诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、 鉴定和初步应用

1、诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、 鉴定和初步应用         11-01-30 14:55:00     作者：李潇    编辑：studa20【摘要】  目的: 建立能稳定分泌抗诺如病毒（Norovirus）N蛋白的单克隆抗体（mAb）细胞株, 制备抗诺如病毒核衣壳蛋白的mAb, 为诺如病毒的早期快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法: 用E.coli表达的G组广州株NVgz01（DQ369797）Norovi

2、rusN蛋白免疫BALB/c小鼠, 通过PEG使小鼠脾细胞和Sp2/0细胞融合, 使用HAT选择性培养基培养融合细胞, 用间接ELISA和Western blot测定mAb的效价、 免疫球蛋白亚型和mAb的特异性, 并将各mAb之间进行配对。结果: 通过细胞融合和克隆化, 共筛选出4株分泌抗NorovirusN蛋白抗体的杂交瘤细胞株N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。间接ELISA和Western blot检测结果表明, 这4株mAb都可以与E.coli表达的G组广州株NorovirusN蛋白产生特异性反应, 并且能与天然粪便标本中的G组Norovirus产生特异性反应。配对结果显示

3、N2C3和N7C2之间配对, 对表达蛋白和天然病毒都具有较强的检测灵敏度。结论: 获得了诺如病毒G组特异性mAb, 为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础。 【关键词】  Norovirus NVgz01 核衣壳蛋白 单克隆抗体诺如病毒作为流行性肠胃炎的主要病因之一, 无论在发展中国家还是发达国家, 从儿童到成年人都可以受到诺如病毒感染, 并可造成爆发流行, 成为影响人类健康的不可忽视的问题, 近年来逐渐引起了研究者的重视。美国CDC经过评估认为, 每年在美国发生的食源性疾病有2 300万宗是由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起的1; 在欧洲, 数据显示19952000年间, 有超过8

4、5的食源性病毒肠胃炎爆发案例由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起2。由于人类诺如病毒分为G和G两组3, 4, 根据北京5、 太原6和武汉7三地的血清学调查结果, 初步认为G组病毒为我国主要流行组。由于诺如病毒无法在体外感染细胞及动物模型来进行培养分离鉴定, 目前对诺如病毒的诊断方法主要是免疫电镜法（IEM）、 放射免疫法（RIA）、 ELISA法、 RealTimePCR法等8, 其中, 夹心ELISA方法, 即使用单克隆抗体(mAb)捕获患者粪便标本中的病毒抗原来进行检测的方法, 由于交叉反应性小, 特异性较强且敏感度较高, 成为目前研制诺如病毒检测试剂所主要采用的方法。本研究中我们以E.coli表达

5、的G组广州株NorovirusN蛋白作为免疫原, 免疫BALB/c小鼠并制备mAb, 为研制诺如病毒检测试剂盒奠定基础。1  材料和方法1.1  材料  诺如病毒粪便标本为使用DakoCytomation公司的IDEIA Norovirus 抗原检测试剂盒检测为阳性的标本。6周龄的雌性BALB/c小鼠, 购自中山大学实验动物中心。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系为本实验室保存。诺如病毒核衣壳蛋白表达重组质粒 pET28a（）NoroNP由本实验室制备及保存, 诺如病毒N蛋白基因的克隆、 表达和鉴定方法见文献报道9。PEGMW3350购自Sigma公司, HAT、

6、0; HT 和RPMI1640购自Gibco公司, 新生牛血清购自杭州四季青公司, 羊抗鼠IgG购自BOSTER公司。其他试剂均为国产分析纯。1.2  方法NoroNP重组表达载体表达诺如病毒G组广州株的全长衣壳蛋白, 收集产物经Ni2亲和层析柱纯化, 以此纯化后蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠, 每次免疫剂量为70 g/只, 免疫途径为腹腔免疫, 每间隔2周免疫1次, 累计免疫3次, 初次免疫使用弗氏完全佐剂, 后两次免疫使用弗氏不完全佐剂; 第3次免疫完成10 d后小鼠尾部取血检测免疫效果, 血清效价达到104后可脾内注射进行加强免疫, 3 d后取脾融合。2  结果2

7、.1  分泌抗诺如病毒衣壳蛋白mAb的杂交瘤细胞株的建立  用pET28a（）NoroNP重组表达载体表达诺如病毒G组广州株的全长衣壳蛋白免疫小鼠, 取小鼠血清测效价, 在满意滴度下将小鼠进行脾内加强免疫, 3 d后取脾细胞与Sp2/0细胞进行融合。10 d后用纯化的NVNP 5 mg/L包被酶标板, 杂交瘤细胞上清作为一抗, 羊抗鼠IgG作为二抗检测抗体, 并同时用pET28a（）载体表达的轮状病毒蛋白作为阴性对照, 以排除与大肠杆菌BL21细胞成分和pET28a（）载体成份反应的假阳性抗体。对抗体分泌能力强的培养孔用有限稀释法进行2次克隆化, 共筛选出4株能稳定分泌抗诺

8、如病毒核衣壳蛋白抗体的细胞株, 分别为N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。2.2  腹水效价的测定  收集腹水, 用间接ELISA方法测定, 结果N2C3和N7C2 2株抗体最强, 腹水稀释至10-6P/N值为0.4; N4B1株抗体较弱, 腹水稀释至10-4P/N值为0.5; N8A9株抗体最弱, 腹水稀释至10-3P/N值为0.3（阴性对照P/N值为0.08）。2.3  mAb免疫球蛋白亚类鉴定  用PIERCE公司试剂盒对mAbIg的类型和亚类进行特异性鉴定, 结果2株mAb鉴定为IgG2a（N2C3和 N4B1）, 2株mAb鉴定为Ig

9、M（N7C2和 N8A9）, 4株mAb轻链均为链。2.4  mAb特异性检测  4株mAb分别与表达重组蛋白和诺如粪便标本进行Western blot检测, 表达重组蛋白上由于带有表达载体上的T7和（His6）标签, 因而Mr比天然诺如病毒核衣壳蛋白（Mr为56×10358×103）多了3×103左右。Western blot结果见图1, mAb不仅可以同表达重组蛋白进行特异性反应, 并且可以同天然诺如病毒核衣壳蛋白进行特异性反应。其中N2C3和N7C2的反应性较强, N8A9和N4BI对粪便标本的反应性较弱。图1  mAb的Western blot分析（略）Fig 1  Western blot analysis of expression products in E.coli and native NV sto