小鼠骨髓间充质干细胞的分离_培养_纯化及鉴定

1、o f I n f l a m m a t i o n a n d T i s s u e D a m a g e i n A c u t e a n d C h r o n i c R e l a p -s i n g E A E J .M a g n e t i c R e s o n a n c e i n M e d i c i n e ,2003,50:309.10B B r o c h e t ,M S A.D e l o i r e ,T.T o u i l ,e t a l .E a r l y m a c r o p h a g e M R I o f i n f l a m

2、 m a t o r y l e s i o n s p r e d i c t s l e s i o n s e v e r i t y a n d d i s e a s e d e -v e l o p m e n t i n r e l a p s i n g E A E J .N e u r o I m a g e ,2006,32:266.11C h i n e t C L ,P a i M ,B o u s q u e t P F ,e t a l .D i s t i n c t s p a t i o t e m po r a l p a t t e r n o f C N

3、 S l e s i o n s r e v e a l e d b y U S P I O -e n h a n c e d M R I i n MO G -i n d u c e d E A E r a t s i m p l i c a t e s t h e i n v o l v e m e n t o f s pi n o -o l i v o c e r e b e l l a r p a t h w a y s J .J o u r n a l o f N e u r o i m m u n o l o g y ,2009,211:49.12于国平,朱克,梁显胤,等.实验性自身

4、免疫性脑脊髓炎的小胶质细胞和星形胶质细胞反应J .中华神经科杂志,1999,32(2:86.(收稿日期:2010-12-24基金项目:吉林省科技厅资助课题(200505193*通讯作者文章编号:1007-4287(201201-0011-03小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学1a ,王广义1b ,张海玉1a *,伏鑫2(吉林大学1.第一医院a .儿外科;b .普外科,吉林长春130021;2.中日联谊医院摘要:目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s ,M S C s 方法,观察M S C

5、 s 体外生长特征。方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073g /m l 的P e r c o l l 分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得M S C s ,通过传代对M S C s 进行纯化和扩增培养。进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P 3代M S C s 细胞周期及表面抗原。结果新分离的M S C s 呈小圆形,形态规整。培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形。P 1、P 2、P 3代M S C s 生长曲线均呈S 型。P 3代M S C s 75.27%的细胞处于G 0-G 1期。P 3代M S C s C D 44表达阳性,表达率为88.7

6、1%,C D 34表达阴性。结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓M S C s ,在含15%F B S 的D M E M -L G 培养基中培养M S C s ,可获得稳定生长的昆明小鼠M S C s 。培养的M S C s 细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究。关键词:骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠中图分类号:Q 78文献标识码:AI s o l a t i o n ,c u l t i v a t i o n ,p u r i f i c a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f m i c e b o n

7、 e m a r r o w m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s i n v i t r o Z HA O J i -x u e ,WA N G G u a n g -y i ,Z HA N G H a i -y u ,e t a l .(T h e F i r s t H o s p i t a l o f J i l i n U n i v e r s i t y ,C h a n gc h u n 130021,C h i n a A b s t r a c t :O b j e c t i v e T o e x p l o r e a n

8、e w m e t h od f o r t he i s o l a t i o n ,c u l t i v a t o n ,p u r if i c a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f M S C s a n d o b s e r v e t h e b i o l og i c a l f e a t u r e s o f m i c e M S C s i n v i t r o .M e th o d s B o n e m a r r o w w a s e x t r a c t e d f r o m t h

9、e ti b i a a n d t h i g h b o n e o f m i c e .T h e m a r r o w l i q u i d w e r e i s o l a t e d w i t h 1.073g /m l o e r c o l l .M S C s w e r e o b t a i n e d b y r e m o v i n g t h e n o n -a d h e r e n t c e l l s .T h e n t h e M S C s w e r e p u r i f i e d a n d e x p a n d e d t h

10、 r o u g h p a s s a g e i n t i m e .T h e g r o w t h c u r v e w a s d r a w n a n d t h e m o r p h o l o g y w a s o b s e r v e d .C e l l c y c l e a n d t h e a n t i g e n e x p r e s s i o n o f P 3M S C s w e r e m e a s u r e d w i t h F A C S .R e s u l t s T h e M S C s e x h i b i t e

11、 d a s m a l l r o u n d s h a p e a f t e r f r e s h s e p a r a t i o n .A f t e r c u l t i v a t e d a n d p a s s a g e d ,t h e M S C s w e r e h o m o g e -n e n o u s l y f u s i f o r m s h a p e d .T h e g r o w t h c u r v e s o f P 1,P 2a n d P 3M S C s w e r e “S ”s h a p e .T h e c e

12、l l s o f G 0-G 1s t a g e a c c o u n t f o r 75.27%.T h e e x p r e s s i o n o f C D 44w a s p o s i t i v e ,w h i l e t h e e x p r e s s i o n o f C D 34w a s n e g a t i v e .C o n c l u s i o n T h e m e t h -o d o f d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n c o m b i n e d w

13、 i t h a d h e r e n t c u l t u r e c o u l d i s o l a t e M S C s f r o m b o n e m a r r o w s i m p l e l y .D M E M -L G m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 15%f e t a l b o v i n e s e r u m i s s u i t a b l e f o r t h e c u l t u r e o f M S C s .T h e c u l t u r e d M S C s l i n

14、 e a ge i s s t a b l e a n d c a n b e u s e df o r f u r t h e r r e s e a r c h .K e yw o r d s :B o n e m a r r o w m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s ;C e l l c u l t u r e ;I d e n t i f i c a t i o n ;M i c e (C h i n J L a b D i a gn ,2012,16:0011骨髓间充质干细胞(M S C s 是骨髓中存在的除造血干细胞(H S C s 外

15、的另一类干细胞。由于其来源充足,取材相对方便,易于体外扩增,以及免疫原性低等优势,已经在组织工程和移植领域得到了广11中国实验诊断学2012年1月第16卷第1期泛的关注。本实验旨在建立一种分离、培养、纯化及鉴定M S C s的方法,并对其生物学特性进行研究,为后续利用骨髓M S C s治疗肝脏疾病的研究提供稳定的干细胞模型。1材料与方法1.1材料与试剂清洁级昆明小鼠,雌雄兼用,体重25±2g,购自吉林大学实验动物中心合格证号:S C X K(吉2003 -0001;D M E M培养基(美国G i b c o B R L公司;胎牛血清(美国H y c l o n e公司;淋巴细胞分离

16、液(上海恒信公司,0.25%胰蛋白酶(华美公司,兔抗鼠C D34、C D44荧光抗体(美国P HA R M I N G E N公司。1.2方法2培养箱培养,换液,将M S C s不断纯化。当细胞生长融合达80%-90%时,用11的0.25%胰蛋白酶和0.02%E D T A消化分散细胞,在显微镜下控制消化时间,计数细胞,以13密度扩增培养。此时标记为P1代,以后每3-4d换液1次;当细胞生长融合达80%-90%时,继续以13的密度传代扩增培养,传代培养并记为P2代,余类推。倒置相差显微镜逐日观察细胞形态和生长情况。2结果2.1昆明小鼠骨髓M S C s的基本形态新分离的M S C s呈小圆形,

17、形态规整。M S C s 传代培养的细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形,此时细胞不再以成克隆的方式生长,而是散在分布生长。M S C s连续传3代,细胞形态无明显变化,无衰老征象,传代周期6-7d。表明M S C s得到了进一步的纯化及扩增。P3代后的M S C s能较好的用于后期实验。2.2骨髓M S C s生长曲线测定由MT T法测定小鼠P1、P2、P3代各个时间点骨髓M S C s活率,绘制的生长曲线呈S型(见图1,由图可见,M S C s在接种后第1-2d为潜伏期,随后便快速增殖,进入对数生长期,持续2-3d,此后细胞增长逐渐减缓,进入平台期。P3代的M S C s能较好的用于后期实验

18、。2.3骨髓M S C s细胞周期分析结果取生长良好的三代细胞,采用流式细胞仪直接荧光法,检测细胞周期,记录阳性细胞百分率,见图2。由图可见,75.27%的细胞处于G0-G1期,表明M S C s具有强大的分化增殖能力。2.4骨髓M S C s表面抗原的表达流式细胞仪检测显示P3代小鼠骨髓M S C s强表达C D44,表达率为88.71%,基本不表达造血细胞表面标志C D34。(见图3。3讨论骨髓M S C s是具有多向分化潜能和高度自我更新能力的组织干细胞。研究证实骨髓M S C s不仅可以分化为与其组织来源一致的细胞,而且具有跨系或跨胚层分化为不同组织来源细胞的潜能。但骨髓中M S C

19、s的数量极少,仅占0.001%-0.01%1,要利用M S C s就必须对其进行体外分离、扩增。现体外分离得到均一的骨髓M S C s的方法逐渐21C h i nJL a bD i a g n,J a n u a r y,2012,V o l16,N o.1 图1M S C s生长曲线图2M S C s细胞周期图3M S C s表面抗原的表达A:C D34,B:C D44成熟,而通过体外扩增获得足够数量的间充质干细胞己实现。分离骨髓M S C s的方法主要有四种:贴壁筛选法2、密度梯度离心法3、免疫磁珠分离法4、流式分选法5等。后两种方法是目前获得M S C s纯度最高的方法,然而该方法操作复

20、杂、费用及设备要求较高。在分离中对细胞活性有一定影响。我们使用密度梯度离心和贴壁筛选相结合,利用P e r c o l l(1.073g/m l分离液将大部分造血细胞与单个核细胞分离开来,并经过体外贴壁培养一段时间,通过换液去除悬浮生长的造血细胞,获得较理想的骨髓M S C s。我们用生长曲线来描述骨髓M S C s的生长繁殖能力,骨髓M S C s生长曲线分潜伏适应期、对数生长期和平台期。发现昆明小鼠P1、P2、P3代骨髓M S C s的生长曲线均呈S型。骨髓M S C s的生长性状稳定,P1、P2、P3代细胞的形态、生长曲线无明显差别,潜伏适应期1-2d,对数生长期2-3d,传代周期约6-

21、7d。M S C s具有无限增殖的能力,但前提是必须具备M S C s体外生长的最佳环境。目前公认M S C s的培养必须用F B S做支持6,合适的血清浓度对细胞的生长具有关键性的作用。血清中含有多种营养成分,对细胞的生长起着重要作用,但培养基中血清的浓度并非越高越好。张怡等7实验证实,血清浓度<10%不利于细胞生长;10%-15%时,细胞增殖旺盛,形态均一;当血清浓度>15%时,易引起骨髓M S C s分化而影响增殖。本实验采用15%F B S的D M E M-L G培养基培养骨髓M S C s,细胞增值速度快,表形均一,得到了理想的传代细胞。M S C s的表型不均一,分别具

22、有间充质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点。所以过去一直没有发现M S C s特异性的表面标志物。一般认为,M S C s对S H2、S H3、C D29、C D44、C D77、C D90、C D106、C D120a、C D124等都呈阳性反应,对C D1a、C D31、C D34、C D14、C D45、C D56等成阴性反应8,9。大多数实验室通过M S C s不表达C D14、C D34及C D45,而表达C D44、C D90、C D106等标志,对M S C s进行初步鉴定。目前尚未发现M S C s特异性标记分子,可联合应用多种抗体帮助分离鉴定M S C s。本实验中利用密度梯度离

23、心法结合M S C s贴壁生长的特性,从成年昆明小鼠骨髓中分离、扩增培养获得形态均一的细胞集落。流式细胞仪检测结果提示75.27%的细胞处于G0-G1期,表明M S C s具有强大的分化增殖能力。分离培养的骨髓M S C s强表达C D44,而造血谱系标记C D34基本不表达,说明所分离的细胞是有别于骨髓H S C s的M S C s,培养的P3代细胞均一性较好。参考文献:1P h i n n e yD G,K o p e nG,I s a a c s o nR L,e ta l.P l a s t i ca d h e r e n ts t r o-m a lc e l l sf r o m

24、t h eb o n em a r r o wo fc o m m o n l yu s e ds t r a i n so fi n-b r e dm ic e:v a r i a t i o n si ny i e l d,g r o w t h,a n dd i f fe r e n t i o nJ.JC e l lB i o c h e m,1999,72(4:570.2F r i e d e n s t e i nA J,C h a i l a k h y a nR K,G e r a s i m o vU V.B o n em a r r o wo s t e o g e n i

25、 cs t e mc e l l s:i nV i t r oc u l t i v a t i o na n dt r a n s p l a n t a t i o ni nd i f f u s i o nc h a m be r sJ.C e l lT i s s u eK i n e t,1987,20(3:263.3张本斯,王凡,邓力,等.大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与初步鉴定J.中国组织化学与细胞化学杂志,2003,12:161. 4E n c i n aN R,B i l l o t t eWG,H o f m a n nM C.I m m u n o m a g n e t i ci s o l a-t i o no fo s t e o p r o g e n i t o r sf r o mh u m a nb o n em a r r o ws t r o m aJ.L a bI n v e s t,1999,79(4:449