拷贝。而实际上PCR的平均扩增率为75%。2、特点：高度敏感性、高度特异性、性操作简便、快速、适用样品广泛、有一定程度的单核苷酸错误掺入3、实验过程（实验步骤）：（1）、首先：将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（>94）环境下加热1分钟，使双链D