联合检测NF-KBP50、NF-KBP65在甲状腺癌中的表达及意义修改版

1、.NF-kBP50、NF-kBP65在甲状腺癌中的表达及意义 摘要: 目的 探讨NF-KBp50、NF-kBp65蛋白在甲状腺癌、甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿、正常甲状腺组织中的表达及二者与甲状腺癌的浸润、转移的关系。方法 采用免疫组织化学染色法检测NF-kB p50和NF-kB p65蛋白在甲状腺癌组(60例乳头状癌、20例滤泡癌和20例髓样癌)及对照组(30例健康者)的甲状腺组织的表达；并检测30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织和30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织中NF-kB p50和NF-kB p65蛋白的表达及相关性。 结果 NF-kB p50蛋白在100例甲状腺癌组织的阳性率

2、为73.00%，呈高表达现象，在30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织和30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织的阳性率分别为30.00%和33.33%，呈低表达现象。而在30例健康者的甲状腺组织的阳性率为6.67%，呈极低表达现象。经X2检验，得出NF-kB p50蛋白在甲状腺非癌组织明显低于癌组织，且差异具有统计学意义( P<0.05)。NF-kB p65蛋白在100例甲状腺癌组织的阳性率为74.00%，同样呈高表达现象，在30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织和30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织的阳性率分别为36.67%和40.00%，表达率相对较低。而在30例健康者的甲

3、状腺组织的阳性率为10.00%，同样为极低表达现象。经X2检验，得出NF-kB p65蛋白在甲状腺非癌组织明显低于癌组织，且差异具有统计学意义( P<0.05)。NF-kB p50蛋白在肿瘤直径1.0 cm组和肿瘤直径1.0 cm组阳性率分别为79.41%和56.25%，差异均具有统计学意义(P0.05)，NF-kB p65蛋白在肿瘤直径1.0 cm组和肿瘤直径1.0 cm组阳性率分别为94.12%和81.25%，差异均具有统计学意义(P0.05)，NF-kB p50蛋白和NF-kB p65蛋白在淋巴结转移组的阳性率分别为85.19%和87.04%，在无淋巴结转移组的阳性率分别为56.5

4、2%和69.57%，经X2检验其差异均具有统计学意义(P0.05)，经X2检验和Spearman等级相关分析，NF-kB p50蛋白和NF-kBp65蛋白的表达呈正相关关系(X2=15.128，r=0.712，P0.05)。结论 NF-kB p50蛋白和NF-kBp65蛋白参与着甲状腺癌的表达，并于甲状腺癌的发生、发展过程中发挥着重要的协同作用。关键词：甲状腺癌；NF-kBP50、NF-kBP65；免疫组化Combined detection expression and significance of NF-kBP50 and NF-kBP65 in thyroid cancer Abstr

5、act: Objective Discussion NF-KBp50, NF-kBp65 protein in thyroid cancer, thyroid adenoma, nodular goiter and normal thyroid tissues and their correlation with thyroid cancer invasion and metastasis. Methods Immunohistochemical staining was used to detect the expression of p50 NF-kB and NF-kB p65 prot

6、ein and correlation in the experimental group of 60 cases of papillary carcinoma, 20 cases of follicular carcinoma，20 cases of medullary carcinoma，30 cases of healthy thyroid tissue as control group, 30 cases of thyroid adenoma thyroid adenoma，30 cases of nodular goiter patients with nodular goiter.

7、 Results NF-kB p50 protein in 100 cases of thyroid cancer positive rate 73.00%, showing high expression of the phenomenon, nodular goiter 30 cases of thyroid adenoma patients with thyroid adenoma and 30 cases of nodular goiter patients in the positive rate of tissue and 33.33% 30.00% respectively, s

8、howed low expression of the phenomenon. In 30 cases of healthy thyroid tissue positive rate 6.67%, showing a very low expression of the phenomenon. By X2 test, draw NF-kB p50 protein in thyroid cancer tissues was significantly lower than non-cancerous tissue, and the difference was statistically sig

9、nificant (P <0.05). NF-kB p65 protein in 100 cases of thyroid cancer positive rate 74.00%, the same phenomenon was highly expressed in 30 cases of nodular goiter patients with nodular goiter and 30 cases of thyroid adenoma thyroid gland the positive rate of tumor tissue was 36.67% and 40.00%, res

10、pectively, expression rate is relatively low. In 30 cases of healthy thyroid tissue positive rate 10.00%, the same as the phenomenon of very low expression. By X2 test, draw NF-kB p65 protein in thyroid cancer tissues was significantly lower than non-cancerous tissue, and the difference was statisti

11、cally significant (P <0.05). NF-kB p50 protein in tumor diameter 1.0 cm group and tumor diameter <1.0 cm positive rate set at 79.41% and 56.25% respectively, the differences were statistically significant (P <0.05), NF-kB p65 protein in tumor diameter 1.0 cm group and tumor diameter <1.0

12、 cm group, the positive rate was 94.12% and 81.25% respectively, the differences were statistically significant (P <0.05), the positive rate of NF-kB p50 protein and NF-kB p65 protein in lymph node metastasis group respectively, 85.19% and 87.04%, the positive rate in the group without lymph node

13、 metastasis was 56.52% and 69.57%, respectively, through the X2 test the differences were statistically significant (P <0.05), by the X2 test and Spreaman analyse, NF-kB p50 protein and protein expression of NF-kBp65 positive correlation (X2=15.128，r=0.712, P <0.05). Conclusions NF-kB p50 prot

14、ein and NF-kBp65 protein involved in the expression of thyroid cancer, and plays an important synergies in the development and progression of thyroid cancer. Key words: Thyroid cancer; NF-kBP50, NF-kBP65; immunohistochemistry甲状腺癌是内分泌系统最为常见的恶性肿瘤，也是近年来普外科中的常见病，发病率呈逐年增高的趋势1-2。甲状腺癌的病理类型有4种，分别为乳头状癌(papil

15、lary thyroid carcinoma, PTC)、滤泡癌(follicular thyroid carcinoma，FTC)、未分化型癌(undifferentiated thyroid carcinoma，UTC)和髓样癌(medullary thyroid carcinoma, MTC)，且甲状腺癌以乳头状癌在临床上较为多见3-4。目前对于甲状腺的诊断方式较多，但是由于其形态不典型等原因而存在一定的误诊或漏诊，因此应用分子生物学辅助诊断技术可以为其诊断和评估提供可靠的依据。NF-kB为一种蛋白因子，有研究表明5-6，NF-kB可通过持续活化而促进肿瘤细胞的增殖，降低其凋亡速度，上调

16、血管内皮生长因子而促进血管新生，诱导基质金属蛋白酶的表达，并提高肿瘤细胞的浸润和转移能力，因此NF-kB参与了肿瘤的发生、发展等多个环节。NF-kB p50、NF-kB p65参与了多种癌细胞的表达，且发挥着重要作用。故本实验联合检测NF-kBP50、NF-kBP65在甲状腺癌中的表达，为甲状腺癌的治疗提供新的思路。1 材料与方法1.1 研究对象选择2010年2月到2014年2月来我院甲状腺外科进行手术切除的甲状腺组织的新鲜标本190例，其中实验组甲状腺癌标本100例，包括60例乳头状癌、20例滤泡癌和20例髓样癌，另取30例健康者的甲状腺组织，30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织和30例结节

17、性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织。纳入标准：全部甲状腺患者均经确诊，无其他严重的脏器类疾病，且所有患者手术前3周内无任何放疗治疗。在100例甲状腺癌标本中，男35例，女65例，年龄为15-78岁，平均年龄为(45.3±15.0)岁，有淋巴结转移者54例，无淋巴结转移者46例，肿瘤直径1.0 cm者68例，肿瘤直径1.0 cm者32例。所有患者均在手术前签署我院医学伦理学研究会制定的患者知情书。1.2 主要仪器与试剂 电热手提式压力蒸汽灭菌器(上海隆拓仪器设备有限公司)，干燥箱(上海维菱科学仪器有限公司)，电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，电子分析天平(北京京科瑞达科技有限

18、公司)，Olympus BH-2显微镜(日本Olympus公司)，显微照相仪(日本Olympus公司)，超纯水系统(德国赛多利斯集团)；兔抗人NF-kB p50 克隆抗体(上海田源生物技术销售部),兔抗人NF-kB p65多克隆抗体(上海田源生物技术销售部),免疫组化染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，浓缩型DAB试剂盒(上海信誉科技有限公司)，其余试剂均购自天津化学试剂三厂。1.3 免疫组化染色将本次实验使用的所有标本组织离体后进行固定，乙醇梯度脱水并以石蜡包埋，冷冻后切成4 m的组织切片，加热切片2 h后放入4的冰箱中保存。取出切片进行苏木精-伊红染色后严格按照免疫组织化学SP染色法的操

19、作步骤进行免疫组织化学染色，以测的NF-kB p50，NF-kB p65蛋白在甲状腺癌及非癌组织中的表达。对照组为NF-kB p50、NF-kB p65阳性表达的乳腺癌切片，且染色结果均为阳性，以含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性空白对照，且其染色结果均为阴性。1.4 观察指标NF-kB p50，NF-kB p65的蛋白质阳性信号主要表现在细胞质和细胞核中，多为棕黄色颗粒，参考相关文献7-9确定本次实验的免疫组织化学染色的结果判断标准，显微镜下以400×观察，对于着色细胞数评定：每观察100个细胞中，着色细胞5个，为0分；着色细胞为5-25个，为1分；着色

20、细胞26-50个，为2分；着色细胞50个，为3分。对于细胞质或细胞核的评定：无色或稍微着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色或深黄色为2分，棕褐色或褐色为3分。将着色细胞数的评分与细胞质(核)的评分的乘积定为每组染色的综合评分，0-1分为阴性，2-3分为弱阳性，4-6分为阳性，6分为强阳性。1.5 数据统计学处理 釆用SPSS17.0统计软件对本次实验数据进行分析,样本阳性率间的比较采用X2检验,各因素间的相关性分析应用Spearman等级相关分析。以P0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 NF-kB p50、NF-kB p65蛋白的表达NF-kB p50蛋白在100例甲状腺癌组织的阳性率为

21、73.00%，呈高表达现象，在30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织和30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织的阳性率分别为30.00%和33.33%，呈低表达现象。而在30例健康者的甲状腺组织的阳性率为6.67%，呈极低表达现象。经X2检验，得出NF-kB p50蛋白在甲状腺非癌组织明显低于癌组织，且差异具有统计学意义( P<0.05)。NF-kB p65蛋白在100例甲状腺癌组织的阳性率为74.00%，同样呈高表达现象，在30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织和30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织的阳性率分别为36.67%和40.00%，表达率相对较低。而在30例健康者的甲状

22、腺组织的阳性率为10.00%，同样为极低表达现象。经X2检验，得出NF-kB p65蛋白在甲状腺非癌组织明显低于癌组织，且差异具有统计学意义( P<0.05)。结果见表1，表2。表1 NF-kB p50蛋白在四种组织中的表达情况Table 1 In the case of the four tissues NF-kB p50 protein组织类型例数NF-kB p50蛋白阳性率(%)X2P阴性弱阳性阳性强阳性甲状腺癌1002726252273.0035.1320.001正常组织30282006.67甲状腺肿302053233.33腺瘤302154030.00表2 NF-kB p65蛋白

23、在四种组织中的表达情况Table 2 In the case of the four tissues NF-kB p65 protein组织类型例数NF-kB p65蛋白阳性率(%)X2P阴性弱阳性阳性强阳性甲状腺癌1002627242374.0039.2640.001正常组织302730010.00甲状腺肿301974036.67腺瘤301875040.002.2 NF-kB p50、NF-kB p65蛋白在不同甲状腺癌病理参数中的表达 以患者肿瘤直径的长度和淋巴结转移与否进行分组，比较 NF-kB p50、NF-kB p65蛋白表达在各组的阳性率表达情况，经X2检验，NF-kB p50蛋白

24、在肿瘤直径1.0 cm组和肿瘤直径1.0 cm组阳性率分别为79.41%和56.25%，差异均具有统计学意义(P0.05)，NF-kB p65蛋白在肿瘤直径1.0 cm组和肿瘤直径1.0 cm组阳性率分别为94.12%和81.25%，差异均具有统计学意义(P0.05)。NF-kB p50蛋白和NF-kB p65蛋白在淋巴结转移组的阳性率分别为85.19%和87.04%，在无淋巴结转移组的阳性率分别为56.52%和69.57%，经X2检验其差异均具有统计学意义(P0.05)。结果见表3，表4。表3 NF-kB p50蛋白在不同甲状腺癌病理参数中的表达Table 3 NF-kB p50 expre

25、ssion of proteins in different pathological parameters of thyroid cancer临床病例特征例数NF-kB p50蛋白X2P阳性阴性阳性率(%)肿瘤直径8.0870.031.0 cm68541479.411.0 cm32181456.25淋巴结转移9.2860.02有5446885.19无46262056.52表4 NF-kB p65蛋白在不同甲状腺癌病理参数中的表达Table 4 NF-kB p65 expression of proteins in different pathological parameters of th

26、yroid cancer临床病例特征例数NF-kB p65蛋白X2P阳性阴性阳性率肿瘤直径4.5450.0311.0 cm6864494.121.0 cm3226681.25淋巴结转移5.2620.029有5447787.04无46321469.572.3 NF-kB p50、NF-kB p65蛋白表达的相关性 在甲状腺癌的阳性率表达中，NF-kB p50蛋白阳性表达有73例，NF-kB p65蛋白阳性表达有74例，二者在甲状腺癌的阳性表达中的符合率为95.65%(73/74)；NF-kB p50蛋白阴性表达有27例，NF-kB p65蛋白阳性表达有26例，二者在甲状腺癌的阴性表达中的符合率为

27、92.30%(26/27)；经X2检验和Spreaman等级分析，NF-kB p50蛋白和NF-kBp65蛋白的表达呈正相关关系(X2=15.128，r=0.712，P0.05)。3 讨论NF-kB是一种存在于真核细胞中的重要的核转录因子，它不仅参与着DNA的转录和启动，还与免疫炎症反应密切相关，是人体正常生命活动中的必要因子。研究表明10-12，NF-kB与人体的恶性肿瘤如食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等多种癌症密切相关。NF-kB不仅可以促进肿瘤细胞的增殖与分化，还在肿瘤血管的生成中起到促进作用。在人体内，p50和p65是NF-kB家族中最为重要的两个因子，且二者多以二聚体的形式存在与激活后的

28、细胞质或细胞核中，当机体免疫应答异常时，NF-kB不能及时恢复到原有的状态而停留在细胞核中，从而改变了机体的正常应答信号而致使细胞癌变的产生。 在本次实验中，我们采用免疫组化法检测了NF-kB p50蛋白在100例甲状腺癌组织、30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织、30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织和30例健康者的甲状腺组织中的阳性率表达情况，结果显示NF-kB p50蛋白的阳性率分别为73.00%、30.00%、33.33%和6.67%，经X2检验，NF-kB p50蛋白在甲状腺非癌组织的表达率明显低于癌组织，且差异具有统计学意义( P<0.05)。这与其他学者11-14在肝

29、癌、胃癌和腺癌中的检测结果类似，这就提示着NF-kB p50蛋白的高表达与甲状腺癌密切相关。分析其作用机制可能为NF-kB控制着凋亡细胞因子的表达，从而诱导其相关因子的生成抑制凋亡，此外，NF-KB也与TNF-存在着正反馈调节的关系，故其可以致使细胞调节失控从而诱发癌变。同法检测了NF-kB p65蛋白在100例甲状腺癌组织、30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织、30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织和30例健康者的甲状腺组织中的阳性率分别为74.00%、36.67%、40.00%和10.00%，经X2检验，得出NF-kB p65蛋白在甲状腺非癌组织明显低于癌组织，且差异具有统计学意义(

30、 P<0.05)。本次实验结果与Sasaki N15等在40例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织切片中的检测结果相一致，提示着NF-kB p65蛋白高表达对甲状腺良恶性病变的鉴别与检测存在着一定临床意义，但需要进行大样本的研究与分析。 在甲状腺癌的表达中，NF-kB p50蛋白和NF-kB p65蛋白在阳性表达中的符合率为95.65%(73/74)，在的阴性表达中的符合率为92.30%(26/27)，经X2检验，NF-kB p50蛋白和NF-kBp65蛋白的表达呈正相关关系X2=15.128，(r=0.712，P0.05)。这就提示两种蛋白之间的协同关系同甲状腺癌症细胞的浸润和转移存在着密切关系

31、。在本次研究的前提下，我们可以再通过进行Kaplan-Meier生存曲线，来分析这两种蛋白与甲状腺癌的预后之间的关系，为后续研究NF-kB p50蛋白和NF-kB p65蛋白在甲状腺癌预后的风险评估奠定基础并提供重要的参考数据。参考文献1 Guerriero J L, Ditsworth D, Catanzaro J M, et al. DNA alkylating therapy induces tumorregression through an HMGB1 -mediated activation of innate immunity J. J Immunol,2011, 186(6):

32、 3517-3526.2Haymart M R, Baneijee M, Stewart A K, et al. Use of radioactive iodine for thyroid cancer J. JAMA, 2011, 306(7): 721-728.3Han J S,Kim H A, Lee S, et al. VEGF receptor binding peptide-linked high mobility box group-1 box A as a targeting gene carrier for hypoxic endothelial cells J. J Cel

33、l Biochem, 2010,110(5): 1094-1100.4Vande Walle L, Kanneganti T D, Lamkanfi M, HMGBl release by inflammasomes J.Virulence, 2011,2(2): 162-165.5Gong H, Zuliani P, Komuravelli A, et al. Analysis and verification of the HMGBl signalingpathway J. BMCBioinformatics, 2010,11(7): 10-11.6 Yoshizaki A, Komura

34、 K, Iwata Y, et al. Clinical significance of serum HMGB-1 and sRAGE levels in systemic sclerosis: association with disease seventy J. J Clin Immunol,2009,29(2):180-189.7 刘宏建. HMGB1和NF-kB p50、NF-kB p65在甲状腺癌中的表达及意义 D. 郑州: 郑州大学, 2013.8 辛礼辉. Kiss-1、NF-k Bp65. MMP-9、CD44v6和E-cadherin在胎盘部位滋养细胞肿瘤中表达及意义 D. 天津: 天津医科大学, 2012.9 彭颖琼, 胡 斌, 肖 伟,等. 肝细胞癌中NF-kB65,VGEF和MMP-9蛋白的表达及其相关性研究 J. 现代生物医学进展, 2010, 10(3): 443-44