第二章核酸化学3

1、一、性状和溶解度一、性状和溶解度1.DNA为白色纤维状固体，为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，均微为白色粉末，均微溶于水，不溶于有机溶剂。溶于水，不溶于有机溶剂。2.DNA溶液的粘度极高，而溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。溶液要小得多。3.RNA能在室温条件下被稀碱水解而能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定对碱稳定。n核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），具有两性性质。（氨基），具有两性性质。n由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的

2、等电点比较低。如（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为的等电点为44.5，RNA的等电点为的等电点为22.5。nRNA的等电点比的等电点比DNA低的原因，是低的原因，是RNA分子中核糖基分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有没有这种作用。这种作用。二核酸的两性性质及等电点二核酸的两性性质及等电点n由于嘌呤碱和嘧啶碱具有由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系（单双键交共轭双键体系（单双键交替）；替）；n一般在一般在260nm左右有最大左右有最大吸收峰，吸收峰，n可以作为核酸及其组份定可以作为核酸及其组份定性和定量测定

3、的依据。性和定量测定的依据。三、核酸的紫外吸收1. DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50 g/ml双链双链DNA40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0OD260的应用的应用 四、核酸的变性、复性、分子杂交四、核酸的变性、复性、分子杂交1、核酸的变性、核酸的变性(denaturation) 指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。变成

4、单链结构的过程。核酸的变性不涉及磷酸二酯键的断裂；一级结构核酸的变性不涉及磷酸二酯键的断裂；一级结构(碱基顺序碱基顺序)保持不变。保持不变。变性的因素：变性的因素： 高温，强酸强碱，有机溶剂，射线等高温，强酸强碱，有机溶剂，射线等DNA的变性的变性(denaturation)方法：方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：变性后其它理化性质变化：紫外吸收增加（增色效应）：紫外吸收增加（增色效应）：沉降速率增高；沉降速率增高； 粘度降低；粘度降低； 生物功能减少或丧失生

5、物功能减少或丧失。DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂DNA变性变性增色效应：增色效应：（hyperochromic effect）：）：DNA变性后，变性后，在在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。 。n当当DNADNA的稀盐溶液加热到的稀盐溶液加热到80-10080-100时，双螺旋结构时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。 80 90 100 100%50%OD260（254） Tm 变性温度范围变性温度范围熔点温度（熔点温度（meltin

6、g temperature,Tmmelting temperature,Tm）：）：DNADNA热变性过热变性过程中，使其对程中，使其对260nm260nm紫外光的吸收度突然增加，紫外吸紫外光的吸收度突然增加，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为熔点温度（收达到最大值的一半时溶液的温度称为熔点温度（TmTm）或解链温度、变性温度。或解链温度、变性温度。 实验室常用的方法实验室常用的方法热变性热变性n一般一般DNADNA的的T Tm m值在值在70-70-8585 C C之间。之间。nDNADNA的的T Tm m值与分子中的值与分子中的G G和和C C的含量有关。的含量有关。nG G和和C

7、C的含量高，的含量高，T Tm m值值高。因而测定高。因而测定TmTm值，值，可反映可反映DNADNA分子中分子中G, G, C C含量含量。 （G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 Tm=69.30.41(G+C) %影响影响Tm值的因素值的因素(1)溶液的性质溶液的性质(2)DNA中的中的G-C含量含量大肠杆菌大肠杆菌DNADNA在不同浓度在不同浓度KClKCl溶液下的溶液下的熔点温度曲线熔点温度曲线(3) DNA均一性均一性 均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围将热变性后的将热变性后的DNA溶液缓慢冷却，在低于变性温度约溶液缓慢冷却，在低于变性

8、温度约2530的条件下保温一段时间的条件下保温一段时间（退火），（退火），则变性的两条单链则变性的两条单链DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。质。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火退火(annealing) 。在适当条件下（退火）在适当条件下（退火） ，变性，变性DNA的两条互补链可恢复天的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。然的双螺旋构象，这一现象称为复性。2 2、 核酸的复性（核酸的复性（renaturation)renaturation)一系列

9、性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。的恢复。DNA复性主要受三种因素的制约：复性主要受三种因素的制约：1)将热变性的将热变性的DNA骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。不可能复性。 但是将变性的但是将变性的DNA缓慢冷却时（比缓慢冷却时（比Tm低低25 左右最左右最佳），可以复性。佳），可以复性。2）DNA浓度较高时，两条互补链彼此相碰的机会增加，浓度较高时，两条互补链彼此相碰的机会增加，易于复性。重复片段越多，复性越快。易于复性。重复片段越多，复性越快。3）DNA片段的大小：片段的大小：DNA片段越大，复性越

10、慢片段越大，复性越慢DNA复性复性n复性速度可用Cot1/2来衡量。nCo为变性DNA复性时的初始浓度，以molL-1，t为时间，以秒表示。 Cot1/2的单位是molL-1.SnCot1/2表示复性一半的Cot值，与速率成反比，Cot1/2增大意味着反应速度变慢。 3、 核酸的杂交核酸的杂交热变性的热变性的DNA单链，在复性时可与同源单链，在复性时可与同源DNA互补链互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列互补序列的异的异源源DNA单链形成双螺旋结构。单链形成双螺旋结构。两条来源不同的单链核酸（两条来源不同的单链核酸（DNA或或RNA），只要

11、它），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，即核酸的分子杂交。成新的杂种双螺旋，即核酸的分子杂交。DNA-DNA杂交；杂交；DNA-RNA杂交。杂交。不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源序列。称为同源序列。核核酸酸的的杂杂交交DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用: :研究基因的位置研究基因的位置确定两种核酸序列的相似性确定两种核酸序列的相似性检测样品中的特

12、异序列检测样品中的特异序列基因芯片技术的基础基因芯片技术的基础 核酸探针（核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一能特异性的探测带某一特定序列的特定序列的DNA或或RNA分子的标记核酸分子。分子的标记核酸分子。Southern blotting(印迹）印迹） 将待检测的将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标

13、记物标记的记物标记的DNA或或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态及其含量，了解基因的状态, 如如是否有点突变、扩增重排等。是否有点突变、扩增重排等。 Northern blotting原理：原理： 在变性条件下将待检的在变性条件下将

14、待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。膜和用探针进行杂交检测。用途：用途： 检测样品中是否含有基因的转录产物（检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。及其含量。 在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称非常有用的技术称探针技术探针技术(Probe)(Probe)。 探针技术在探针技术在遗传性疾病诊断遗传性疾病诊断上已开始应用。上已开始应用。 例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的

15、病人例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中提取白细胞中提取DNADNA，这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但，这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但可以对有症状患者进行确诊，还可以发现一些没有症状的隐性可以对有症状患者进行确诊，还可以发现一些没有症状的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量DNADNA后，再用探后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。 杂交和探针技术是许多分子生物学技术的基础，在生杂交和探针技术是许多分子生物学技术的基础，在生物学和医学的研究

16、中，以及临床诊断中得到了日益广泛物学和医学的研究中，以及临床诊断中得到了日益广泛的应用。的应用。Weston blotting4、沉降、沉降核酸与蛋白质及其他杂质各有不同的沉降核酸与蛋白质及其他杂质各有不同的沉降系数，在超离心机的强大引力场中，它们系数，在超离心机的强大引力场中，它们的沉降速率差异很大。的沉降速率差异很大。超离心法可以使核酸与其他杂质分开；也超离心法可以使核酸与其他杂质分开；也可使不同类型的核酸分开。可使不同类型的核酸分开。5、核酸的水解、核酸的水解n（1）酸或碱水解）酸或碱水解 n核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切

17、断。nDNA和和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。对酸或碱的耐受程度有很大差别。n在在0.1 mol/L NaOH中，中，RNA几乎可以完全水解，生成几乎可以完全水解，生成2-或或3-磷酸核苷；磷酸核苷；nDNA在同样条件下则不受影响。在同样条件下则不受影响。n这种水解性能上的差别，与这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上核糖基上2-OH的邻基的邻基参与作用有很大的关系。在参与作用有很大的关系。在RNA水解时，水解时，2-OH首先进首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。在碱的作用形成水解产物。2）、酶水解

18、）、酶水解n凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶。凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶。 n 从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶；从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶；n从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶。从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶。 n 能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）称为限制性核酸内切酶（限制酶） （restriction nuclease ）。）。n以以DNA为底物的为底物的DNA水解酶（水解酶（DNases）和以）和以RNA为底物的为底物的

19、RNA水解酶（水解酶（RNases）。）。五、核酸的分离纯化、测定及研究方法（一）分离核酸的一般原则（一）分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。是保证核酸结构与功能研究的基础。 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。 1、核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：、核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：2、核酸的纯度要求、核酸的纯度要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓

20、度的金属离子；剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取排除其它核酸分子的污染，如提取DNADNA分子时，分子时，应去除应去除RNARNA，反之亦然。，反之亦然。3、核酸分离纯化的注意事项、核酸分离纯化的注意事项 为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；坏； 减少化学物质对核酸的降

21、解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在键的破坏，操作多在pH410条件下进行；条件下进行； 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑或柠檬酸盐等基本上可以抑制制DNA酶的活性。而酶的活性。而RNA酶不但

22、分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素；提取过程中的主要危害因素； 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。次是高温。 二、核酸分离纯化的一般步骤二、核酸分离纯化的一般步骤 破碎细胞破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀沉淀核酸核酸去除盐类、有机溶剂等杂质去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干燥纯化干燥溶解溶解 核酸提取方案，应根据具体生物材料

23、和待提取核酸分核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。 三、核酸的测定方法三、核酸的测定方法1、紫外吸收法、紫外吸收法2、 定糖法定糖法3、 定磷法定磷法四、核酸序列测定四、核酸序列测定 DNA的一级结构的测定方法的一级结构的测定方法1.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法(酶法测序）酶法测序） DNA的合成总是从的合成总是从5端向端向3端进行的。端进行的。DNA的合成需要模的合成需要模板以及相应的引物链。板以及相应的引物链。DNA的合