姜黄素对Ⅱ型糖尿病神经病理性疼痛大鼠内质网应激蛋白BiP与p--eIF2α表达的影响

1、.温州医学院硕士学位论文姜黄素对型糖尿病神经病理性痛大鼠内质网应激蛋白 BiP与p-eIF2tt的影响 硕士研究生：吴艳导师：曹红中文摘要目的观察腹腔注射100mgkgd姜黄素对II型糖尿病神经病理性疼痛(DNP) 大鼠机械痛敏(MWT)、热痛敏(TWL)的影响及脊髓背角和背根神经节(DRG)中内质网应激(ERS)相关蛋白BiP和p-eIF20t表达的影响，探讨姜黄素影响其 表达机制。方法雄性SD大鼠90只，体重1601809，高脂高糖饲料喂养8周诱导胰岛 素抵抗后，继以单次小剂量链脲佐菌素(STZ)35mgkg腹腔注射，3d后血糖 167mmoll者入选为D组(81只)，在注射STZ前和14

2、d后采用Electronic Von Fery 触觉测痛仪和甩尾足底测试仪测大鼠MWT、TWL，且将D组随机分为3组 (n=27)：II型糖尿病神经病理性痛组(DNP组)：继续高脂高糖饲料喂养，不作任何处理；II型糖尿病神经病理性痛+姜黄素100mgkgd组(DCur组)： 高脂高糖饲料喂养，注射STZl4d后开始腹腔注射姜黄素100mgkgd，持续14d；型糖尿病神经病理性痛+溶剂对照组(DSC组)：高脂高糖饲料喂养，注射 STZl4d后开始腹腔注射玉米油4mlkg，持续14d；另取27只大鼠为正常对照组 (N组)，给予普通饲料喂养，不作任何处理。所有组别在给姜黄素3、7、14d 后测血糖、

3、MWT与TWL，并在同时间点取大鼠L46脊髓和DRG，各时间点均 9只。用免疫组织化学法测定BiP和PeIF2ct在大鼠脊髓背角和DRG的动态变化， 用Western blot法测定大鼠脊髓背角和DRG中BiP、p-eIF2ct蛋白表达情况。结果1大鼠体重、血糖、胰岛素浓度及胰岛素敏感指数的变化：与N组 比较，饲养8周后D组大鼠体重明显增高(N组41320士17009，D组4*;温州医学院硕士学位论文46108：1：29039)(P<O05)，血糖水平也较N组增高但未达到糖尿病诊断标准(N 组634士046 mmol1，D组653+036 mmol1)，空腹胰岛素浓度也明显升高(N 组3

4、93+0549ML，D组4。50-a：0。299ML)(氏005)，胰岛素敏感指数明显下降 (N组27+035，D组378+05 1)(P<005)：2痛阈的变化：注射STZ前各组MWT(N组40574-3379，D组4110士5039)、 TWL(N组12674-243s，D组12834-152s)基础值无差别；与N组相比，注射STZl4d后各组大鼠MWT降低、T、礼缩短(氏005)；与DNP组相比，给姜黄素7d后DCur组大鼠MWT升高、TWL延长，在给姜黄素14d后达到明显变化 (氏O05)；DSC组与DNP组比较，给姜黄素后各时间点MWT、TWL无明显 变化：3脊髓背角和DRG中

5、BiP表达：(1)免疫组化结果显示：N组大鼠脊髓背 角及DRG仅有少量BiP的阳性细胞表达；与N组相比，DNP组、DCur组、DSC组BiP、p-elF2a表达显著增多(氏005)；给姜黄素7d后，DCur组表达量开始降低，BiP的阳性细胞率脊髓背角与DRG分别为1500-&224、1416+197， 给姜黄素14d后，DCur组BiP的表达与DNP组相比差异有统计学意义(尸<005)； 各时间点DSC组的表达与DNP组相比无差别。(2)免疫印迹法显示：N组大鼠 脊髓背角和DRG中都仅有少量BiP蛋白表达；DNP组、DCur组、DSC组脊髓 和DRG中BiP蛋白表达均较N组水平高

6、(火O05)；与DNP组相比，DCur组 在给姜黄素7d后表达开始降低(尸<O05)，并呈下降趋势；各时间点DSC组蛋 白表达与DNP组基本一致，两组差异无明显差异。4脊髓和DRG中p-elF2a表达：(1)免疫组化结果显示：N组大鼠脊髓背 角及DRG仅有少量p-elF2a的阳性细胞表达；与N组相比，DNP组、DCur组、 DSC组BiP、p-elF2a表达显著增多(P<O05)；给姜黄素7d后，DCur组表达量 开始降低，PelF2a的阳性细胞率脊髓背角与DRG分别为874+109、 796+055；给姜黄素1 4d后，DCur组p-elF2a的表达与DNP组相比差异有统 计学意

7、义(P<005)：各时间点DSC组的表达与DNP组相比无差别。(2)免疫 印迹法显示：N组大鼠脊髓背角和DRG中都仅有少量P。elF2a蛋白表达；DNP 组、DCur组、DSC组脊髓和DRG中p-elF2a蛋白表达均较N组水平高(P<005)；与DNP组相比，DCur组在给姜黄素7d后表达开始降低(P<O05)，给姜黄素温州医学院硕士学位论文14d后，DCur组p-elF2a蛋白表达继续下降，与DNP组(P<005)相比差异有 统计学意义；各时间点DSC组蛋白表达与DNP组基本一致，两组差异无明显差 异。结论II型糖尿病神经病理性疼痛大鼠较正常大鼠其痛阈明显降低，脊髓背

8、 角和DRG中ERS相关蛋白BiP、p-elF2a表达增加；腹腔注射姜黄素100mgkgd能有效缓解II型DNP诱发的机械痛敏和热痛敏，其机制可能与姜黄素抑制脊髓背角和DRG的BiP、p-eIF2a表达有关。 关健词糖尿病，神经病理性疼痛，内质网应激蛋白，内质网应激，大鼠The effects of curcumin on the expression of endoplasmic reticulum stress proteins BiP and p-elF2a in type II diabetic neuropathic pain ratsPostgraduate：Wu YanTutor

9、：Cao Hong【Abstract】Objective To investigate the effects of curcumin on mechanical withdrawal threshold(MWT)，thermal withdrawal latency(TWL)and the expressions of endoplasmic reticulum stressrelated proteinsBiP and p-eIF2a in spinal dorsal hom and dorsal root ganglion in type II diabetic neuropathic

10、pain rats·Methods 90 male SpragueDawley(SD)rats，weight 1 60-1 809，were fed on ahighfat and fructose diet for 8 weeks to induce insulin resistance，and then wereratinjected intraperitoneally with low dose of streptozotocin(STZ，35mgkg)once，theblood glucose1 67mm011 was selected as the group D，the

11、mechanical withdrawal 缸eshold(MWT)and thermal withdrawal latency(TWL)were evaluated before and at 14d after STZ injection，and 81 rats were divided into 3 groups(n227)：group DNP： t11ey were fed on highfat and fructose diet and dont make any processing；group DCur：high fat and sugar feed，type 2 diabeti

12、c neuropathic pain and intraperitonal injection of curcumin lOOmgkgd for 14d；group DSC：high fat and sugar feed，type II diabetic neuropathic pain and intraperitonal injection of com oil 4mlkg for 14d· Another 27 nomal SD rats were adopted as control group(group N)，and were fedwith nonnal forage

13、and dont make any processingMWT and TWL were measuredat3d7d1 4d afler curcumin injection，the lumbar segment 4-6 of the spinal cord andme L46 DRG were removed at the same timeThe changes of BiP、p-elF2ablotexpression were determined by immunohistochemical staining and westernResuits1Changes of weight，

14、blood glucose，insulin level and insulin sensitivity index：7温州医学院硕士学位论文Compared with group N，the weight of group D was significantly increased after raising 8 weeks(group N：41320士17OOg，group D：46108士29039)(P<005)，the concentration of serum glucose in group D was higher than group N，but not reach t

15、he diagnostic criteria of diabetes(group N：634士046 mmol1group D：653+036 mmol1)，the insulin concentration was also increased(group N：393士054pML， group D：450-士029pML)(P<005)and insulin sensitivity index was obviously declined(group N：-27士035，group D：-378+05 1)(P<005)2Change of the pain threshold

16、：There was no significant defference in MWT(group N：4057士3379，group D：4110-士5039)and TWL(group N：1267士243s， group D：1 283土152s)basic value among four group before and after injection STZ Compared with group N，MWT and TWL were significantly low after STZ given 1 4d in other groups(P<005)；Compared

17、with group DNP,the pain threshold in group DCur were higher at curcumin post-given 7d，and had significant increased at 1 4d after injection curcumin(P<005)；it was no difference between group DNP and group DSC in different time points after injection curcumin3Expressions of BiP in the dorsal horn

18、of spinal cord and DRG：there was no significant expression of BiP in group N(1)immunohistochemical results：In group DNP,DCur,DSC，the expression of BiP was markedly increased compared with group N(P<005)；with treatment of cureumin for 7d，the expression of BiP(spinal dorsal horn 1500士224，DRGl416士19

19、7)in group DCur began to drop，at 14d after injection curcumin，the level of BiP expression was significant lower than group DNP(P<005)；the expression of BiP had no differences between group DNP and group DSC(2)Western blot result：The level of BiP expression in group DNP,DCur, DSC were higher than

20、what the group N showed；compared with group DNP,the expression of BiP was reduced in group DCur at curcumin postgiven 7dp<005)，and moved on a downtrend to 1 4d，it indicated that there was some slight and subtle differences between group DNP and group DSC4Expressions of p-elF2a in the dorsal horn

21、of spinal cord and DRG：there wasno significant expression of p-eIF2a in group N(1)immunohistochemical results：Ingroup DNP,DCur,DSC，the expression of p-elF2a was markedly increased compared8温州医学院硕士学位论文with group N(P<O05)；with treatment of curcumin for 7d，the expression of p-elF20t(spinal dorsal ho

22、rn 874士109，DRG796士055)in group DCur began to drop，at 1 4d after iIljeCtion curcumin，the level of pelF2a expression was significant lower than group DNP(P<005)；the expression of p-elF2a had no differences between group DNP and group DSC(2)Westem blot result：The level of p-elF2ct expression in grou

23、p DNP,DCur,DSC were higher than what the group N showed； compared with group DNP,the expression of p-elF2a was reduced in group DCur at curcumin post-given 7d(p<005)，and moved on a downtrend to 1 4d，it indicated that there wad some slight and subtle differences between group DNP and group DSCConc

24、lusions Type II diabetic neuropathic pain rats showed that its pain threshold reduced significantly and its expressions of BiP and p-elF2a were increased compared with normal ratsCurcumin could markedly reduced the pain of type II diabetic neuropathic pain in rats，which mechanisms may relevant with

25、reducing the expressions of BiP and p-elF2a【Key words】type II diabetes mellitus，neuropathic pain，endoplasmic reticulumstress，BiP,p-eIF20t，rats9温州医学院硕士学位论文缩略词表3温州医学院硕士学位论文前言随着人民生活水平的迅速提高和人均寿命的延长，糖尿病的患病率逐年上 升，其中以II型糖尿病为主，占到90，并且常伴有全身肥胖或体脂分布异常。 II型糖尿病的发病机制主要包括胰岛B细胞分泌胰岛素不足和胰岛素抵抗二个 环节。高血糖、高血脂状态下和胰腺上胰岛淀粉样

26、物质的沉积，或是它们的联合 作用，使机体内环境的稳定性逐渐破坏，出现明显的糖尿病，甚至引起各种急慢 性并发症，导致机体功能障碍和衰竭，成为致残、致死的主要原因。在糖尿病所 有并发症中，糖尿病神经病理性疼痛(Diabetic Neuropathic Pain，DNP)是其最常见 的慢性并发症之一，其疼痛可表现为自发性痛，也可以表现为触诱发痛及痛觉超 敏【l】，还有多种临床症状，严重影响患者的生活质量，甚至导致足部溃疡或截肢。 II型糖尿病目前的治疗主要是用药物控制血糖，但是其神经病变导致的疼痛以及 其他症状和体征往往难以治疗，目前各大医院的药物治疗、介入治疗、脊髓刺激、 鞘内输注甚至脑深部刺激，

27、常常收效甚微，或根本无效。因此研究II型DNP发 生机制和探索有效的治疗方法已成为当前的艰巨任务，有着极其重要的医学价值 和社会意义。糖尿病状态下的高血糖激活神经细胞线粒体内膜使蛋白解耦联，促使线粒体 活性氧(ROS)不断生成，导致DNA损伤，随后激活核DNA修复酶聚ADP2核多聚酶(P6岫)，该酶的激活导致糖酵解限速酶一一磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)的活性显著抑制，GAPDH的上游代谢物迅速积聚，糖酵解支路转向糖代谢支路， 蛋白质糖基化终末产物(AGEs)形成增多【2】。NFrd3的激活因素包括高血糖、 ROS生成增多、氧化应激反应增强、AGEs等【3】，而活性状态下的NF迎可使凝 血组织因

28、子、内皮素、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)等基因的表达增加，导致血 管通透性改变、血流调节功能受损、神经内膜血流灌注减少，直接和间接促进细 胞包括神经细胞的损伤，神经病理性疼痛的发生与神经损伤密切相关。内质网位于细胞核附近的胞质区域，是细胞合成、加工蛋白质与贮存Ca2+ 的主要场所，也是蛋白质合成与翻译后修饰、多肽链正确折叠与装配的重要场所。 对应激极为敏感。多种因素如缺血、缺氧或氧化应激等各种原因使内质网腔内10温州医学院硕士学位论文Ca2+耗竭、内质网蛋白质糖基化抑制、二硫键错配、内质网蛋白质向高尔基体转 运减少等生理功能紊乱时，导致未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔内积蓄 等，细胞启动内

29、源性自我保护反应机制使内质网功能发生改变，统称为内质网应 激(endoplasmie reticulum stress，ERS)E4,52它有利于恢复细胞内环境的稳态和维 持细胞存活【6j。有研究显示：肥胖产生的同时也有细胞应激和炎症信号通路的激 活，并因此提出一系列学说，如炎症病因学说、氧化应激学说和炎症氧化应激、 炎症学说等，但尚不清楚引发细胞应激的起源_7'81。整体动物、细胞、分子水平 上的实验研究表明ERS是联系肥胖、胰岛素抵抗和型糖尿病的重要纽带拶J； Martenson等研究发现动物存在“应激致痛”现象【10】，但是ERS在II型糖尿病神经 病理性疼痛中的作用缺乏研究。姜

30、黄素(eurcumin)是姜科植物姜黄的提取物，它是一种酚性色素，是一种 天然的有效成份，其分子结构中包含两个邻甲基化的酚和一个p二酮功能基团， 这种结构特性使其具有多种生物活性。另外，它具有极低的毒性，历史悠久的药 用价值，广泛的药理作用如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、清除自由基等【11,12】。我们实 验室前期研究发现，姜黄素缓解I型糖尿病大鼠神经病理性疼痛与其降低大鼠脊髓背角和DRG细胞中p-JNK、PNFrd3、PCERB等的表达有关【13】。但姜黄素在 II型糖尿病神经病理性疼痛中的作用以及其与ERS的关系未见报道。因此本研究应用高脂高糖饲料喂养大鼠诱导产生胰岛素抵抗后，再辅助小剂 量链脲佐

31、菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射致使大鼠II型糖尿病的发生，观 察大鼠机械痛敏与热痛敏的变化，并在给予姜黄素后观察其对大鼠机械痛敏、热 痛敏和脊髓背角及DRG中内质网应激相关蛋白BiP和PelF20t表达的影响。探讨ERS在II型糖尿病神经病理性疼痛中的作用和姜黄素对机械痛敏、热痛敏及 BiP、PelF20t表达的影响，为ERS在II型糖尿病神经病理性疼痛中的发生发展 及将后姜黄素在临床上的应用提供实验基础和理论依据。温州医学院硕士学位论文材料与方法1实验材料11主要试剂和药品试剂或药品生产公司链脲佐菌素(0602010)美Sigma公司姜黄素(28260)美国Sigma公

32、司玉米油(C8267)美Sigma公司大鼠胰岛素ELISA试剂盒上海西塘公司兔抗BiP多克隆抗体(Ab53067)英国Abcam公司兔抗PeIF2a单克隆抗体英国Abeam公司 兔抗3-Tubulin多克隆抗体(SC。9104)美国Santa Cruz公司 HRP标记兔二抗(APl32P)美国Chemicon公司 超敏型抗兔二步法检测试剂盒(PV-9001)北京中杉金桥公司 O01M PBS磷酸盐缓冲液(ZLI9062)北京中杉金桥公司 001M柠檬酸缓冲液(ZLI一9064)北京中杉金桥公司DAB显色试剂盒(ZLI一9018)北京中杉金桥公司Harris苏木素液(ZLI一9039)北京中杉金

33、桥公司 彩色预染蛋白质分子量标准Marker(SM0617)美国Fermentas公司 BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012)碧云天生物技术研究所 PMSF(ST506)碧云天生物技术研究所RIPA裂解液(强)(P0013B)碧云天生物技术研究所 SDSPAGE蛋白上样缓冲液(5×)(P0015)碧云天生物技术研究所 十二烷基硫酸钠SDS(ST627)碧云天生物技术研究所TEMED四甲基乙二胺(ST728)碧云天生物技术研究所过硫酸铵(AP)(ST005)碧云天生物技术研究所甘氨酸(ST085)碧云天生物技术研究所Tris(ST765)碧云天生物技术研究所30Acr-Bis(29：1

34、)(ST003)碧云天生物技术研究所】2温州医学院硕士学位论文15M Tris-HCl,pH88(ST789)碧云天生物技术研究所1M Tris-HCl，pH68(ST768)碧云天生物技术研究所丽春红染色液(P0022)碧云天生物技术研究所Westem一抗稀释液(P0023A)碧云天生物技术研究所Westem封闭液 碧云天生物技术研究所 超敏ECL化学发光试剂盒(P0018) 碧云天生物技术研究所 水合氯醛(MWl654) 上海国药集团多聚甲醛(分析纯1408)上海凌峰化学有限公司12主要仪器和器械仪器或器械(型号)生产公司Electronic Von Fery触觉测痛仪(2390型)美国I

35、I TC公司甩尾足底测试仪(336型)美国II TC公司血糖分析仪及试纸美国强生公司制冰机(AFl00)意大利Scotsman公司超纯水装置(PS9000705)美国Labconco公司低温冰箱(Thermo Forma 700)美国热电公司精密pH计(PHS3C)上海雷磁仪器厂Leica病理切片机(RM3325)德国Leica公司 高速冷冻离心机(ALLEGRA64A)美国贝克曼公司 电热鼓风干燥箱上海福玛实验设备有限公司SSW型电热恒温水槽上海博迅实业有限公司酶标仪(ELx800)美国BIOTEK公司显微镜(CX4112L02)日本Olympus公司 显微荧光照相系统(Nikon E800

36、)日本Nikon公司 电子计时器日本日立公司型电子天平上海精密科学仪器公司超声破膜仪(VCl30PB)美国Sonics公司BioRad电泳转膜仪(Power pac)美国BioRad公司温州医学院硕士学位论文Eppendorf移液器德国Eppendorf公司旋转振荡器北京德天佑科技有限公司APED处理防脱片(ZLI9501)北京中杉金桥公司PVDF膜(D00010)美国Solarbio公司Alpha Innotech曝光机(702500)MicroChemi公司13试剂配制(1)4多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)-PFA409溶于500ml 001M的 PBS液中，持续加热

37、磁力搅拌至6065，使成乳白色悬液。用01molL的NaOH 液滴加搅拌，使液体呈清亮，再加入O01M的PBS液定容至1000ml，冷却、常 温保存备用。整个配制过程在通风厨中完成。(2)链脲佐菌素液：STZl00mg溶于10ml 001mmol1柠檬酸盐缓冲液中，现配现用。(3)姜黄素液：姜黄素用玉米油溶解配置成25mgml的溶液，避光于4保 存，使用前均震荡摇匀。(4)人工脑脊液：NaCl 126mM、KCl 3Mm、KH2P04 14Mm、NaHC03 26mM、葡萄糖4mM、MgS04 13raM、CaCl2 14 mM，高压灭菌备用。 (5)PMSF：001749溶于异丙醇配成10m

38、molL，一20。C保存。(6)10AP：AP019、ddH2010ml溶解后，4保存，保存时间为1周。 (7)10SDS：SDSIOg、ddH20100ml，50。C水浴下溶解，常温保存。 (8)10AP：AP019、ddH2010ml溶解后，4"C保存，保存时间为2周。 (9)8ml 10分离胶：30Acr-Bis 264ml、15M Tris(pH88)20ml、IOSDS80肛l、TEMED四甲基-胺32d、lOAP80pI、ddH2032ml，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。(10)4ml 5浓缩胶：30Acr-Bis 052ml、1M TrisHCI(pH68)10ml

39、、10SDS 40I_tl、TED四甲基乙二胺401xl、10AP20Ltl、ddH20 244ml，加入TEMED 混匀后即可即可灌胶。(11)电泳缓冲液(1×)：Tris(MWl2114)3039、甘氨酸(MW7507)18779、SDSlg、ddH20至1000ml。(12)转移缓冲液(1×)：Tris(MWl2114)589、甘氨酸(MW7507)299、14温州医学院硕士学位论文甲醇200ml，ddH20至1000ml。(13)IOxTBS缓冲液：NaCl 889、嘶s 1219、ddH20800ml溶解后，浓盐酸 调pH至75，ddH20定容至1000ml。(1

40、4)TBST缓冲液：IOOmlIO)(TBS缓冲液加lmlTween20，ddH20定容至1000ml。2实验方法21动物模型制备雄性SD大鼠90只，体重160-一1809，清洁级标准，由温州医学院动物实验 中心提供。动物喂以高脂高糖饲料(67普通饲料+10猪油十20蔗糖+2胆固 醇+1胆酸钠)并自由摄食、饮水，室温保持在200C250C，湿度5080， 12h12h白天黑夜循环照明。于实验开始即第0周、饲养第8周分别测体重、血 糖，并取血测血清胰岛素及评估胰岛素敏感性。饲养8周后大鼠禁食不禁饮12h后按35mgkg单次腹腔注射1STZ溶液。3d后测定大鼠尾静脉血糖，血糖稳 定且167mmol

41、l入选实验【14】，14d后测大鼠痛阈，降低到基础值的85以下入选为D组，其余剔除。22动物分组采用随机数字表法，将D组大鼠随机分为三组(n一27)：DNP组：II型糖 尿病神经病理性痛组，不作任何处理；(g)DCur组：II型糖尿病神经病理性痛+ 姜黄素lOOmgkgd组，在注射STZl4d后开始腹腔注射姜黄素lOOmgkgd，持续14天；)DSC组：II型糖尿病神经病理性痛+玉米油溶剂对照组，在注射STZl4d后开始腹腔注射姜黄素的溶剂玉米油4mlkgd，持续14天。另取27只 正常大鼠为对照组(N组)，给予普通饲料喂养，不作任何处理。 3胰岛素水平测定31取血清：大鼠禁食不禁饮12h，抽

42、取各组大鼠尾静脉血液标本测血糖，静置5min，40C、4000r，离心20min，取上清液，4保存备用。 32 ELISA法测胰岛素水平： (1)10x标本稀释液用ddH20作1：10倍稀释成l×备用。(2)标准品液配制：标准品使用前加入O5mlddH20混匀，配成40ngml溶液， 设8管标准管，第1管加1×标本稀释液900p1，第28管加1×标本稀释液各5001xl，温州医学院硕士学位论文在第1管中加入40ngml标准品溶液loopl混匀后用加样器吸出500d，移至第2 管，如此反复对倍稀释，从第7管吸出500tl弃去，第8管为空白对照。(3)稀释标本：血清标

43、本用1×标本稀释液作l：20倍稀释，即101d标本加l× 标本稀释液190pl混匀。(4)稀释洗涤液：洗涤液用ddH20作1：20倍稀释，即lml浓缩洗涤液加ddH2019ml混匀。(5)加样：每孔各加入标准品或稀释后的标本lOOpl，将反应板充分混匀后置 37。C水浴箱2h后，弃去孔内液体，用稀释后的洗涤液将反应板充分洗涤4-6次， 在滤纸上印干。(6)加第一抗体工作液：每孔加第一抗体工作液100“1，将反应板充分混匀后 置37"C水浴箱1h后，弃去孔内液体，用稀释后的洗涤液将反应板充分洗涤46 次，在滤纸上印干。(7)21：1酶标抗体工作液：每孔加酶标抗体工作

44、液lOOpl，将反应板充分混匀后 置37"C水浴箱30min后，弃去孔内液体，用稀释后的洗涤液将反应板充分洗涤 4-6次，在滤纸上印干。(8)加底物工作液：每孔加底物工作液100¨1，将反应板充分混匀后置37。C， 暗处反应15min。(9)加终止液：每孔加终止液lOOpl，30min内用酶标仪在450nm处测吸光值。 (10)计算胰岛素含量及胰岛素敏感性指数：所有OD值都应减去空白值后再行计算。胰岛素敏感性指数(ISI)=1(空腹血糖×空腹胰岛素)=I(FPG×FINS)， 此值为非正态分布，故计算时取其自然对数【1 51。4行为学测定分别于注射STZ

45、前(基础状态)、注射STZl4d后及给姜黄素3、7、14d后 测定MWT和TWL。所有测定均在固定时间(8：0017：00)及安静的环境下 进行，室温维持在(24o土O5)。41机械缩足反应阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)的测定： 将大鼠置于底为金属筛网(1×lcm2)的透明有机玻璃箱(22cm×22cm×22cm)中， 玻璃箱被架高于实验台面50cm。待大鼠在箱中适应15min后，用IITC2390型 Electronic VonFery触觉测痛仪垂直刺激大鼠双后趾，单次刺激时间1秒，刺16温州医学院硕士学位论文激间

46、隔10s。记录测试时大鼠出现抬足或舔足行为时的刺激强度值，测5次取平 均值即为其MWT16】。42热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)测定：用IITC336甩 尾足底测试仪于上述各时点测定TWL。将大鼠置于3mm厚的玻璃板上，使用热 辐射照射其后趾相应部位，记录从照射到缩爪回避的时间，每只大鼠双足各测5次，每次间隔5min，取后3次的平均值即为其TWL【17】。 5免疫组织化学法51标本取材及制作：于注射姜黄素3、7、14d机械痛敏和热痛敏测定后经 腹腔注射5水合氯醛400 mgkg麻醉动物，各时间点取6只剖胸后经左心室 主动脉插管，快速灌注生理盐水20

47、0 ml，待右心室流出清亮液体后再灌注4多聚甲醛400ml，灌注成功的表现为大鼠肝脏发白、四肢和尾巴僵直。取大鼠L46 节段脊髓和相应DRG，固定后石蜡包埋，切片，片厚4-51am，晾干各用。52免疫组化染色：用sP法免疫组织化学染色、DAB显色。 (1)切片经60烤片2h至石蜡溶解，二甲苯脱腊至水化：二甲苯I、II各10min、无水乙醇、95乙醇、80乙醇、75乙醇各5rain、PBS液(pn 7274)冲洗5minx3次； (2)抗原高压热修复：枸橼酸修复液加热至微沸后将切片放入，盖上高压锅加压阀，待其喷气时开始计时，高压修复(BiPlomin，p-elF2a15min)后离开热源，自来水

48、流水冷却至室温，取出玻片，PBS液冲洗5min×3次； (3)封闭：3过氧化氢封闭20min，PBS液冲洗5minx3次； (4)IN入一抗4"C孵育1624h(BiP一抗稀释度为1：150，p-elF2a一抗稀释度为1：200)；PBS液冲洗5minx3次；(5)加HRP标记抗兔二抗37孵育lh，PBS液冲洗5minx3次；(6)DAB显色(BiP 4min，p-eIF2a5min)自来水冲洗；苏木素复染(BiP 2min，p-elF2a10s)自来水冲洗； (7)1盐酸酒精分化5s，自来水冲洗；(8)脱水、透明：95乙醇I、II各5min，无水乙醇I、II各5min，二

49、甲苯 I、II各10min；中性树胶封片、晾干、镜检观察。(9)使用Nikon E800型荧光显微照相系统采集图象，染色阳性反应为棕黄色 颗粒，间隔5张顺序选取脊髓背角(I、II板层)和DRG片子6张只，计算脊 髓背角和DRG中BiP和p-eIF2a的阳性细胞率(阳性细胞率=阳性细胞数总细 胞数×100)。温州医学院硕士学位论文6免疫印迹61标本取材：于注射姜黄素3、7、14d痛阈测定后经腹腔注射5水合氯醛400 mgkg麻醉动物，各时间点取3只快速分取脊髓L4-6节段及相应节段DRG， 用预冷4。C的人工脑脊液洗狰血液，液氮中快速制冷，80低温保存备用。62免疫印迹测蛋白：内参为I

50、-tubulin。 (1)制作样本蛋白：操作均在4。C完成。80冰箱取出新鲜组织标本，按重量体积比1：10加入裂解液，使用研磨器间断研磨30min至细胞破碎裂解，超声破 膜(振幅40)10sx3次，静置30min，然后12000r、4。C离心20min，取上清液 置80冰箱备用；(2)测蛋白浓度：以BCA试剂盒BSA标准蛋白在BioTek荧光分析仪上比 色测定吸光值，描绘蛋白浓度标准曲线，测定样本蛋白浓度：根据所测样品吸光值，在标准曲线上查得蛋白含量，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(即50tg 中159l样品中蛋白含量)：(3)蛋白样本融化，每管加入ddH20配成129l上样量，再加入5&#

51、215;上样缓冲液 39l，煮沸5min蛋白变性后置20冰箱备用；(4)制胶：使用BioRad垂直板电泳装置，清洗玻璃板，晾干后边缘对齐后放 入夹中卡紧，然后垂直嵌入橡皮条固定于电泳架上，使两板间形成密闭凹槽，沿 玻璃灌注10 o60分离胶，待胶面升到绿带中间线高度即可，加水液封，37温箱 静置15min，凝后用吸水纸将胶上层水吸干，将剩余空间灌满4浓缩胶，插梳 子(梳子保持水平)静置凝固；(5)取配好的样品，冰中冻融，震荡器摇匀，短暂离心，将玻璃板固定于电泳 槽中，内槽灌满电泳缓冲液，两手分别捏住梳子两边竖直向上轻轻将其拔出，用 移液器加样(每孔样品159l，Marker3btl)，外槽加电

52、泳液至玻璃板下13，记录 Marker及样本加样排列顺序；(6)电泳：冰冷环境中，浓缩胶电压70V，待溴芬兰跑至分离胶线时改用120V 电压，待跑出底线时即可终止电泳，电泳结束后，将玻璃板轻轻撬开，根据Marker 标记获取所需目的蛋白和内参蛋白条带的凝胶，放入转移液中平衡15min备用； (7)转膜：剪取与凝胶相当大小的PVDF膜，剪去膜右上角作为标记，在甲醇 中通过毛细血管作用浸透后没入ddH20中2min，转入转移缓冲液中浸浴平衡18温州医学院硕士学位论文10rain，将在转移液中平衡后的胶盖于滤纸上按顺序固定好(从负极到正极依次 为滤纸凝胶PVDF膜滤纸)，轻轻用玻棒擀去气泡、夹好固定

53、，置转膜槽(确 定正负极无误)，灌满转移缓冲液，设定转膜仪参数300mA，50min，置入冰浴 环境；(8)转膜后可将PVDF膜用丽春红染色，了解蛋白转移情况。具体的转膜时间 要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白分子量越大，需要的转膜时间越长，目的 蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短，染色后的PVDF膜用TBST液漂洗 10minx 3次；(9)封闭：加入封闭液(含5脱脂牛奶的TBST液)室温摇床上封闭(BiP、 Tubuin封闭lh，p-elF2a封闭2h)，TBST冲洗10min×3次；(10)加一抗工作液：BiP多克隆抗体(兔抗大鼠，脊髓1：1000稀释，DRGl：1000稀释

54、)，p-eIF2a单克隆抗体(兔抗大鼠，脊髓1：1000稀释，DRGl：2000稀释)， 40过夜孵育18小时，TBST液冲洗10minx3次；QD加二抗工作液：5脱脂牛奶稀释的羊抗兔Ig碱性磷酸酶标记的IgG抗体 (山羊抗兔，按1：8000稀释)，室温摇床上孵育lh，TBST洗膜10minx3次；滴加超敏ECL发光液用Alpha Innotech曝光机曝光、拍照。用Alpha EaseFC软件分析目的蛋白，内参蛋白的平均光密度值。 7统计分析用SPSS 1 60统计软件包进行数据处理。全部数据以均数4-标准差表示，采 用单因素方差分析，继以最小显著差异t检验行两两比较。P<005为差异有统计 学意义。温州医学院硕士学位论文结果1一般情况观察 正常组大鼠毛色光滑柔软，每日饮食、尿量正常，性格温顺，而在注射STZl4d的造模组大鼠则毛色暗淡，每日饮食、饮水、尿量明显增多。 2体