蛋白质与酶工程第三章 酶的分离纯化

1、Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化Contents of chapter 31、酶的提取与分离纯化技术路线2、细胞破碎3、酶的提取4、酶的分离方法GoGoGoGo5、酶的组合分离纯化策略Go6、酶的浓缩、干燥与结晶Go细胞结构与酶分布酶的提取、分离纯化酶的提取、分离纯化 酶的提取、分离纯化是将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开，而获得与使用目的、要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程 基本原则基本原则一、防止变性失效二、可以采用比一般蛋白质分离更多更有效的方法和条件三

2、、提取、纯化的每一步都应进行酶活力的检测3.1 3.1 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。注意点注意点1.除了少数例外，所有操作都应在低温下条件下进行，尤其在有有机溶剂存在时更应特别小心2. 大多数酶在pH 10的情况下不稳定，故必须控制整个系统不要过酸或过碱；同时要避免在调节pH时产生局部酸碱过量的现象。3

3、.酶和其它蛋白质一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形成。4.重金属、有机溶剂等能使酶变性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏，所有这些也都应予以足够的重视。3.2 细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机机械破碎

4、捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到

5、破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理本章目录超声波破碎法超声波破碎法l利用超声波的机械振动而使细胞膜上所受张力不均而破碎。Fig. Sonicatorl酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。l酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。l酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等

6、进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 3.3 3.3 酶的提取酶的提取提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。酶的主要提取方法酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶

7、剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象盐溶现象。 本章目录影响提取的主要因素影响提取的主要因素温度温度对酶的提取效果影响明显，适当提高温度，可以增加酶的溶解度和分子扩散速度，但温度过高会引起酶的变性失活。采用有机溶剂时，温度控制在低温条件下。室温下提取的有酵母醇脱氢酶，细菌碱性磷酸酶，胃蛋白酶。因此在不影响酶的活性条件下，适当提高温度，有利于酶的提取。溶液的对酶的溶解度和稳定性有显著影响，不同的酶会带不同的电荷及其带的电荷量不同，酶在等电点的溶解度最低，故提

8、高溶解度应该避开等电点，但不能过高过低。提取液的体积增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。过量的提取液会使酶浓度降低，对分离纯化不利。所以提取液总量一般为原料体积的体积，最好分几次提取。在酶的提取过程中，体积小，颗粒的比表面积大，扩散面积大，有利于提高扩散速度，适当的搅拌和适当的延长时间，可使酶更好的溶解出来。注意为了保护酶的稳定性，可加某些保护剂，如与酶作用的底物，辅酶，某些抗氧化剂。分离方法的选择分离方法的选择为了获得理想的分离效果应注意：为了获得理想的分离效果应注意：l工作前应对所要纯化的酶的理化性质工作前应对所要纯化的酶的理化性质( (溶解度、分溶解度、分子大小和解离特性子大小和解离特

9、性) )以及酶的稳定性等有一个较全以及酶的稳定性等有一个较全面的了解。面的了解。l判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力测定为准则。测定为准则。l要严格控制操作条件，防止变性。要严格控制操作条件，防止变性。3.4 酶的分离酶的分离酶的分离纯化方法酶的分离纯化方法l现有的酶的分离纯化方法都是根据酶和杂蛋白在下列性质上的差异建立的。l性质 方法l分子大小 离心，超离心法、凝胶过滤， 膜分离技术（超滤，反渗透， 微孔过滤，透析，电渗析等）l溶解度 盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀法， 选择性沉淀法，结晶 l电荷或基团 离子交换色谱，电泳，等电聚焦， 吸附

10、色谱，疏水色谱，聚焦色谱l稳定性 选择性变性法（热，酸碱， 表面活性剂）l特殊（专一性结合） 亲和色谱，亲和洗脱，亲和电泳 酶的分离方法酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离GoGoGoGo5、电泳分离Go6、萃取分离Go本章目录1 1、沉淀分离、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度溶解度降低降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理 盐析沉淀法盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法等电点沉淀法利用

11、两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离盐析盐析沉淀沉淀法法l盐析法是最古老的，但也是目前仍广泛采用的方法。l盐析法根据的原理是：球蛋白在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增大，表

12、现“盐溶(salting in)”的特性。但是当盐浓度继续升高，并超过某一上限时，其溶解度又会先后以不同速度下降，分别“盐析(salting out)沉淀析出。l盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别差别而建立的一种纯化方法。球蛋白溶解度球蛋白溶解度-溶液离子强度关系溶液离子强度关系盐析盐析l中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因：l1).中和蛋白质分子表面电荷l2).与蛋白质颗粒竞争水分子l不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不同，因而可以分级沉淀。l盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋白质浓度在1mg/ml以上，低温。l此法优点：简便，安全，重现性好l缺点：分辨率低，纯

13、度提高不显著，同时为了下一步纯化，有时还需要脱盐。盐析盐析l盐析法的一个发展就是和色谱技术相结合形成盐析色谱法(salting out chromatography)，即以琼脂糖等非极性物质为柱色谱的支持体，在高浓度条件下将样品中的蛋白质盐析吸附，然后再梯度地降低盐类浓度，使酶和杂蛋白分别洗脱出来。l这种技术的优点是纯化量大，重复性好，分辨率高较。盐析盐析l蛋白质和酶在溶液中的溶解度，与溶液中的离子强度有关：lLog(S/S0)=-KsIlLogS=LogS0-KsI=- KsIlS-蛋白质或酶在离子强度为I 时的溶解度（w/v) S0-蛋白质或酶在离子强度为0时的溶解度 Ks-盐析常数 I

14、-离子强度盐析盐析l在一定的温度和pH条件下（为常数），通过改变离子强度的方法可使不同的蛋白质或酶分离，称为KS分段盐析。l在一定的盐和离子强度条件下（Ks、I为常数 ），通过改变温度或pH值使不同物质分离，称分段盐析。盐析盐析l蛋白质盐析沉淀中，常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠、和磷酸钠等，硫酸铵最常用。l不同的酶，盐析时所需的盐浓度个不相同。酶的来源、酶的浓度、杂质的成分等对盐析时所需的盐浓度也有所影响。l经盐析后的酶沉淀，含有大量盐分，需采用透析、超滤或层析等方法进行脱盐。 等电点沉淀法等电点沉淀法l原理：利用两性电解质在等电点时溶解度最低和不同的电解质具有不同的等电

15、点的特性，通过调节溶液的PH，使酶或蛋白质沉淀析出，从而使酶和蛋白质分离的方法。l等电点时，两性电解质分子的静电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。l由于在等电点时，两性电解质表面的水化膜依然存在，故实际上酶等大分子蛋白质仍有一定的溶解性，从而使沉淀不完全。在实际中，此法经常与其他方法一起使用，如等电点经常与盐析沉淀，有机溶剂沉淀，和复合沉淀一起使用。单独使用时，主要是从粗酶中除去某些等电点相差较大的蛋白质。l加酸碱时，一边搅拌一边慢慢加进，防止局部过酸过碱一起蛋白质变性。等电点沉淀法等电点沉淀法l如：纯化动物材料抽提液中的酶时，可将pH先调整至5左右，待放置片刻后，核

16、蛋白等颗粒杂质就会沉淀析出，使酶溶液达到“一步澄清”。l又如：纯化血清胆碱脂酶时，可先将pH先调至2.83.0，除去酸性杂蛋白。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法l有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的静电引力，导致蛋白质的溶解度下降；也可与水作用使蛋白质脱水而趋于凝集、沉淀。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法称有机溶剂沉淀法。l应考虑：温度pH离子和离子强度有机溶剂l此法优点：分辨率高，溶剂易除去。l缺点：温度控制不当时易引起变性。本节目录有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法l用于蛋白质纯化的有机溶剂中，丙酮的分离效果最好，引起失效的情况比较少。除丙酮外，乙醇和甲醇等也常

17、用。l有机溶剂浓度通常以百分体积表示，加入量可按下式计算：V = Vo* (S2-S1)/(S-S2) lV 应加入的有机溶剂体积l Vo原溶液的体积 lS2所要达到的有机溶剂百分浓度lS1原溶液中有机溶剂的百分浓度lS待加有机溶剂的百分浓度 复合沉淀法复合沉淀法l定义：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物沉淀下来，从而使酶和杂质分离的方法称为复合沉淀法。l常用的复合沉淀剂：单宁，聚乙二醇，聚丙烯酸l例： 菠萝蛋白酶与单宁复合可以制成药片，用于治疗咽喉炎l复合物有的可以直接中使用，有的用适当的方法，使酶从复合物中析出进一步纯化。复合沉淀法复合沉淀法l利用离子型表面活性剂离子型表面活性剂如S

18、DS、非离子型表面活性剂如聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）、聚乙烯亚胺以及单宁酸、硫酸链霉素等，在一定条件下能与蛋白质直接地形成络合物，使蛋白质沉淀析出，然后再用适当方法使需要的酶溶解出来，除去杂蛋白和沉淀剂，从而达到纯化的目的。复合沉淀法复合沉淀法l以聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)纯化限制性内切核酸酶RE. EcoR I为例。l在该酶生产菌株的超声破碎离心上清液中，包含大量的DNA和杂蛋白。PEI在0.2mol/L KCl的条件下，能和DNA以及与之相关的蛋白质一起凝聚沉淀析出；但当KCl的浓度上升至0.6 mol/L时，虽然PEI与DN

19、A及杂蛋白仍处于沉淀状态，而RE. EcoR I却能重新溶解，因此可将酶和杂蛋白分离开来，使RE. EcoR I得到初步纯化。选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法l定义：选择一定的条件使杂蛋白变性沉淀，而不影响所需酶的方法。l方法：热处理，改变PH或加入某些金属离子l应用此法必须对与分离的酶以及酶液中的杂蛋白的种类含量及其物理和化学性质有较全面的了解。本节目录2 2、离心分离、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常速离心机又称为低速离

20、心机常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机高速离心机的最大转速为（12.5）104 r/min ，相对离心力达到 11041105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速有些高速离心机装设有冷冻装置离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。谓之高速冷冻离心机。超速离心机超速离心机的最大转速达 (2.512)104 r/min，相对

21、离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。实验室离心机实验室离心机温度类型：常温及冷冻温度类型：常温及冷冻超速离心机均为冷冻型。超速离心机均为冷冻型。使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头，开盖使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头，开盖关机。关机。使用超速离心机时先抽真空。使用超速离心机时先抽真空。离心的形式离心的形式角式离心机和离心头（转子）角式离心机和离心头（转子）。水平转子水平转子v旋转时随着转子的转动从旋转时随着转子的转动从垂直悬吊上升到水平位置垂直悬吊上升到水平位

22、置（约（约200200800rpm800rpm）时。）时。v颗粒在水平转子中的沉降颗粒在水平转子中的沉降是沿管子方向的，是沿管子方向的，离心机的大小：台式离心机的大小：台式离心机的大小：落地式离心机的大小：落地式l材质：玻璃，材质：玻璃，塑料塑料l强度：和离强度：和离心速度相配心速度相配l大小：和转大小：和转子配套子配套l高速超速管高速超速管要加盖要加盖离心机操作离心机操作离心机其它类型离心机其它类型 超速冷冻离心机超速冷冻离心机 立式螺旋过滤离心机立式螺旋过滤离心机活塞推料离心机活塞推料离心机 管式离心机管式离心机三足离心机三足离心机实例1：1. 1. 细菌，蛋白沉淀细菌，蛋白沉淀 - -

23、核酸提取核酸提取 - - 细胞细胞/ /亚细胞组份分离。亚细胞组份分离。2. 2. 动、植物病毒分离、血液血清提取及溶动、植物病毒分离、血液血清提取及溶液中大、小颗粒不同组份的分离。液中大、小颗粒不同组份的分离。、1 1、打开离心机盖打开离心机盖, ,选选择容量适合的转子，将择容量适合的转子，将带样品离心管放入转子带样品离心管放入转子内（样品一定要平衡内（样品一定要平衡好），再将转子放入离好），再将转子放入离心室内固定好转子。心室内固定好转子。2 2、关好离心机盖，设定离心机转子型号、转速、关好离心机盖，设定离心机转子型号、转速、离心时间、温度、启动运转。离心时间、温度、启动运转。3 3、离心

24、时间到待转速降至零，打开离心机盖将样品（离心离心时间到待转速降至零，打开离心机盖将样品（离心管）取出，离心结束。管）取出，离心结束。方法方法l差速离心；采用不同的离心速度和离心时间，分离大小和密度相差较大的颗粒。l沉降速度离心（区带离心，密度梯度离心）：样品在平缓的介质梯度中移动，最小密度大于介质的最大密度，不同物质按沉降速度的大小形成区带。介质为蔗糖、甘油。分离密度相近大小不同的样品，如蛋白。l沉降平衡离心（等密度梯度）：介质的梯度有适当陡度，最大密度大于样品的最大密度，样品各组分移动到与各自密度相同的位置。介质为CsCl。常用于分离大小相近密度不同的样品，如核酸。 2 21 1 密度梯度离

25、心密度梯度离心 密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数不沉降系数不同的组分得以分离同的组分得以分离的一种区带分离方法。的一种区带分离方法。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度介质梯度介质制成的。制成的。梯度介质应有梯度介质应有足够大的溶解度足够大的溶解度，以形成所需的密度，不与分离组，以形成所需的密度，不与分离组分反应，而且不会引起分离组分的凝聚、变性或失活。分反应，而且不会引起分离组分的凝聚、变性或失活。 常用的有常用的有蔗糖、甘油蔗糖、甘油等。使用最多的是等。使用最多的是蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度系

26、统，其梯度范围是：蔗糖系统，其梯度范围是：蔗糖浓度浓度5 56060，密度密度1.021.021.301.30g/cmg/cm3 3。 密度梯度的制备可采用密度梯度的制备可采用梯度混合器梯度混合器，也可将不同浓度，也可将不同浓度的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠管底，越靠管底，浓度越高，浓度越高，形成形成阶梯梯度阶梯梯度。离心前，把离心前，把样品样品小心地铺放在预先制备好的小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面密度梯度溶液的表面。离心后，不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在离心后，不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在密度

27、梯度溶液中形成若干条界面清楚的密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带不连续区带。各区带内的颗粒较均一，分离效果较好。各区带内的颗粒较均一，分离效果较好。在密度梯度离心过程中，在密度梯度离心过程中，区带的位置区带的位置和和宽度宽度随随离心时间离心时间的不同而的不同而改变。改变。随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当增大离心力增大离心力而而缩短离心时间缩短离心时间，可以减少区带扩宽，可以减少区带扩宽。 2 22 2 等密度离心等密度离心 将将CsClCsCl2 2、CsSOCsSO4 4等介质等介质溶液与样品溶液混合，

28、然后在选溶液与样品溶液混合，然后在选定的离心力作用下，经足够时间的离心，铯盐在离心场定的离心力作用下，经足够时间的离心，铯盐在离心场中沉降形成中沉降形成密度梯度密度梯度 样品中不同浮力密度的颗粒在各自的样品中不同浮力密度的颗粒在各自的等密度点位置等密度点位置上形上形成区带。成区带。 常用来分离提取常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒核酸、亚细胞器和质粒。 前述密度梯度离心法中，欲分离的颗粒未达到其前述密度梯度离心法中，欲分离的颗粒未达到其等密度位置，故分离效果不如等密度离心法好。等密度位置，故分离效果不如等密度离心法好。 应当注意的是，铯盐浓度过高和离心力过大时，应当注意的是，铯盐浓度过高和离心

29、力过大时，铯盐会沉淀管底，严重时会造成事故，故等密度铯盐会沉淀管底，严重时会造成事故，故等密度梯度离心需由专业人员经严格计算确定梯度离心需由专业人员经严格计算确定铯盐浓度铯盐浓度和离心机转速及离心时间和离心机转速及离心时间。 此外，铯盐对铝合金转子有很此外，铯盐对铝合金转子有很强的腐蚀性强的腐蚀性，故最，故最好使用好使用钛合金转子钛合金转子，转子使用后要仔细清洗并干，转子使用后要仔细清洗并干燥。燥。 蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心CsCl等密度梯度离心等密度梯度离心离心条件的确定离心条件的确定1.离心力2.离心时间3.温度和pH值离心力离心力l低速离心一般用转速，即转子每分钟的转数表示，如5

30、000r/min.而在高速特别是超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示，如5000g.相对离心力是颗粒所受到的离心力与地心的引力的比值。l式中，RCF为相对离心力（g); FC为离心力；F g为地心引力;n为转子每分钟的转数（r/min) ;r为旋转半径（cm).l颗粒距离离心轴越远，其所受的离心力越大。l一般离心力的数值是平均数值，即在离心溶液中点处颗粒所受的离心力。 rnFgFcRCF251012. 1 离心时间离心时间l对于低速和高速离心机和差速离心来说，离心时间是指颗粒从离心管样品液的液面完全沉降到离心官底的时间，称为沉降时间或澄清时间。l对于密度梯度离心而言，离心时间是指形成界限

31、分明的区带时间，称为区带形成时间。l等密度梯度离心，是指颗粒完全达到等密度点的平衡时间，称为平衡时间。其中最常用的是沉降时间。 沉降时间沉降时间 l沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉降距离。l t表示沉降时间（s) ;s表示颗粒的沉降系数; w表示转子的角速度（r ad /s); r1,，r2分别表示旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离(cm)l上式子做如下变换 k称为转子因子)lnlnr(1212wrStStwrrK)lnln(212温度和温度和PHl离心温度一般控制在4左右，对于某些耐热性较好的酶，也可以在室温下进行离心分离。但在超速离心和高速离心时，由于转子高速旋转会发热而引起温度升高，

32、必须采用冷冻装置，使温度维持在一定范围内。l离心介质的PH必须处于酶稳定的PH范围内，必要时可采用缓冲溶液，过高过低可能引起酶的变性失活，还可能引起转子和离心机其他部件的腐蚀，应当加以注意。膜过滤技术（膜过滤技术（membrane filtration）：借助于一定借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。 膜分离技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期最有发展前途，甚至会导致一次工业革命的重大生产技术，所以可以称为前沿技术，是世界各国研究的热点。 广泛应用于生物

33、工程、化学、制药、饮料、电力、冶金、海水淡化、资源再生等领域。渗出液渗出液3 3、过滤与膜分离、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。膜膜分离技术的地位和影响分离技术的地位和影响l 美国官方文件曾说美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程世纪电器改变了整个工业进程，而，而20世纪膜技术将改变整个面貌世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一种目前没有一种技术，能像膜技术这么广泛地被应用技术，能像膜技术这么广泛地被应用”l 日本日本和欧洲则把膜技术作为和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研世纪的基盘技术进行研究和开发究和开发。l “谁掌握了

34、膜技术，谁就掌握了化学工业的未来谁掌握了膜技术，谁就掌握了化学工业的未来”- Norman N. Li，美国科学院院士，著名华裔科学家。，美国科学院院士，著名华裔科学家。l 膜分离已得到广泛应用膜分离已得到广泛应用。21世纪是工业生物技术的世世纪是工业生物技术的世纪，膜技术将扮演重要角色。纪，膜技术将扮演重要角色。过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性( (根据过滤介质根据过滤介质截留的物质颗粒大小截留的物质颗粒大小不同不同 ) ) 类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤粗滤 2m酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤微滤0.22m细菌、灰尘等微滤膜

35、、微孔陶瓷超滤超滤200.2m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透反渗透Tc，PPc分离工程超临界流体不是液体，也不是通常状态下的气超临界流体不是液体，也不是通常状态下的气体，是一种特定状态的流体体，是一种特定状态的流体1、处于临界点状态的物质可实现从液态到气态的连续过渡，两相界面消失，汽化热为零。2、超过临界点的物质（ TTc ），不论压力有多大，都不会使其液化，压力的变化只引起流体密度的变化。l 超临界流体的性质超临界流体的性质（1）密度接近于液体，这使它具有与液体溶剂相当的萃取能）密度接近于液体，这使它具有与液体溶剂相当的萃取能力。力。（2）黏度和扩散系数与气体相近似，而溶剂的低黏度和高扩）黏

36、度和扩散系数与气体相近似，而溶剂的低黏度和高扩散系数的性质是有利于传质的，具有很高的传质速度。散系数的性质是有利于传质的，具有很高的传质速度。（3）该流体随着温度与压力的连续变化，对物质的萃取具有）该流体随着温度与压力的连续变化，对物质的萃取具有选择性。选择性。气体、超临界流体和液体性质的比较气体、超临界流体和液体性质的比较性质性质相态相态气体气体超临界流体超临界流体液体液体密度密度/gcm-310-30.71.0黏度黏度/cP10-310-210-210-1扩散系数扩散系数/cm2S-110-110-310-5超临界流体是指在超临界流体是指在31.1和和13.78MPa时的时的CO2。l 超

37、临界流体萃取（超临界流体萃取（Supercritical fluid extraction，SFE）超临界流体萃取技术（超临界流体萃取技术（SFE） 是利用超临界流体（SCF）作为萃取剂，从液体或固体中萃取出特定成分，以达到某种分离目的的技术。 CO2由于具有合适的临界条件，对健康无害，由于具有合适的临界条件，对健康无害，不燃烧，不腐蚀，价格便宜和易于处理等优点，是不燃烧，不腐蚀，价格便宜和易于处理等优点，是最常用的超临界萃取剂。最常用的超临界萃取剂。l 超临界流体萃取流程超临界流体萃取流程萃取阶段萃取阶段:在超临界状态下，超临界流体与原料接在超临界状态下，超临界流体与原料接 触进行萃取获得萃

38、取相。触进行萃取获得萃取相。分离阶段：分离阶段：使萃取组分与超临界流体分离。使萃取组分与超临界流体分离。萃取阶段萃取阶段分离阶段分离阶段分离工程由上表中可见：= 大部分碳氢化合物其临界压力在5MPa左右；= 对低碳烃化物，如乙烯、乙烷等，其临界温度近常温，而环状的脂肪烃和芳香烃具有较高的临界温度；= 水和氨具有较高的临界温度和压力，这是因为极性大和氢键的缘故；= 二氧化碳具有温和的临界温度和相对较低的临界压力，为最常用的超临界流体；= 对于临界温度在0100范围的流体，适用于提取天然植物有效成分。 l超临界流体萃取的应用超临界流体萃取的应用医药工业医药工业化学工业化学工业食品工业食品工业化妆品

39、香料化妆品香料中草药提取中草药提取酶，纤维素精制酶，纤维素精制金属离子萃取金属离子萃取烃类分离烃类分离共沸物分离共沸物分离高分子化合物分离高分子化合物分离植物油脂萃取植物油脂萃取酒花萃取酒花萃取植物色素提取植物色素提取天然香料萃取天然香料萃取化妆品原料提取精制化妆品原料提取精制l根据分离方法不同分为： 1等压分离 2等温分离 3吸附分离 改变压力的超临界萃取流程改变压力的超临界萃取流程原料原料萃取相萃取相溶剂溶剂萃萃取取产产物物萃萃余余相相萃萃取取器器分分离离器器减减压压阀阀压缩机压缩机P1T1T2P2等温法等温法 T1T2，P1P2（1 1）等温变压流程）等温变压流程 改变温度的超临界萃取流程改变温度的超临界萃取流程等压法等