副猪嗜血杆菌PCR鉴定方法的建立

1、26猪业科学SWINEINDUSTRYSCIENCE2007年第12期F E A T U R E主题策划副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis ,HPS引起猪的多发性浆膜炎,又称为革拉泽氏病(GlassersDisease,临床表现以呼吸道症状、跛行、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等为特征。1材料1.1菌株副猪嗜血杆菌标准株NR4、S W 124、S W 140、S W 114北京市农林科学院畜牧兽医研究所惠赠。疑似副猪嗜血杆菌国内分离株Q D W F 株、N J I N G 株、X X 株、XS 株、P Z 株、FS 株、JUNQ株、NJJQ株、HNDY株、JAS1株。

2、传染性胸膜肺炎放线菌、巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌由江苏省农业科学院兽医研究所提供抗原培养物。1.2PCR引物序列以HPS 的16SrRNA中的基因序列设计引物,由上海生工生物工程有限公司合成,序列如下:上游引物5GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3,下游引物5GGCTTCGTCACCCTCTGT3。2方法2.1菌体培养将副猪嗜血杆菌标准株:NR4、SW124、SW140、S W 114,疑似副猪嗜血杆菌国内分离株:Q D W F 株、N J I N G株、X X 株、X S 株、P Z 株、F S 株、J U N Q株、N J J Q株、H N D Y株、J A S 1株,传副猪嗜血杆菌PC

3、R鉴定方法的建立周勇岐1,2,刘茂军1,苏国东1,朱晓玮2,丁美娟2,邵国青1(1.江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014;2.南京天邦生物科技有限公司江苏南京211102摘要:以HPS的16SrRNA中的基因序列设计合成引物,进行PCR扩增,标准菌株NR4、SW124、SW114、SW140和分离株XX、FS在预计的821bp位置上扩增出特异性条带,NJING株、胸膜肺炎(APP等没有特异性条带产生。这证明P C R 检测副猪嗜血杆菌具有较高的特异性和敏感性。关键词:副猪嗜血杆菌;P C R染性胸膜肺炎放线菌XM9株等菌株分别接种于改良巧克力琼脂平板,37培养48h。观察菌落形态,染

4、色镜检,如有杂菌污染要挑取单个菌落进行亚克隆接种培养,至菌落形态单一。每个平板加入pH7.0的冲洗液,然后5000r/min离心5min ,弃上清再加PBS液10mL离心,如此重复3次,最后沉淀加纯水20mL ,4备用。2.2DNA模板的制备将每个菌液样品分别取1.5mL加入Effendorf管中,煮沸10min,煮沸后,在15800r/min离心5min,取上清液加入适量EDTA缓冲液置4保存,作为PCR模板备用。2.3PCR扩增将2个P C R 引物和15株待检菌株的模板D N A 进行扩增,PCR反应体系为:10×PCRbuffer5L,25mmolMg 2+2.5L,2.5m

5、moldNTPs4l,25mol上游引物2.5L,25mol下游引物2.5L,Taq酶0.5L ,ddH 2O30L,模板DNA3L。PCR反应条件为:952min,9430s,5030s,721min,35cycle,726min进行PCR反应。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳,在紫外灯光下观察结果。3结果与讨论3.1分离株的扩增用上述10个分离株、1个胸膜肺炎放线杆菌株和4个HPS 标准株同时进行P C R 扩增,标准株N R 4、S W 124、S W 140、SW114及分离株XX、FS在821bp的位置上扩增出特异性条带;分离株Q D W F、N J I N G、X S 、P Z

6、、J U N Q 、N J J Q 、H N D Y、J A S 1、XM9等在该位置扩增条带没有出现(见图1。说明以该方法检基金项目:本项目受江苏省科技成果转化专项资金(BA2004032和江苏省自然科学基金重点项目(BK2007711资助。F E A T U R E主题策划2007年第12期SWINEINDUSTRYSCIENCE猪业科学27参考文献:1张培君,孙惠玲,苗得园,龚玉梅,PatBlackall.猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的鉴别诊断及血清型鉴定J .中国兽药杂志.2002,36(10:18-20.2RafrieeM,BaraM,SrephensCP,BlackallPJ.

7、ApplicationofERIC-PCRforthecomparisonofisolatesofHaemophilus parasuis J.AustVetJ.2000,78(12:846-849.3HillCE,MetcalfDS,MacInnesJI.AsearchforvirulencegenesofHaemophilusparasuisusingdifferentialdisplayRT-PCRJ.VetMicrobiol,2003,96(2:189-202.4Puente-RedondoVA,BlancoNG.Gutierrez-MartinDetectionandsubtypin

8、gofActinobacilluspleuropneumoniaestrainsby PCR-RFLPanalysisofthetbpAandtbpBgenesJ.ResMicrobiol.2000,151(8:669-681.5AmanoH,ShibataM,KajioN,Morozumi.Pathologicobservationsofpigsintranasallyinoculatedwithserovar1,4and5of Haemophilusparasuis usingimmunoperoxidasemethodJ.J VetMedSci,1994,56(4:639-644.6Ju

9、ngK.ChaeC.HybridizationforthedetectionofHaemophilusparasuisinnaturallyinfectedpigsJ.JCompPathol,2004,130(4:294-298.(收稿日期:2007-11-28MMarker;1NR410-1;2NR410-2;3NR410-3;4FS10-1;5FS10-2;6FS10-3图3敏感性测定MMarker;1NR4;2SW124;3SW140;4SW114;5FS;6XX;7QDW;8NJING;9XS;10PZ;11JUNQ;12NJJQ;13HNDY;14JAS1;15XM9图1分离株PCR

10、电泳图MMarker;1NR4;2SW124;3SW140;4SW114;5XM9;6巴氏杆菌;7副鸡嗜血杆菌图2PCR的特异性电泳图测分离株XX 、FS为副猪嗜血杆菌阳性。3.2PCR的特异性以副猪嗜血杆菌4个标准型与传染性胸膜肺炎放线菌、巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌做特异性比较。由图2可见,PCR可从副猪嗜血杆菌4个标准型扩增出目的条带,不能从传染性胸膜肺炎放线菌、巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌中扩增到条带。3.3PCR的敏感性从含有109CFU/mL放置了18h的HPS培养物,提取的模板进行10倍稀释的系列浓度用来做PCR敏感性的检测。10-1、10-2、10-3模板浓度均扩增出特异性条带,随着稀释倍数的增加,条带略显减弱趋势(见图3。说明该方法具有较高的敏感性。4结语PCR特异性的关键首先取决于所选靶序列的特异性。本实验的引物序列,选用HPS的16S小的亚单位RNA基因序列与基因库中使用BBS的所有基因序列比较。从51个序列(包含从猪的组织中分离出的相关组织和细菌,被挑选出来,与HPS的M75065基因序列混合,然后辨别HPS的特定基因区域筛选,具有极高的特异性(MRAFIEE、MBARA等。引物序列在靶DNA上的专一性、以及引物