细胞生物学实验手册2012-2013-1

1、 5细胞生物学实验手册（一）成绩 实验成绩构成分数评分细则备注预习报告3分不全或未完成扣3分一实验目的、二实验原理、三实验仪器与材料、四实验步骤、五注意事项课堂提问2分答错一次扣2分一实验原理、二步骤、三注意事项实验结果10分 10分8分，操作不规范扣2分基本操作规范、收拾试验台实验报告15分一、内容完整，对实验结果分析透彻 A+15分二、内容完整 A 12分三、内容构成不完整 B 10分四、凡抄袭他人和被抄袭发现者 一律C 5分六实验结果与分析、七作业、八思考题1、实验占期末总成绩30%，即30分；取七个实验的平均成绩为实验最终成绩2、分组名单：分ABC 三组，每组再分4小组3、请假：辅导员

2、签字的假条+提前一天电话请假（二）实验要点实验一 光学显微镜使用及显微摄影技术一、实验目的1、了解光学显微镜结构原理并熟练掌握其操作方法；2、掌握显微摄影技术操作流程3、了解部分细胞生物学中所使用的大型仪器设备的操作流程及用途。二、实验原理 显微镜的放大效能是由其照明系统所使用光的波长和透镜系统的数值孔径决定，缩短使用的光波长或增加数值孔径可以提高分辨率。 可见光的光波振幅较窄，因此使用较短波长的紫外光作为光源系统，可以提高分辨率。三、实验内容1、双目显微镜的操作规范：2、NIKON80i显微摄影系统的操作流程3、胶片放大洗印技术流程4、部分大型仪器设备介绍荧光显微镜 Fluorescence

3、 microscope暗视野显微镜 dark field microscope相差显微镜微分干涉差显微镜倒置显微镜 inverse microscope 显微操作仪透射电子显微镜 TEM四、作业1、学生应在生物实验课程中学习哪种能力2、希望在生物实验课程中学到哪些知识与技能注：以上两题任选一题，字数500字以上五、思考题1、暗视野显微镜的定义与应用2、相差显微镜的定义与应用实验二 血涂片的制备及细胞大小的测量一、实验目的：1、 掌握血涂片的制备技术2、 认识血液中红细胞和各类白细胞的形态3、 掌握目镜测微尺的使用方法二、实验原理：将血液样品制成单层细胞的涂片标本，经瑞氏吉姆萨染液染色后，不同白

4、细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。碱性粒细胞的颗粒呈蓝紫色，酸性粒细胞的颗粒呈7橘红色，中性粒细胞的颗粒呈粉红色。根据细胞中颗粒的颜色、大小及多少，再结合细胞的大小及细胞核的形态，就可以将白细胞进行分类计数。三、实验步骤（一）血涂片的制备1、消毒与取血消毒 先按摩取血部位,使血流通畅;再用酒精消毒采血针和取血部位(如指尖).取血 待酒精干后,刺破皮肤,使血自然流出,勿挤.2、推片 取一块边缘光滑的载片做推片.将其一端置于血滴前方,向后移动到接触血滴,使血液均匀分散在推片与载片的接触处.然后使推片与载片呈30°40°角,向另一端平稳地推出 ,迅速在空气中摇,使之自然干燥.3、染

5、色 加瑞氏吉姆萨A染液12滴，染色1分钟，再将瑞氏吉姆萨B染液滴加于A液上面（滴加之量为A液的23倍），染色510分钟。最后用蒸馏水把染液冲掉,用吸水纸吸干,自然干燥后,即可镜检观察4、观察.四、注意事项 玻片的清洗: 使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面,以保持玻片清洁,干燥,中性,无油腻. 细胞染色对氢离子浓度十分敏感,在染色过程中玻片必须化学清洁,配制瑞氏染液必须用优质甲醇,稀释染液必须用缓冲液,冲洗用水应近中性, 否则各种细胞染色反应异常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误. 染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关.染液越淡,室温越低, 细胞越多,所需染色时间越长或应适当增加

6、染液量,因此染色时间应视具体情况而定.特别是更换新染料时必须经试染,摸索最佳染色条件. 染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净.冲洗时应用流水将染液冲去,不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上.测微尺的使用显微测微尺是用来测量细胞在显微镜下长度的工具,由目镜测微尺和镜台测微尺组成,两尺配合使用.计算细胞、细胞核体积的公式： 圆 形 V=4/3r 3(r为半径) 椭圆形 V=4/3ab2(a、b为长、短半径) 核质比 ND=Vn(VcVn)(Vn为核的体积，Vc是细胞质的体积)五、作业题v 1、制备一张血涂片，观察并描述其中各类血细胞的形态特征v 2、任选20个红细胞，测量其直径，并

7、计算出平均值六、思考题从外观来判断，一张好的血涂片有哪些特征？实验三 细胞凝集反应及细胞膜的渗透性一、实验目的了解细胞膜的表面结构;了解细胞膜的渗透性及各种物质进入细胞膜的速度二、实验的原理1. 细胞凝集反应细胞质膜是由蛋白质不同程度镶嵌在脂双层中所形成的动态流动结构，蛋白质和脂类分子又与寡糖链结合为糖蛋白和糖脂分子，糖蛋白和糖脂分子伸至细胞表面的分枝状寡糖链在质膜表面形成细胞外被（又称为糖萼）。凝集素（1ectin）是一类含糖的（少数凝集素例外）并能与糖进行专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素促使细胞凝集主要是由于它能与细胞外被的糖分子相连接、在细胞间形成“桥”的结

8、果，且加入与凝集素互补的糖分子可以抑制细胞间的凝集反应。2. 细胞膜的渗透性细胞膜(cell membrane):又称质膜.细胞表面的一层薄膜. 厚度通常为78nm，由脂类和蛋白质组成，还有一类碳水化合物，我们知道糖类物质也属于碳水化合物的范围。细胞膜把细胞包裹起来,使细胞能够保持相对的稳定性,维持正常的生命活动.它最重要的特性是半透性，或称选择渗透性，对进出入细胞的物质有很强的选择透过性，它可以选择性的让某些分子进入或排出细胞。这是细胞膜最基本的一种功能.如果细胞丧失了这种功能,细胞就会死亡.三、作业题（1）绘制简图，表示血细胞的凝集过程； （2）图示血细胞凝集的原理。试管编号是否溶血时间结

9、果分析1)5ml氯化钠+0.5ml稀释鸡血   2)5ml氯化铵+0.5ml稀释鸡血   3)5ml硝酸铵+0.5ml稀释鸡血   4)5ml草酸铵+0.5ml稀释鸡血   5)5ml葡萄糖+0.5ml稀释鸡血    6)5ml甘油+0.5ml稀释鸡血    7)5ml乙醇+0.5ml稀释鸡血    8)5ml丙酮+0.5ml稀释鸡血   四、思考题加入凝集

10、素的细胞会凝聚在一起，加入何种物质能抑制细胞凝集？实验四 叶绿体的分离与荧光观察一、荧光显微镜的基本结构、原理、操作方法二、荧光显微镜使用步骤光学观察1开电源 2按预置开关. 3将ND8 ,ND32, NCB11减光片，色温片移入光路4推入光路转换杆，使光路充满双目镜筒5转动激发方式转换盘放空位处 6将聚光镜升到最高位 7全部开启视场光阑和视场光阑 （使用1-100X聚光镜时，将顶透镜置入光路）8将10X物镜置于光路中9放置标本并将要观察部分置于光路中 10对标本调焦 11调节视度和瞳孔距离. 12聚光镜聚焦和对中.13转换到所需的物镜观察标本每次转换物镜时，都要调节视场光阑和孔径光阑（视场光

11、阑: 调到刚好外切视场 ；孔径光阑: 物镜数值孔径（N.A）的70%至80%）14观察完毕后，关闭电源. 荧光观察1执行“光学观察”中的步骤1至11。2降低聚光镜或移开聚光镜并在它位置装上遮光管。3关闭显微镜电源开关。4关闭光闸和阻断落射照明光组。5将要使用的激发法相应荧光块移入光路。6完全打开落射照明装置的视场光阑和孔径光阑7打开落射照明装置光源的电源开关照后打开光闸，对中照明灯8将10X物镜置入光路。9放入标本并将要观察部分移入光路中。10对标本调焦。 11将落射荧光装置的视场光阑对中心。. 12转换到需要的物镜并观察标本。 * 用落射荧光装置的ND减光片调解亮度。 * 调节视场光阑使其刚

12、好外切视场。 * 用孔径光阑调节图像亮度，使用孔径光阑之前，先完成它的对中。 * 使用油浸物镜时，在标本和物镜间滴入浸油。13回复到明场显微术 * 关闭落射照明装置的光闸并阻断落射荧光光线。 * 旋转激发法转换盘将无荧光滤光块的位置移入光路 * 如果没有装上聚光镜装上聚光镜，然后进行聚光镜的对中和调焦（参阅明场显微术12节） * 打开显微镜电源开关转到透射光源14完成观察后关掉所有电源开关三、叶绿素的自发荧光和叶绿体的间接荧光原理某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止

13、供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。四、作业题1

14、、绘制荧光观察结果，标明所观察到的生物大分子（DNA、RNA等）位置、形状及颜色，并分析原因。2、概述滤镜系统的选用原则。五、思考题1、分离细胞组分时，为什么要加入0.35mol/L 氯化钠？实验五 DNA的Feulgen染色一、Feulgen反应的原理二、操作方法Carnoy液固定12h温浴至60的1 mol/L HCl溶液中水解8 min蒸馏水冲洗3次（使水解停止）Schiff试剂中染色30min用漂洗液洗35次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料)蒸馏水洗3次压片镜检三、作业题1、绘图表示Feulgen反应的染色结果，标明组分及颜色四、思考题1、总结Feulgen反应染色结果的影响因素

15、。2、在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？实验六 石蜡切片技术一、石蜡切片操作基本过程石蜡切片的制作过程主要包括：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏等步骤。 1取材 材料的好坏直接影响到切片的质量，无论取哪一种动植物材料，以下几点是必须注意的。 （1）植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分；动物材料取用时常对动物施以麻醉，常用的麻醉剂有氯仿和乙醚，或将动物杀死后迅速取出所需要的组织。 （2）取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。 （3）切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。

16、（4）切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5×5mm2。 2固定 固定剂的作用对象主要是蛋白质，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作时不加考虑，如要观察这些物质，可用特殊的方法将其固定下来。 固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。这些作用的好坏、大小，都依所固定的材料性质而定，同样一种固定液对某一材料来说是良好的，但对另外一些组织可能就不很适用。良好的固定剂必须具备的特征是：穿透组织的速度快，能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质，不使组织膨胀或收缩以保持原形，硬化组织的程度适中，增加细胞内含物的折光度，

17、增加媒染和染色能力，具有保存剂作用。 固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分。 简单固定剂即单一的固定剂，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。其中，苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。 简单固定剂的局限性较大，如将其适当混合，制成复合固定剂可以取得更好的效果。固定时，须注意以下几点： （1）固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的1015倍。 （2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质，可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟，再移入水溶性的固定液。 （3）材料固定后如不立

18、即下沉，可将其中气泡抽出。 （4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几十小时，有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强，作用时间应严加控制，不能过长。 （5）一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合。 （6）固定完毕，根据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。 3脱水 生物组织中含有大量的水分，它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除尽，这就是脱水的作用。 脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般组织从30乙醇开始

19、，经过50、70、80、95、100至完全脱水；对于一些柔软的组织应从15开始。脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。 4透明 组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。 透明剂的种类很多，较常用的是二甲苯、甲苯、

20、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。 二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果，在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，这样可减少上述的缺点。透明时间应由组织大小而定，般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。 甲苯的一般性质与二甲苯相似。用法亦同

21、，唯沸点较低，透明较慢，但不会使组织变脆。 5透蜡和包埋 包埋用的石蜡，熔点在5060之间，应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。一般动物材料最常用的石蜡熔点为5256，植物材料的用5458的；切片薄的用5860的，切片厚的则用5254的；室温1019时选用5254的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点4648的石蜡，夏季可选5658的。 透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理23次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需1530min。 透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡

22、凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。 包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是:先准备好纸盒（具体折法见图1-3及说明），将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。 包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶，以后切片时引起碎裂。 6切片 （1）石蜡块的固着与整修 在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。 固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的

23、金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。 整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽23mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。 （2）切片机和切片刀 切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块

24、上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。 切片刀与切片的质量直接相关。切片前必须磨刀，方法是：将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴少许石蜡油在平滑的磨刀石上，将刀贴着磨刀石以背向刀口方向磨，使用完毕后应及时用二甲苯将石蜡油擦净。 （3）切片方法 切片前，将刀口置放大镜下观察，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易

25、损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。 7贴片 切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。 贴片一般有捞片法和烫板法。 捞片法 比较简单，首先将切

26、片分割开，投入到48的温水浴中，这时切片都浮在水面上，由于表面张力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（将鸡蛋一个打破入杯中，去除蛋黄留下蛋白，用筷子充分调打成雪花状泡沫，然后用双层纱布过滤至容器中，加入等量的甘油，混合，最后加入百分之一体积的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存几个月到一年。）或5明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于室温下放置一昼夜后使其彻底干燥。 烫板法 将涂有粘片剂的载玻片上涂上水，把已分割好的切片贴上去，再置载玻片于35恒定的烫板上让切片摊干，并倾斜或用吸水纸吸去水分，最后将载玻片再度放烫板上晾干。 要注意，不管是使用

27、捞片法还是烫板法，所用的载玻片必须洁净，不能有油污（检验法：已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水，若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示载玻片不清洁，有残留油脂等物在上面）；切片的光面应朝下，否则染色过程中切片容易脱落。 8染色 组织切片是无色透明的，必须进行染色后才能观察到各种微细结构。染色方法很多，但是染色剂往往是水溶液，因此切片必须经过脱蜡而再度复水。这方法即为脱水、透明的逆过程。由于切片十分菲薄，处理的时间大大减少，一般每级停留约25min。 本次实验采用HE染色法。（1） 切片在二甲苯中脱蜡510分钟。（2） 移入二甲苯和纯酒精（11）混合液中5分钟左右（如经二次二甲苯脱蜡，此步可略）

28、。（3） 入100、95、85、70酒精，各级为25分钟。最后经蒸馏水转入染液。（4） 苏木精染液染色515分钟。（5） 水洗玻片上多余染液，0.51盐酸酒精（70酒精配制）分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟。（6） 流水冲洗1530分钟，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色。（7） 蒸馏水短洗。（8）0.10.5伊红染液染色15分钟，若着色困难，可在每100毫升染液中加入12滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。（9）依次经70、85、95、100酒精脱水，各级为23分钟，在95以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。（10）二甲苯透明（二次），共约

29、10分钟9透明 染色后的切片须再次经过脱水、透明。标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地显示出来。 10封藏 封藏的目的是使制成的切片能够永久保存，封藏剂必须能与透明剂互溶，对染色无影响，折射率近似玻璃和具有粘性的物质，常用的封藏剂有加拿大树胶和中性树胶。 封片的方法是：将载玻片从二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶，仔细覆盖上盖玻片，避免产生气泡，也不得拖动盖玻片，以免将标本破坏。树胶量视盖玻片大小而定，勿使过多过少。 贴上标签，注明材料、染色法，待封藏剂凝固后便成为一张成功的石蜡切片。 二、掌握HE染色的基本原理和染色方法。

30、三、作业题1、每组一张石蜡切片，根据结果给分。四、思考题1、固体石蜡选用标准是什么，如果是新石蜡，怎样改善石蜡品质？2、比较动物、植物和脂类三种石蜡切片制作过程的异同？实验七 电子显微镜技术一、透射电镜的基本结构 透射电镜的基本结构由电子光学系统（简称镜筒）、真空系统、电子光学系统三部分组成。电子光学系统由照明系统、样品室、成像系统、观察窗和记录用的照相机等组成。透射电镜的镜筒是由电子枪、68级电磁透镜（electron magnetic lenses）及一些光路元件组成的密闭圆筒，可以控制电子束的形状和发射强度，是透射电镜的核心。电子枪发射电子波作为“光源”，而电磁透镜则能控制电子的轨道，因

31、为电子是带电的，所以电磁透镜能够改变电子束的方向。在透射电镜中有五个电磁透镜，根据每个磁场的功能并沿用光镜的称谓习惯，自上而下依次称为：第一和第二聚光镜、物镜、中间镜（23级）和投影镜。样品置于末级聚光镜和物镜之间。观察室和照相室在投影镜下方。透射电镜有庞大的供电系统和真空系统，其中真空系统是用两种类型的真空泵串联起来，从而获得电镜镜筒中的真空，当电镜启动时，第一级旋转式真空泵获得低真空的二级采用油扩散播泵而获得高真空。 A B 图1A 普通光学显微镜 B 透射电子显微镜二、透射电镜的基本工作原理 一般生物样品的透射电镜图像，可以用“质量厚度”（mass-thickness，t）反差成像原理作

32、简单描述。电镜的镜筒内建立强加速场，生物样品常采用60100kV的加速电压。电子枪阴极发射出的电子在加速场中获得速度和能量，足以透射过5070nm厚的生物样品并使之成像。聚光镜使来自电子枪的电子束聚焦，并常以散焦的状态泛光式地照射在样品上。此时，入射电子束与样品原子之间相互作用发生一种物理现象电子散射（electron scattering）。在电子散射过程中，大部分电子直接透过样品，称为直接透射电子（transmission electron，TE）；有一部分电子在穿透样品过程中不仅改变运动方向，而且可能还损失能量，这些TE称为弹性或非弹性散射电子（elastically scattered

33、 electrons，inelastically scattered electrons）。样品结构的“质量厚度”（t）越高，元素的原子序数越大，电子散射越强，TE中的直接透射电子越少，而弹性或非弹性散射电子越多。样品下方设计了一个 3080m的小孔称“反差光阑”（contrast aperture），拦截（吸收）掉散射强的电子，而使直接TE及部分弱散射电子通过。这样，能通过光阑进入成像系统的TE就带有样品上的微细结构信息了。相对t高的结构区域，电子散射强，能通过“反差光阑”进入成像系统的TE少，反之，则多。这些TE经过几级成像透镜的放大，由末级投影镜投射到观察室荧光屏上，激发荧光屏发出可见光

34、。TE多，荧屏亮，TE少，荧屏暗。屏点的亮暗程度一一对应着样品微细结构t的高低。这样，生物样品的透射电子显微图就形成了，其图像分辨率（resolution）比透射电镜的分辨本领（resolving power）差一个数量级。事实上，透射电镜成像机制比上述复杂得多，尤其对原子尺度的透射电子显微成像，则必须用波的传输理论解释，相关理论和技术属于高分辨率电子显微学的范畴，不在此讨论。 三、使用操作程序1）打开电源，抽真空。 2）照明系统（电子枪+聚光镜）合轴。 3）取放样品。 4）加速电压选择、物镜光阑选择、观察区域选择、放大倍数选择、图像聚焦及拍照记录。 5）关机操作。 四、透射电子显微镜样品制备

35、1、试剂配制 1）0.2molL PBS：A液：磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）35.61g加双蒸水溶 解至1000ml。B液：磷酸二氢钠（NaH2PO，·2H2O）31.21g加双蒸水溶解至1000ml。 根据不同要求，按不同配比，可得不同pH值的0.2molL的PBS，见下表： 表2-1 不同配比的PBS的pH值 pH（25）7.0 7.2 7.4 7.6 A液（ml） B液（ml） 30.5 19.5 36.0 14.0 40.5 9.5 43.5 6.5 2）2.5戊二醛（C5H8O2）固定液：25戊二醛10ml，0.2mol / L PBS 50 ml，加双

36、蒸水40 ml。 3）1四氧化锇（OSO4）固定液。 2贮存液：取1g OSO4安瓿泡酸48h，冲洗48h，双蒸水漂洗30min。干后用玻璃刀刻划12道痕，置入棕色磨口瓶，加双蒸水50ml，用力摇动使安瓿破碎。静置48h OSO4溶解后备用。4避光保存。 1使用液：取2Os O4贮存液10ml，加0.2mol/L PBS l0ml混合。 4）不同浓度的乙醇溶液：用无水乙醇稀释成90、80、70、60、50的乙醇。 5）90丙酮用无水丙酮稀释。 6）环氧树脂Epon812包埋剂（Luft配方）：A液：Epon812 612ml，DDSA10ml。B液：EpOn812 10ml，MNA 8.9ml

37、。 使用时根据不同硬度要求按一定比例（1:11:9）混合，A液多，则软。AB液混匀后，逐滴加入DMP-30，其浓度控制在12。边加边搅，充分搅拌30min左右。 7）醋酸铀染液：醋酸双氧铀UO2（C2H3O2）2·2H2O（Uranium acetate）溶于5070乙醇溶液中至饱和，静置12天，使未溶的部分沉淀，取上部黄色透明溶液用，避光保存。 8）枸橼酸铅溶液：A液：硝酸铅Pb（NO3）2（必须为新近产品）1.33g，枸橼酸钠（Na3C6H5O7·2H2O） 1.76g，双蒸水（用前加沸冷却）30ml，充分摇匀，混悬液为乳白色枸橼酸铅铬合物。B液：氢氧化钠（NaOH）

38、lmolL。 使用液：A液配制完毕30min后，加B液8ml，加双蒸水至50ml混匀，溶液清亮（pH 12）。如有沉淀，离心后再用。最多保存半年。 2、超薄切片制备 1）取材 将动物处死后，要快速取出组织，以免细胞内部细微结构发生改变。取材过程要注意以下几点：取材部位要准确；无人工损伤，不要牵拉、挤压，样品块要小，一般切成lmm3的小块，起码在某一个方向上的厚度要小于lmm，组织离开活体后尽快（1min之内）进入预冷的戊二醛固定液中（4）保存。 2）固定 固定是电镜样品制备中最重要的一环，其目的是使细胞生命过程立即终止，使细胞结构和化学成分保持生前状态。电镜材料固定一般采用双重固定法，即先用戊

39、二醛进行前固定， 然后再用锇酸进行后固定。两次固定之间要进行漂洗。 （1）前固定：将取的材料立即投入预冷的25戊二醛溶液中，4条件下固定3h。若不马上进行后面的制备程序，可保存在0.2mol/L的PBS中或2.5戊二醛溶液固定液中（4）。 说明：戊二醛（C5H8O2）分子量为100.12，是一种五碳双醛，市售浓度多为25水溶液，无色透明，pH 4.05.0。氧气、高温、中性或碱性均可使其失去醛基，应低温、密封保存。两个醛基与蛋白质、核酸等的氨基发生交链作用，可以较好地固定蛋白质、核酸和多糖等，能保存微管、糖原、核蛋白和细胞基质等，不易使酶失活，可以用于细胞化学研究，但不能固定脂类，对脂质颗粒、

40、膜结构等保存不好。如果对保存超微结构（尤其膜系统）有较高的观察要求，经戊二醛溶液单固定的样品不宜保存过长时间，在1周内进入常规制备程序为好。2.5的戊二醛固定液对组织的平均渗透深度为0.6mm，这是取材要小的原因之一。 （2）锇酸后固定：进行后固定以前，材料要用0.02molL PBS漂洗3次，每次 l0min。避免戊二醛与OSO4发生氧化还原反应，生成沉淀，所以要彻底洗干净。漂洗后取出，转入1OSO4固定液中，4条件下固定12h。说明：四氧化锇（OSO4）分子量254.2，呈淡黄色结晶，其水溶液呈中性。对氮有较强的亲和力，能与蛋白质氨基迅速结合形成交链化合物，对含蛋白质的各种结构成分均能固定

41、。能与不饱和脂肪酸反应，生成四氧化锇二酯化合物，使含有脂类的结构固定。因为锇是一种高原子序数元素，在用OSO4固定样品的同时，还起到一种电子染色作用。但是，OSO4不能固定核酸，对糖原、微管等保存不好。同时，OSO4又是酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究。OSO4固定时间太长，不仅易丢失成分，而且会使组织变脆，难切片。OSO4具有极强的挥发性和毒性，在任何污染和光照条件下，都可能还原成水和二氧化物而减弱固定效果，故不易长期保存，呈棕色或黑色时，均被认为。1OSO4固定液对组织的渗透深度比戊二醛还差，有实验证明仅在0.250.5mm深度内有迅速均匀的固定，稍大的组织易形成固定梯度。 3）脱水 （1

42、）将OSO4固定后的材料取出，在脱水以前要进行漂洗。先用吸水纸吸干净OSO4固定液之后，用0.2molL的PBS漂洗3次，每次10min。以避免在脱水时OSO4与乙醇产生氧化还原反应，生成沉淀，所以要彻底洗干净。 （2）将漂洗后的材料依次放入50乙醇、60乙醇、70乙醇、80乙醇、90乙醇、90乙醇与90丙酮的1:1混合液、100丙酮，每级1520min，使组织中的水分充分除去。说明：脱水剂一般用乙醇、丙酮和环氧丙烷等，利用它们具有能与水也能与包埋剂混溶的特点，以取代样品中的水分，使水分充分除去。浓度梯度脱水是为了减少样品收缩。 4）浸透 经脱水后的材料在包埋以前要经过浸透处理，即用包埋剂与脱水剂按浓度梯度分级换液，使包埋剂逐渐取代脱水剂渗透到组织中去，最终使组织细胞内所有空隙均充满包埋剂。具体操作方法：在室温下或37条件下将样品置入3:1的100丙酮溶液与包埋剂的混合液，1030 min；1:1的100丙酮溶液与包埋剂混合液，3060min；1:3的100丙酮溶液与包埋剂混合液，12h或过夜；纯包埋剂，25h或过夜。 5）包埋 包埋的目的是让样品材料获得一定的硬度、弹性和韧性，以便制成超薄切片。操作过程如下：在包埋模具内滴一滴包埋剂，把样品置入并使之定位于合适位置（依模具而