国际协调会非灭菌产品微生物检查ICH(11版)

1、非灭菌产品微生物检查：微生物计数法（ICH）概述本检查法可用于好氧的嗜温细菌和真菌的计数。当本检查法用于确定非规定灭菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物限度标准时，按下列规定进行检验，包括其取样量和结果判断等。本检查法不适用于以活菌作为活性成分的制剂的微生物限度检查。本检查法可采用替代的微生物计数方法，包括自动测定方法，但必须验证替代方法优于或与药典方法相当。一般程序本检查应在严格避免外来微生物污染供试品的实验条件下进行，防止微生物污染的措施不得影响供试品中污染微生物的检出如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时，如果使用了灭活剂，应对其有效性及对微生物的无毒性进行验证。如果

2、在供试液制备时使用了表面活性剂，应验证其对微生物无毒性及与灭活剂的相容性。计数方法检查时可采用薄膜过滤法或下列平板计数法中的一种。最大可能数法（Most-Probabl -Number, MPN）用于微生物计数其精确度较低，但当供试品的微生物污染程度极低时，MPN法可能是最适宜的方法。检查时根据供试品的特性和其微生物限度标准选择计数方法。该方法应满足所用的供试品检验量足以符合试验结果的判断。供试品计数方法的适用性必须确定。培养基促生长试验验和计数方法适用性确定试验总则供试品中污染的微生物计数方法的适用性应进行确认。若检验程序或供试品发生变化可能影响检验结果时，计数方法的适用性应重新进行确认。菌

3、液制备试验菌液可用标准稳定的菌悬液（商品化）或按下列规定程序制备。试验菌应采用适宜的保存技术保存，试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的菌种为第0代）。各试验菌株的培养及接种量见表1。使用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或者pH7.2磷酸盐缓冲液制备菌悬液，黑曲霉孢子悬液可用含0.05（v/v）聚山梨酯80的缓冲液。菌悬液应在2小时内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。相对体积的黑曲霉和枯草芽孢杆菌的稳定孢子悬液可替代新鲜的孢子悬液，稳定孢子悬液可保存在28，并在验证过的贮存期内使用。表1 实验用菌液的制备和使用培养基促生长实验计数方法适用性实验实验菌株菌液制备

4、需氧菌总数测定霉菌及酵母菌总数测定需氧菌总数测定霉菌及酵母菌总数测定金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26 003胰酪胨大豆琼脂或胰酪胨大豆肉汤，3035培养1824小时胰酪胨大豆琼脂和胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天胰酪胨大豆琼脂/MPN胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10104胰酪胨大豆琼脂或胰酪胨大豆肉汤，3035培养1824小时胰酪胨大豆琼脂和胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天胰酪胨大豆琼脂/MPN胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天枯草芽孢杆菌(

5、Bacillus subtilis)CMCC（B）63501胰酪胨大豆琼脂或胰酪胨大豆肉汤，3035培养1824小时胰酪胨大豆琼脂和胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天胰酪胨大豆琼脂/MPN胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤，2025培养23天胰酪胨大豆琼脂100cfu3035，5天沙氏葡萄糖琼脂100cfu2025，5天胰酪胨大豆琼脂100cfu3035，5天不采用MPN法沙氏葡萄糖琼脂100cfu2025，5天黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)98 003沙

6、氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂，2025培养57天，或直到大量孢子产生胰酪胨大豆琼脂100cfu3035，5天沙氏葡萄糖琼脂100cfu2025，5天胰酪胨大豆琼脂100cfu3035，5天不采用MPN法沙氏葡萄糖琼脂100cfu2025，5天阴性对照试验为确认实验条件是否符合要求，应设立阴性对照组，以稀释剂代替供试品， 阴性对照组应无菌生长。培养基促生长实验每批成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基应进行培养基促生长试验。接种如表1所示的少量微生物（100cfu）至胰酪胨大豆肉汤管或胰酪胨大豆琼脂平板，每一批培养基分别制备一管/皿；接种如表1所示的少量微生物（100cfu）至沙氏

7、葡萄糖琼脂平板，每一批培养基分别制备一皿，按表1所列条件培养。对于固体培养基，从被测试培养基获得的菌落数不得大于或小于来自验证过的标准培养基菌落数的2倍，并且其新鲜培养物的菌落形态应与之前验证过的标准培养基上的菌落形态一致；对于液体培养基，被测试培养基管出现清晰可见微生物的时间和形态应与之前验证过的标准培养基管一致。计数方法实用性实验供试液制备根据供试液供试品的理化特性选择供试液制备方法 ，若下列制备方法经确认均不适宜，应采用适宜的替代方法。水溶性产品：取规定量，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲液或胰酪胨大豆肉汤培养基溶解或稀释 ，一般制成110供试液。如果需要，调节

8、供试液pH值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步稀释。水不溶性非油酯类产品：取规定量，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲液或胰酪胨大豆肉汤培养基10倍混悬。分散能力较差的供试品，可在稀释剂中加入表面活性剂助悬，如0.1%(g/v)的聚山梨酯80。如果需要，调节供试液pH值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步稀释。油酯类产品：取规定量，溶解于经过滤除菌的无菌十四烷酸异丙酯中，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性无菌表面活性剂充分混合，必要时可采用加热的试剂帮助溶解，温度一般不超过40，特殊情况下最多不超过45，若需要乳化可在水浴中进行，然

9、后加入预热的稀释剂使成110供试液，保持温度，小心混合，并在最短时间内形成乳液状。必要时，用含适宜浓度的无菌聚山梨酯80或其他非抑制性无菌表面活性剂的稀释剂进一步10倍系列稀释。气雾剂：取规定容器数，从每一供试品容器中取全量或一定量样品无菌转移至薄膜过滤器过滤或无菌容器中进一步取样检查。贴剂：取规定数量贴剂，去除贴剂的保护层，放置在无菌培养皿或塑料皿中，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，剧烈振摇至少30分钟。接种和稀释取上述制备的供试液，接入含不超过100cfu的实验菌悬液，

10、所加的菌悬液的体积应不超过供试液体积的1。同时用稀释剂做对照组。为证明样品中的微生物能被充分检出，应选择最低稀释级的供试液进行方法确认试验。如果由于样品的抗菌活性或溶解性较差原因导致检验方法无法确定，应进一步建立消除的方法。试验时，如果样品的抑菌作用无法避免，样品经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入菌悬液进一步试验。抗菌活性的去除或中和 当供试液接种后，按计数方法中的要求进行培养计数，将样品组回收的微生物数量与对照组回收的微生物数量进行比较。若供试液中微生物生长被抑制（比值小于2），应修订计数方法并进行确认试验以保证结果的有效性。方法修订可以包括以下几个方面：（1） 增加稀释剂或培养基用量；（

11、2） 在稀释剂中加入专用或通用的中和剂；（3） 采用薄膜过滤法；（4） 上述几种方法的联合使用。中和剂：中和剂可以用于中和抗菌剂的抗菌活性（表2）。中和剂可在稀释剂或培养基的灭菌前加入。若使用中和剂，应确定其有效性和对微生物的毒副作用，可通过设定一组不含样品而含有中和剂的对照组进行确认。表2 常见干扰物的中和剂或中和方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛、汞制剂硫氢化钠（硫化钠）酚类、乙醇、醛类、吸附物稀释醛类甘氨酸季铵化合物、对羟基苯甲酸、双胍类化合物卵磷脂季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸聚山梨醇酯水银巯基乙酸盐水银，汞化物，醛类硫代硫酸盐EDTA镁或钙离子若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作

12、用，那么确认试验中的微生物回收失败可看成是由于供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。然而，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据应符合的限度标准，应采用使微生物能生长的更高稀释级的供试液进行方法确认试验。供试品中微生物的计数 每一试验微生物应分别进行方法确认试验对每一列举的微生物分别加以测定，只对加入的试验菌进行计数。薄膜过滤法：试验所使用的薄膜过滤器的滤膜的孔径不得大于0.45m 。薄膜过滤器的选择应能有效的截留微生物，同时供试品的组分对其没有影响。每一试验菌株使用一个薄膜过滤器。取上述已加菌的供试液适量（相当1g供试品的量，若供试品

13、中菌数较高，可相应减少试验量）至滤器中，立即过滤，并用适量的冲洗液冲洗滤膜。若测定总需氧菌数（TAMC），转移滤膜至胰酪胨大豆琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数（TYMC），转移滤膜至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。按表1要求的温度和时间进行培养并计数。平板计数法：平板计数法每一培养基至少平行测定两个平板，以算术均值作为计数结果。浇碟法取上述经消除作用消除处理及加菌的供试液1ml，置于直径9cm的无菌平皿中，加入1520mL温度不超过45胰酪胨大豆琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基。如果使用直径更大的平皿，培养基体积应相应增加。每一试验菌应至少制备两个平板。按表1要求的温度和时间进行培养并计数。计算每

14、一试验菌平板计数的算术平均值，并计算接种的试验菌数。表面涂抹法取直径9cm的无菌平皿，加入1520mL温度不得超过45胰酪胨大豆琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，凝固，制成平板。如果使用直径更大的平皿，培养基体积应相应增加。在无菌层流台或培养箱中使制备的琼脂平板表面干燥。取上述经消除作用消除处理及加菌的供试液不少于0.1ml接种于琼脂平板表面，用无菌玻棒涂抹使试验菌均匀分布在琼脂平板表面，每一试验菌至少接种两个琼脂平板。培养和计数同浇碟法。最大或然数法（MPN）：最大或然数计数法（MPN）精度和准确度比薄膜过滤法和平板计数法差，若用于霉菌计数，结果是不可信的。因此，MPN法仅在总需氧菌没有适宜的测定

15、方法时使用。若规定使用MPN法，按如下程序进行。取上述经消除作用消除处理及加菌的供试液按10倍系列稀释，制备至少连续3个稀释级的供试液，从 每一稀释级的供试液中各吸取1g或1mL供试液3份分别加至3管装有910mL胰酪胨大豆肉汤培养基的试管中，若需要可在培养基中添加聚山梨酯80等表面活性剂或抗菌剂的灭活剂。3个稀释级共接种9管培养基，培养。所有接种管在3035培养不超过3天，如果由于供试品特性使结果判断困难或不确定，可将该管培养物转接种至胰酪胨大豆肉汤培养基或胰酪胨大豆琼脂培养基，在同一温度条件下培养12天，在进行结果判断。根据生长管数从表3查对每1g或每1mL供试品中最大可能的菌落数。表3

16、微生物最大或然数（Most-Probable-Number, MPN）值每组生长管数MPN/g(mL)95%可信限每管含样品的g或mL数0.10.010.00100030-9.400130.1-9.501030.1-100116.11.2-170206.21.2-170309.43.5-351003.60.2-171017.21.2-17102114-351107.41.3-20111114-35120114-35121155-38130165-382009.21.5-35201144-35202205-38210154-38211203-38212279-94220215-40221289-

17、94222359-94230299-94231369-94300235-94301389-1043026416-181310439-1813117517-19931212030-36031316030-3803209318-36032115030-38032221030-40032329090-99033024040-99033146090-19803321100200-40003331100结果判断供试品污染微生物数测定时，若采用薄膜过滤法或平板计数法，方法确认时，当供试品组中回收的微生物数与不含供试品的对照组回收的微生物数的比值不小于50时，表明薄膜过滤法或平板计数法适合该供试品的微生物计

18、数；若采用MPN法，当供试品组中回收的微生物数与不含供试品的对照组回收的微生物数相比在最大可能值的95可信限内，表该MPN 法适合该供试品的微生物计数 。计数方法确认时，若采用上述任何一种计数方法总存在一株或多株微生物试验菌的回收达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的微生物计数。供试品检验检验量除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10mL，并按上述要求取样，防止污染。 气雾剂为10个包装容器；贴剂为10贴。含生物活性的供试品，若处方中活性物质的含量符合下列要求，其检验量可以适当减少：每一剂量单位（片、胶囊、注射剂）小于或等于1mg，或者每g或每mL（指制剂）含

19、活性物质量低于1mg。这种情况下，检验量应不少于10个剂量单位，或者10g或10mL。样品量有限或批产量极小（如小于1000mL或1000g）的活性物质供试品，除另有规定更少的检验量外，其检验量为批产量的1 。批产量少于200的供试品（如临床诊断用），检验量最少为2个单位； 批产量少于100的供试品，检验量最少为1个单位。随机抽取原料或制剂单位的供试品，取充足的容器数混合取规定量供试品进行检验。供试品测定薄膜过滤法采用薄膜过滤法进行微生物计数时，应选择可以将滤膜转移到培养基的薄膜过滤器，按促生长试验和计数方法适用性试验确认的程序进行供试液制备，分别转移适量的供试液到两个薄膜过滤器，立即过滤，按

20、方法适用性试验确定的程序冲洗滤膜。冲洗后，转移一张滤膜到胰酪胨大豆琼脂培养基表面测定总需氧菌数（TAMC）；转移另一张滤膜到沙氏葡萄糖琼脂培养基表面测定霉菌和酵母总数计数（TYMC）。胰酪胨大豆琼脂平板在3035培养35天；沙氏葡萄糖琼脂平板在2025培养57天。计数，计算1g或1mL供试品中的微生物数。当检查贴剂时，分别转移10%供试液到两个薄膜过滤器，转移一张滤膜到胰酪胨大豆琼脂培养基表面测定总需氧菌数（TAMC）；转移另一张滤膜到沙氏葡萄糖琼脂培养基表面测定霉菌和酵母总数计数（TYMC）。平板计数法浇碟法：按促生长试验和计数方法适用性试验确认的程序进行供试液制备，每一供试液稀释级每种培养

21、基至少制备两个平板。胰酪胨大豆琼脂平板在3035培养35天；沙氏葡萄糖琼脂平板在2025培养57天。计数，总需氧菌计数（TAMC）选择平板菌落数小于250cfu、霉菌和酵母总数计数（TYMC）选择平板菌落数小于50cfu的菌稀释级作为菌数报告依据，根据每一培养基平板计数的算术平均值计算1g或1mL供试品中的微生物数。表面涂抹法：按促生长试验和计数方法适用性试验确认的程序进行供试液制备，每一供试液稀释级每种培养基至少制备两个平板。培养和菌落计数同上述浇碟法。最大或然数法（MPN） 按促生长试验和计数方法适用性试验确认的程序进行供试液制备，所有培养基接种管在3035培养35天。如果需要转种培养，按

22、方法适用性确认试验要求的程序进行。记录每一稀释级微生物生长的管数，从表3查对1g或1mL供试品含有最大可能的微生物数。结果判断总需氧菌计数（TAMC）是指胰酪胨大豆琼脂培养基中生长的总菌落数，包括真菌菌落数；霉菌和酵母总数计数（TYMC）是指沙氏葡萄糖琼脂培养基中生长的总菌落数，包括细菌菌落数。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌造成霉菌和酵母总数（TYMC）超过规定的限值，可使用含有抗生素的沙氏琼脂培养基进行霉菌和酵母总数测定。若采用MPN方法计数，测定的结果为总需氧菌数（TAMC） 。微生物限度标准解释如下：101cfu：最大可接受限值20；102cfu：最大可接受限值200；103cfu

23、：最大可接受限值2000；以此类推。计数方法中的溶液和培养基见XIIIC.2非灭菌产品微生物检查：控制菌检查法部分。非灭菌产品微生物检查：控制菌检查法概述本检查法用于在规定试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。当本检查法主要用于确定非规定灭菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物标准时，按下列规定进行检验，包括其取样量和结果判断等。本检查法可采用替代的控制菌检查方法，包括自动测定方法，但必须验证替代方法优于或与药典方法相当。一般程序供试液制备同非灭菌产品微生物检查：微生物计数法。若供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和，方法同 非灭菌产品微生物检查：微生物计数法 如果在供试液制备时使用了

24、表面活性剂，应验证其对微生物无毒性及与灭活剂的相容性。方法同 非灭菌产品微生物检查：微生物计数法 培养基促生长和抑制试验和方法适用性确定试验供试品中的控制菌检查方法适用性应进行确认。若检验程序或供试品发生变化可能影响检验结果时，检查方法的适用性应重新进行确认。菌液制备按如下程序制备标准的、稳定的菌悬液。试验菌应采用适宜的保存技术保存，试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的菌种为第0代）。需氧菌将各试验细菌分别于胰酪胨大豆肉汤培养基或在胰酪胨大豆琼脂培养基中，3035培养1824小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤培养基中，2025培养23天。金黄色葡萄球菌(

25、Staphylococcus aureus)如：ATCC6538,NCIMB9518,CIP4.83,NBRC13276铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)如：ATCC9027,NCIMB8626,CIP82.118,NBRC13275大肠埃希菌(Escherichia coli)如：ATCC8739,NCIMB8545,CIP53.126,NBRC3972肠沙门菌(Salmonella enteria)如：ATCC14028, NBRC100797,NCTC6017,CIP80.39白色念珠菌(Candida albicans)如：ATCC10231,NCPF3179

26、,IP48.72,NBRC1594上述接种物培养后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或者pH7.2磷酸盐缓冲液制备成菌悬液，若放置在室温下，菌悬液应在2小时内使用；若放置在28，菌悬液可以在24小时内使用。梭菌以生孢梭菌（Clostridium sporogenes）ATCC11437NBRC14293,NCIMB12343,CIP100651或ATCC19404NCTC532或CIP79.3作为试验菌株。接种梭菌于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下3035培养2448小时。稳定孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，稳定孢子悬液可保存在28，并在验证过的贮存期内使用。 阴性对照为确认实验条件是否符合要求，

27、应设立阴性对照组，以稀释剂代替供试品， 阴性对照组应无菌生长。培养基促生长和抑制试验每批成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基应进行培养基促生长和抑制试验。有关培养基应具备的促生长能力、指示和抑制特性见下表1。表1 培养基促生长、抑制和指示特性控制菌检查培养基特性试验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌肉汤促生长能力E.coli、P.aeruginosa抑制能力S.aureus紫红胆盐葡萄糖琼脂促生长能力+指示能力E.coli、P.aeruginosa大肠埃希菌麦康凯肉汤促生长能力E.coli抑制能力S.aureus麦康凯琼脂促生长能力+指示能力E.coli沙门菌RV沙门菌增菌肉汤促生长

28、能力S paratyphi B抑制能力S.aureus木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂促生长能力+指示能力S paratyphi BE.coli铜绿假单胞菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力P.aeruginosa抑制能力E.coli金黄色葡萄球菌甘露醇高盐琼脂促生长能力+指示能力S.aureus抑制能力E.coli梭菌梭菌增菌培养基促生长能力Cl. sporogenes哥伦比亚琼脂促生长能力Cl. sporogenes白色念珠菌沙氏葡萄糖肉汤促生长能力C.albicans沙氏葡萄糖琼脂促生长能力+指示能力C.albicans液体培养基促生长试验：接种少量（不大于100cfu）试验菌株至上述液体培养基中

29、，在规定温度下培养，时间应少于试验规定的最短培养时间，与之前已确认过符合要求的培养基比较，若培养基管中生长良好，判该批培养基符合规定 。固体培养基促生长试验：按非灭菌产品微生物检查：微生物计数法中平板计数表面涂抹法，每一平板接种不大于100cfu的试验菌，在规定温度下培养，时间应少于试验规定的最短培养时间，平板上生长的菌落与之前已确认过符合要求的培养基比较应一致。液体和固体培养基抑制试验： 接种至少100cfu的试验菌于相应的培养基中，按在规定温度下培养，时间不得少于试验规定的最短培养时间，试验菌应不得生长。培养基菌落特征指示试验：按非灭菌产品微生物检查：微生物计数法中平板计数表面涂抹法，每一

30、平板接种少量（不大于100cfu）的试验菌株 ，在规定温度和时间下培养，平板上生长的菌落形态特征与之前已确认过符合要求的培养基比较应一致。方法适用性确定试验 按供试品检查中的规定制备供试液。依控制菌检查的方法在规定的促生长培养基中接入供试品和相应的试验菌悬液，接种量不大于100cfu 。在规定温度下培养，时间应少于试验规定的最短培养时间，所加的试验菌依反应特征而被检出，。 供试品若有抗菌活性进行处理（见 非灭菌产品微生物检查：微生物计数法抗菌活性的去除或中和）。对于经试验确认的供试品，若对试验菌的抗菌作用按规定方法无法取消，那么可认为该供试品不可能受抑制的微生物污染。供试品检查耐胆盐革兰阴性菌

31、供试液制备与预增菌：取不少于1g的供试品，用胰酪胨大豆肉汤作为稀释剂按非灭菌产品微生物检查：微生物计数法的规定制成1：10供试液，混匀，在2025培养。培养时间要控制在使细菌充分恢复，但不增殖的范围内（通常25小时）。未检出试验：除另有规定外，取上述含有1g供试品的预增菌液接种至肠道菌增菌肉汤，3035培养2448小时。取上述培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，3035培养1824小时。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。定量试验选择和分离培养：取相当于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1mL、0.01mL和0.001mL）供试品的预增菌液或其稀释液分别接种至肠

32、道菌增菌肉汤中，3035培养2448小时。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，3035培养1824小时。结果判断；如果平板上有菌落生长，该培养物为阳性。记录供试品出现阳性结果的最小量和出现阴性结果的最大量，从表2查对供试品最大可能含有的菌数。表2 耐胆盐革兰阴性菌检查结果判断每管含样品的g或mL数每1g(1mL)供试品最大可能的菌数（N）0.10.010.001N103 102N10310N102N10大肠埃希菌供试液制备与预增菌：取不少于1g的供试品，按非灭菌产品微生物检查：微生物计数法的规定制成1：10供试液，取10mL供试液，或相当于1g或1mL供试品的供试液，接种到适

33、宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪胨大豆肉汤中，混匀，3035培养1824小时。选择和分离培养：振摇容器，取1mL上述胰酪胨大豆肉汤预培养物至100mL麦康凯肉汤中，4244培养2448小时。取少量麦康凯肉汤培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，3035培养1872小时。结果判断：麦康凯琼脂平板上若有菌落生长，表明可能存在大肠埃希菌（E.coli），应进一步试验确定。如果平板上没有菌落生长，或者虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。沙门菌供试液制备与预增菌：取不少于1g的供试品，按非灭菌产品微生物检查：微生物计数法的规定制成1：10供试液，取10mL供试液，或相当于1g或1mL

34、供试品的供试液，接种到适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪胨大豆肉汤中，混匀，3035培养1824小时。选择和分离培养：取0.1mL上述胰酪胨大豆肉汤预培养物至10mL RV沙门增菌肉汤中，3035培养1824小时。取少量RV沙门增菌肉汤培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上，3035培养1848小时。结果判断：若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上的菌落生长良好，红色、菌落中心带黑色或无黑色，表明可能为沙门菌。如果平板上没有上述形态的菌落生长，或者虽有生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出沙门菌。铜绿假单胞菌供试液制备与预增菌：取不少于1g的供试品，按非灭菌产品微生物检查：微生物计数法的规

35、定制成1：10供试液，取10mL供试液，或相当于1g或1mL供试品的供试液，接种到适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪胨大豆肉汤中，混匀。供试品若为透皮贴剂，用薄膜过滤器滤过相当于1贴供试品的供试液（按XIIIC.1非灭菌产品微生物检查：微生物计数法透皮贴剂供试液制备方法），取除滤膜转移至100mL胰酪胨大豆肉汤中，3035培养1824小时。选择和分离培养：取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，3035培养1872小时。结果判断：溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上若有菌落生长，表明可能存在铜绿假单胞菌，应进一步试验确定。如果平板上没有菌落生长，或者虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试

36、品未检出铜绿假单胞菌。金黄色葡萄球菌供试液制备与预增菌：取不少于1g的供试品，按非灭菌产品微生物检查：微生物计数法的规定制成1：10供试液，取10mL供试液，或相当于1g或1mL供试品的供试液，接种到适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪胨大豆肉汤中，混匀。供试品若为透皮贴剂，用薄膜过滤器滤过相当于1贴供试品的供试液（按XIIIC.1非灭菌产品微生物检查：微生物计数法透皮贴剂供试液制备方法），取除滤膜转移至100mL胰酪胨大豆肉汤中，3035培养1824小时。选择和分离培养：取上述培养物划线接种于甘露醇盐琼脂平板上，3035培养1872小时。结果判断：甘露醇盐琼脂平板上若有黄色菌落或周围有黄色

37、色素带的白色菌落生长时，表明可能存在金黄色葡萄球菌，应进一步试验确定。如果平板上没有上述形态的菌落生长，或者虽有生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。梭菌供试液制备与热处理：按XIIIC.1非灭菌产品微生物检查：微生物计数法规定制备供试液，取两份相当于不少于1g或1mL供试品的供试液，其中一份80加热10min后迅速冷却，另一份不加热。选择和分离培养：从两份供试液中各取10mL至两个容器（38mm×200mm试管）或其他盛有100mL梭菌增菌培养基的容器中，在厌氧条件下3035培养48小时。在哥伦比亚琼脂平板上对每一培养物进行传代培养，并在厌氧条件下3035培养48小时

38、。结果判断：有过氧化氢酶反应阴性的（带或不带芽孢）厌氧杆菌生长时，表明存在梭菌（Clostridia）。如果哥伦比亚琼脂平板上没有厌氧菌落生长，或者虽有菌落生长但过氧化氢酶实验阳性，该供试品检查结果符合规定。白色念珠菌供试液制备与预增菌：检查不少于1g或1mL的供试品，按XIIIC.1非灭菌产品微生物检查：微生物计数法规定制备供试液，取10mL供试液，或相当于1g或1mL供试品，接种到100mL沙氏葡萄糖肉汤，混匀，3035培养35天。选择和传代培养：在沙氏葡萄糖琼脂平板上对培养物进行传代培养，3035培养2448小时。结果判断：有白色菌落生长表明可能存在白色念珠菌（C.albicans ）可

39、采用适当的鉴定实验加以证实。如果沙氏葡萄糖琼脂平板上没有菌落生长，或者虽有菌落生长但鉴定结果阴性，该供试品检查结果符合规定。推荐溶液和培养基推荐溶液和培养基是药典规定的溶液和培养基，能满足污染微生物检测的需要，也可以使用其他和推荐培养基具有相似促生长能力和抑制特性的培养基。缓冲储备液：取34g磷酸二氢钾到1000mL量瓶，用500mL纯化水溶解，用氢氧化钠调节pH值至7.2±0.2，加入纯化水至量，混匀，分装至适宜容器、灭菌，28保存。pH7.2磷酸盐缓冲液：取纯化水和上述缓冲储备液按800:1(v/v)比例混合、灭菌。1、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液磷酸二氢钾3.6g二水合磷酸氢

40、二钠7.2g(相当于0.067M磷酸盐)氯化钠4.3g（肉或酪蛋白）胨1.0g纯化水1000mL按验证过的高压灭菌程序灭菌。2、胰酪胨大豆肉汤胰酪胨17.0g大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠（钾）2.5g一水合葡萄糖2.5g纯化水1000mL调节pH值使灭菌后25pH值为7.3±0.2，按验证过的高压灭菌程序灭菌。3、胰酪胨大豆琼脂胰酪胨15.0g大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g纯化水1000mL调节pH值使灭菌后25pH值为7.3±0.2，按验证过的高压灭菌程序灭菌。4、沙氏葡萄糖琼脂葡萄糖40.0g动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪

41、胨等量混合物10.0g琼脂15.0g纯化水1000mL调节pH值使灭菌后25pH值为5.6±0.2，按验证过的高压灭菌程序灭菌。5、马铃薯葡萄糖琼脂从200g马铃薯中的浸出物葡萄糖20.0g琼脂15.0g纯化水1000mL调节pH值使灭菌后25pH值为5.6±0.2，按验证过的高压灭菌程序灭菌。6、沙氏葡萄糖肉汤葡萄糖20.0g动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物10.0g纯化水1000mL调节pH值使灭菌后25pH值为5.6±0.2，按验证过的高压灭菌程序灭菌。7、肠道菌增菌肉汤明胶胰酶水解物10.0g一水合葡萄糖5.0g脱水牛胆汁20.0g磷酸二氢钾2.0

42、g二水合磷酸氢二钠8.0g亮绿15mg纯化水1000mL调节pH值使加热后25pH值为7.2±0.2，加热至100 30分钟，立即冷却。8、紫红胆盐葡萄糖琼脂酵母浸出粉3.0g明胶胰酶水解物7.0g复合胆盐1.5g氯化钠5.0g一水合葡萄糖10.0g琼脂15.0g中性红30mg结晶紫2mg纯化水1000mL调节pH使加热后25pH值为7.4±0.2。加热煮沸，不能在高压灭菌器中加热。9、麦康凯肉汤明胶胰酶水解物20.0g一水合乳糖10.0g脱水牛胆汁5.0g溴甲酚紫10mg纯化水1000mL调节pH值使灭菌后25pH值为7.3±0.2，按验证过的高压灭菌程序灭菌。

43、10、麦康凯琼脂明胶胰酶水解物17.0g（肉或酪蛋白）胨3.0g一水合乳糖10.0g氯化钠5.0g复合胆盐1.5g琼脂13.5g中性红30.0mg结晶紫1mg纯化水1000mL调节pH值使灭菌后25pH值为7.1±0.2，煮沸一分钟，并持续摇动，按验证过的高压灭菌程序灭菌。11、RVS肉汤大豆胨4.5g六水合氯化镁29.0g氯化钠8.0g磷酸氢二钾0.4磷酸二氢钾0.6孔雀绿36mg纯化水1000mL微热溶解，按验证过的高压灭菌程序灭菌，灭菌温度不能超过115。调节pH值使加热和灭菌后25pH值为5.2±0.2。12、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂木糖3.5gL-赖氨酸5.0g一

44、水合乳糖7.5g蔗糖7.5g氯化钠5.0g酵母浸出粉3.0g酚红80mg琼脂13.5g脱氧胆酸钠2.5g硫代硫酸钠6.8g梮橼酸铁铵0.8g纯化水1000mL调节pH值使加热后25pH值为7.4±0.2，加热至沸腾，冷至50倾注平皿，不能在高压灭菌器中加热。13、溴化十六烷基三甲铵琼脂明胶胰酶水解物20.0g氯化镁1.4g硫酸钾10.0g溴化十六烷基三甲铵0.3g琼脂13.6g甘油10mL纯化水1000mL加热煮沸1分钟，并振摇。调节pH使灭菌后25pH值为7.4±0.2，按验证过的高压灭菌程序灭菌。14、甘露醇盐琼脂胰酪胨5.0g动物组织胃蛋白酶水解物5.0g牛肉浸出粉1

45、.0gD-甘露醇10.0g氯化钠75.0g琼脂15.0g酚红25mg纯化水1000mL搅拌加热，煮沸1分钟，调节pH值使灭菌后25pH值为7.4±0.2，按验证过的高压灭菌程序灭菌。15、梭菌增菌培养基牛肉浸出粉10.0g胨10.0g酵母浸出粉3.0g可溶淀粉1.0g一水合葡萄糖5.0g盐酸半胱氨酸0.5g氯化钠5.0g乙酸钠3.0g琼脂0.5g纯化水1000mL取上述成分，加热煮沸使溶解，并持续振摇。如需要，调节pH值使灭菌后25pH值为6.8±0.2。按验证过的高压灭菌程序灭菌。16、哥伦比亚琼脂胰酪胨10.0g肉胃蛋白酶消化物5.0g心胰酶消化物3.0g酵母浸出粉5.0g玉米淀粉1.0g氯化钠5.0g琼脂10.015.0g（视凝胶强度）纯化水1000mL取上述成分，加热煮沸使溶解，并持续振摇。如需要，调节pH值使灭菌后为25pH值7.3±0.2，按验证过的高压灭菌程序灭菌。如有必要，冷至4550加入相当于20mg庆大霉素的无菌硫酸庆大霉素，混匀，倾注平皿。XIIIC.3非灭菌产品微生物检查：药品及药用材料微生物标准非灭菌制剂中存在的某些微生物可能降低药物活性，或使得药品丧失疗效，这些微生物也可能直接威胁到患者健康。因