反相高效液相色谱法同时测定参苓白术颗粒中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量

1、反相高效液相色谱法同时测定参苓白术颗粒中白术内酯和白术内酯的含量                    作者：葛建，楼纪东，林芳，黄丽红，姜威，李明揆，卢秀莲【摘要】  目的建立一种同时测定白术内酯和白术内酯的高效液相色谱检测方法，并分析中成药参苓白术颗粒中白术内酯和白术内酯的含量。方法样品采用液-液萃取，以乙腈-水（5050）为流动相，流速1.0 ml? min-1，采用SHIMADZ

2、U ODS柱（150 mm×4.6 mm; 5 m）色谱柱分离；检测波长220 nm。结果标准曲线线性范围为0.550.0 g?ml-1，线性关系良好(r>0.99)，定量限为0.5 g/ml，回收率98%以上，方法的稳定性、重复性和精密度均较好（RSD<3%）。结论该法操作简便、快速、灵敏、准确，已经成功地用于中成药参苓白术颗粒中白术内酯和白术内酯的含量测定。 【关键词】  白术内酯 白术内酯 高效液相色谱-紫外检测法 参苓白术颗粒Abstract：ObjectiveTo develop an HPLC-UV method for the simultaneo

3、us determination of atractylenolide II and III and to detect the content of atractylenolide II and III in Chinese medicinal preparation.MethodsAfter a simple liquid-liquid extraction, atractylenolide II and III were separated on SHIMADZU C18 column(4.6 mm×150 mm, 5 m) and detected by UV spectro

4、metry. The detection wavelength was set at 220 nm. The mobile phase consisted of acetonitrile-water (5050) at a flow rate of 1.0 ml?min-1. The content of atractylenolide II and III in Chinese medicinal preparation(Shenling Baizhu Granule) was simultaneously determined by the method above after simpl

5、e liquid-liquid extraction.ResultsThe linear calibration curves were obtained in the concentration range of 0.550.0 g?ml-1(r>0.99). The lower limit of quantification was 0.5 g?ml-1. The recoveries were more than 98.0%, and the stability, repeatability and precision of the method were all better i

6、n all cases（RSD<3%）. ConclusionThe RP-HPLC method is specific, simple, sensitive and accurate. And this method was successfuly applied to simultaneously quantitate atractylenolide II and III in Chinese medicinal preparation (Shenling Baizhu Granule).Key words：Atractylenolide II;   Atrac

7、tylenolide III;   RP-HPLC; Shenling Baizhu Granule参苓白术颗粒由人参、白术（炒）、茯苓等中药组成，具有补脾胃，益肺气的功效，用于脾胃虚弱，食少便溏，气短咳嗽，肢倦乏力1。论文论文参考网白术为本方中重要组成部分，白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，为常用大宗药材，著名的“浙八味”之一2。其味苦、甘,性温,归脾胃经,功能健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎,为补益类补气药3。白术内酯和白术内酯为白术中的有效成分，该类物质具有抗炎、抗肿瘤作用4。此外该类成分还具有调节胃肠道功能和

8、促进营养物质吸引的功能5。有学者采用了人参皂苷6作为检测指标来对其进行质量控制。为了加强对该药物的质量控制，本研究建立了同时测定该中成药中白术内酯和白术内酯的方法，以此来进一步加强对参苓白术颗粒等含有白术类中成药的质量管理。1  器材LC-20AT高效液相色谱仪（日本，岛津），SPD-20A UV/Vis检测器，浙江大学智达N2000色谱工作站，Shim-pack VP-ODS色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 m），Hettich Mikro 22R超高速低温离心机（德国），SHBZ-IIIA型循环水真空泵，KQ-250B型超声波仪（昆山超声仪器有限公司），YKH-型

9、漩涡混合器（上海精科实业有限公司）。    白术内酯和白术内酯对照品均由实验室自制（图1），纯度分别为99.8%和98.5%，色谱乙腈、色谱甲醇购自杭州嘉辰化工有限公司；参苓白术颗粒，北京汉典制药有限公司（批号：07030101）。2 方法2.1 色谱条件色谱柱为Shim-pack VP-ODS（4.6 mm×150 mm，5 m），保护柱(4.6 mm×12.5 mm，5 m)；检测波长220 nm；流动相为乙腈-水=50-50（V/V）；流速1.0 ml?min-1；柱温30，进样量20 l。2.2 供试品溶液的制备取参苓白术颗粒粉末 (过

10、40目筛) 约2.0 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，加甲醇10 ml，称定重量，超声提取30 min，室温下静置30 min，补足减失的重量，上清液过0.45 m微孔滤膜后，得供试品溶液。2.3 标准曲线和线性范围将分别溶解于甲醇中的白术内酯和白术内酯贮备液混合稀释成0.5，1.0，5.0，10.0，20.0，50.0g?ml-1的白术内酯和白术内酯系列标准液，分别进样得到白术内酯、和内标物的峰面积，分别以白术内酯和白术内酯峰面积与对应两种化合物的质量浓度进行线性回归，求出其回归方程和相关系数。2.4 加样回收率称取一定量已知白术内酯和白术内酯含量的该中成药颗粒粉末，共6份，精密加入白术内酯

11、对照品和白术内酯对照品适量。按“2.2”项下操作，按上述色谱条件进行HPLC分析，计算平均加样回收率。论文参考网2.5 方法的稳定性、重复性和精密度取同一批样品（批号：07030101）按“2.2”项下操作，制备供试品溶液，精密吸取同一供试品溶液，在上述所确定的RP-HPLC条件下，分别于配制后0，1，4，6，24h吸取供试品20 l进样分析，计算白术内酯和白术内酯在供试品溶液中的稳定性；取同一批样品5份，按上述方法分别制备供试品溶液，各进样20 l，计算方法的重复性；将上述供试品溶液吸取20 l进样，重复进样5次，计算方法精密度。3 结果3.1 色谱行为与色谱图在本实验建立的色谱分离条件下，

12、白术内酯II和III的保留时间分别为21.615 min和10.365 min，标准品和经过处理后的参苓白术颗粒样品进HPLC分析的色谱图相应的保留时间处色谱峰均较好（图2）。3.2 流动相和检测波长的选择本研究曾考察了甲醇-水=60-40（V/V）、乙腈-水=50-50（V/V）以及乙腈-水=60-40（V/V）作为流动相，结果表明只有采用乙腈-水=50-50（V/V）作为流动相白术内酯和白术内酯能够很好的分离。本分析方法曾分别尝试了209，220 nm和237 nm作为检测器的检测波长，结果发现在209 nm和237 nm波长处，白术内酯和白术内酯的吸收峰均小于220 nm处，故本研究采用

13、220 nm作为检测器检测波长。3.3 标准曲线建立以及方法确证在0.550.0 g?ml-1浓度范围内，线性关系良好，其回归方程和相关系数分别为：白术内酯：Y= 47 443X+9 491.4  r=0.999 9白术内酯：Y= 35 385X+5 843.8  r=0.999 9在上述制备的供试品溶液分别进样分析后，计算白术内酯和峰面积变化的RSD，求得分析方法的稳定性、重复性和精密度（表1），结果表明所建立的分析方法重复性、稳定性及精密度均较好。白术内酯的平均回收率为102.38，RSD为1.92；白术内酯的平均回收率为 98.58，RSD为2.43，测定结果表明本品

14、回收率好，方法可行。表1  分析方法的稳定性、重复性和精密度（略）3.4  参苓白术颗粒中白术内酯和白术内酯含量的测定取3个批次参苓白术颗粒粉末2.0 g，精密称定，按“2.2”制成供试品溶液，按上述高效液相色谱条件，吸取20 l进样，计算白术中白术内酯和白术内酯的量，结果参苓白术颗粒中白术内酯II含量为0.000253%（RSD=0.59%），白术内酯III含量为0.000 7%（RSD=2.54%）。研究结果表明参苓白术颗粒中白术内酯类化合物含量均较低，可能是由于该中成药的制备工艺中白术炮制方法为炒白术，由于白术内酯类化合物均为挥发油类，所以当炒制白术时，大量的白术内酯

15、类挥发油被挥发或发生了化学反应转变成了其它成分，因此中成药中白术内酯类化合物含量较低。4  结论本研究建立一种简便、快速、灵敏、准确的白术内酯和白术内酯的RP-HPLC分析方法，并将该分析方法应用于中成药参苓白术颗粒中白术内酯和的含量检测，该研究为中成药参苓白术颗粒的质量控制提供一个新的途径和检测手段，同时该研究还可以为进一步加强含白术类中成药质量控制提供方法和手段。【参考文献】  1刘中国，闫欣，马宏，等. 参苓白术颗粒治疗脾胃虚弱证的疗效与安全性多中心对照研究J. 中国药物与临床，2007，7（2）：126.2彭华胜,王德群.白术道地药材的形成与变迁J.中国中药杂志,2004,29（12）:1133.3魏绪刚, 孟庆芬. 对苍术白术出典问题的探讨J. 时珍国医国药, 2002，13（3）：166.4Ching-Chiung Wang, Shyr-Yi Lin, Huey-Chuan Cheng，et al.Pro-oxidant and cytotoxic activities of atractylen