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文档简介
1、CIK细胞治疗慢性乙型肝炎现状 (一)概述 免疫细胞功能异常是造成HBV、HCV持续感染的主要原因之一,免疫细胞包括固有免疫(天然免疫)和特异性细胞免疫,其中涉及到的细胞包括自然杀伤细胞(NK细胞)抗原提呈细胞(APC)、T淋巴细胞(CTL)等。 人体天然免疫的免疫细胞主要为NK细胞和NK T细胞,其非特异性天然免疫作用在机体抗感染、抗肿瘤以及自身免疫性疾病中,特别在慢性HBV、HCV感染的地位日益受到重视,认为与特异性免疫系统作用同等重要。
2、160; NK细胞来源于骨髓,发育成熟依赖于完整的骨髓微环境。分布在肝、脾和外周血,骨髓中含量很少。血液中NK细胞分主群和次群,主群为CD16+ CD3 ,占外周血淋巴细胞的10%,次群为CD16 CD3+、占外周血淋巴细胞的5%。NK细胞在肝脏中约占肝脏淋巴总数的35%。 NK细胞名称 通常称自然杀伤细胞。 稞细胞:无T、B细胞的特有标志TCR或膜Ig。 大颗粒淋巴细胞:形体较大,胞质内含较大的颗粒。
3、160; 自然杀伤细胞:具有杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞等活性作用。 NKT细胞:是一类同时表达恒定的T细胞受体(TCR)a、和NK细胞标志的CD4CD8、或CD4+ CD8的T细胞, NKT细胞约占肝内淋巴细胞总数的20%30%,当NKT细胞活化后能迅速产生高水平的IFN-。 (二) NK/NKT抗病毒、抗肿瘤作用的机制 1、慢性HBV、病毒持续复制和宿主天然免疫和特异性免疫功能缺陷、低下及紊乱是疾病迁延不愈的两大
4、主要原因。清除病毒,缓解肝脏病变,除了积极合理地应用抗病毒药物长期抑制病毒复制之外,增加自身免疫细胞数量、提升免疫细胞作用,是清除病毒、治愈肝病的关键。 2、NK细胞的作用一: 最主要的天然免疫效应细胞群,承担着非常重要的免疫监督功能。其针对病毒感染细胞的作用特点: 不需要特异性的抗原激活NK细胞; 某些细胞因子、靶细胞表面结构、免疫复合物等可直接诱发NK细胞发生免疫反应;
5、160;免疫反应迅速,可在数小时或1天内达到高峰; NK细胞的作用二: 在抗病毒感染中主要是直接杀伤被病毒感染的细胞,在这类细胞中有损伤作用; 是免疫调节细胞,作用于CD4+细胞和CD8+细胞,强化机体细胞免疫; 通过其具备的CD16分子辅助B细胞诱导体液免疫; 分泌大量的具有抗病毒效应的炎症因子。 3、NKT细胞的作用机
6、制:具有一定NK细胞功能特征的T细胞亚群,大部份NKT细胞可能在外周免疫器官中形成。NKT细胞的激活可抑制HBV复制。NKT细胞抗病毒作用机制: 与NK细胞不同,NKT细胞主要通过Fas配体系统发挥细胞毒作用; NKT细胞激活后分泌IL-4和IFN-调节Th细胞诱发免疫反应; 活化其他淋巴细胞进一步抗病毒。 NKT细胞不识别病毒抗原,体内NKT细胞不被清除,如能激活慢性HBV、HCV感染者肝内NKT细胞,NKT细
7、胞天然免疫反应将打破HBV感染免疫耐受状态的特异性T细胞应答的一种补偿。 4、肝脏NK/NKT细胞抗病毒作用 肝脏是机体免疫中起重要作用,肝脏内的免疫系统亦包括天然免疫和特异性免疫二个组成部份。包括淋巴细胞的天然免疫细胞(NK/NKT淋巴细胞占肝脏淋巴细胞的2/3)和特异性免疫细胞(T.B淋巴细胞)。 肝脏的免疫状态影响慢性HBV、HCV感染的病程和转归,慢乙肝、慢丙肝患者体内发生天然免疫、特异性免疫反应的耐受多发生在肝脏组织中。
8、160; 慢乙肝天然免疫损伤:慢乙肝患者 体内NK/NKT淋巴细胞亚群的功能呈下降趋势,但在慢乙肝患者体内。 IL-2下降。 活化的NK细胞及CD8+T淋巴表面的IL-2Ra链分离水平明显升高,妨碍了由IL-2诱导的免疫反应,造成肝脏内NK细胞的活化障碍。 慢乙肝特异性免疫损伤:表现为T淋巴细胞功能耗竭,即从患者外周血分离出来的病毒特异性T淋巴细胞大部份失去了增殖和产生细胞因子的能力,细胞毒作用也降低
9、,产生T淋巴功能耗竭的因素: 病毒的持续存在和抗原长期作用; 辅助性CD4+细胞的数量减少,Th2漂移; DC的成熟障碍,成熟的mDC表达CD80、CD86降低,对T淋巴细胞刺激能力降低。 慢乙肝肝脏免疫耐受,发生肝脏免疫耐受的原因: 肝脏占优势的NK、NKT细胞群具有招募外周血循环中T淋巴细胞的作用,这些招募来的活化的T淋巴易于发生凋亡;
10、160; 肝窦内皮细胞(LSEC)通过捕获和杀伤活化的特异性淋巴细胞,终止免疫反应; 慢乙肝后肝脏微循环改变mDC的成熟障碍,不成熟的DC易诱导耐受的发生。 5、NK/NKT细胞与其他免疫细胞、细胞因子关系的研究 在慢性HBV,肝硬化、肝癌患者体内NK细胞数及活性均受抑制,HBV、HCV持续复制部份原因应归结于病毒抑制了NK细胞。至于外周血NK细胞数量降低,是发生在患者感染HBV以前还是之后,目前尚无定论。
11、160;多种细胞因子可以诱导NK成为杀伤细胞 (CIK),外周血单个核淋巴细胞在体外经IFNr等细胞因子的诱导成CIK细胞,NKT淋巴细胞比例显著上升,可达50%以上。激活的CD8+ T细胞、CD8+、CD56+、NKT细胞数量和比例都大幅度提高,细胞激活标志CD25表达百分率也增加。 6、NK、NKT细胞与DC细胞间的关系 树突状细胞(DC)作为专职抗原递呈细胞,在抗HBV、HCV中的作用已十分明确, NK细胞与DC相互作用后能维持机体自稳状态和协助抗病毒感染。DC产生的IFN-a 介导NK
12、细胞能释放IFN-r,其途径可能: NK细胞激活依赖IL-12和DC产生的其他细胞因子或分子; DC产生的IL-2联合其他细胞因子增强NK细胞功能。 不同来源的DC细胞因子与激活NK细胞功能有不同:单核细胞源性DC分泌IL-12、P70诱导NK细胞激活,增殖,细胞毒性和CD56上调。而CD34+造血干细胞来源的DC。提供的辅助因子(IL-15和IL-18),促进NK细胞增殖和存活。 7、CIK疗法临床抗HBV、H
13、CV的进展 “CIK”是英文cytokine induced killer的简称,中文翻译名为“细胞因子诱导的具有NK细胞样作用的杀伤细胞”。 我国1999年进行肿瘤和肝炎的研究,2002年7月批准正式应用肝癌的治疗,2004年被有关部门批准病毒性肝炎的治疗。 8、CIK细胞抗肿瘤,抗病毒作用的机制 CIK细胞疗法是过继性免疫疗法之一,在多种细胞因子IL2,IL1、IFNr,抗CD3单克隆抗体等诱导下将从外周血,
14、骨髓或脐血中分离出的淋巴细胞群,经过一定时间的培养而获得的一种具有NK细胞作用的活性免疫细胞,以CD3+ 、CD56+ 细胞为主,能识别多种肿瘤细胞和病毒感染的细胞,通过与靶细胞直接接触、杀伤或分泌IFNr、TNFa,IL6等多种抗肿瘤和抗病毒的细胞因子,抑制杀伤肿瘤细胞和病毒的复制。CIK细胞分泌的细胞因子能有效调节机体的免疫功能。 CIK细胞抗肿瘤、抗病毒主要通过以下3条途径:通过颗粒酶、穿孔素作用直接杀伤肿瘤和病毒感染细胞;释放细胞因子(IFN-r、TNF-a、IL-L)提高机体免疫功能,抑制肿瘤生长、病毒复制;通过Fa
15、s/FasL凋亡途径,诱导肿瘤细胞,病毒感染细胞的凋亡,见下图。 CIK细胞作用特点 CIK细胞的有效性 CIK细胞培养容易,经体外诱导培养后可以几十倍甚至上百倍增长,健康人可扩增到152.667×107,肝癌患者达147.5×107。 细胞表型发生改变,表现为CD3+T细胞,CD3+ CD8+ T细胞、CD25+T比例增高,从培养前20%上升到60%80%。
16、; NK细胞与IL2结合后可杀死对NK细胞原不敏感的肿瘤细胞、病毒感染细胞等靶细胞。 CIK细胞的效应细胞中CD3+ CD56+细胞外周血中极其罕见,培养后CD3+ CD56+细胞增加1000倍以上。 CIK细胞治疗慢乙肝后肝硬化43例,治疗后33例HBVDNA阳性中12例转阴(36.4%),部分患者拷贝数下降。10/16例HBeAg阴转(62.5%)3例HBeAg血清转换(18.8%),部分肝功能好转,表现为ALT、IBiL下降、血清白蛋白上升。&
17、#160; CIK作用的专一性:回输的自体CIK细胞更具针对乙肝病毒的特异性和靶向性;具有识别病毒感染细胞能力,对HBV产生直接、主动、精确定向的攻击,有效攻击HBV感染细胞而清除病毒。 CIK细胞疗效的持续性: CIK 细胞治疗是免疫细胞的治疗,通过免疫细胞数量增加、细胞表型改变、功能的增强来发挥天然免疫细胞的功能,起到直接杀伤病毒,产生细胞因子促进整体的天然免疫和特异性细胞免疫作用,从根本上解决了慢乙肝感染的免疫耐受、缺陷、低下。
18、0; CIK细胞的安全性: CIK细胞来自患者自体细胞,不会产生排斥反应,安全性好,无论理和法律问题。 CIK细胞经过病毒抗原的修饰、致敏,其作用仅对HBV感染的肝细胞有攻击作用,对正常肝细胞无损害,这种方法治疗慢乙肝肝硬化,不仅HBVDNA下降,HBeAg转阴,肝功能ALT、AST、TBIL白蛋白均有明显改善。 9、CIK细胞治疗的适应症 年龄16岁65岁。
19、60;确诊为慢乙肝、慢丙肝、肝功能正常或异常,但ALT400u/L,TBiL85umol/L。 慢乙肝、慢丙肝抗病毒治疗效果不佳或反弹,包括初治失败,病毒变异或耐药者。 慢乙肝、慢丙肝后肝硬化代偿期患者。 早、中、晚期肝癌,包括已转移的患者,手术切除、放疗、化疗等治疗前后及肝移植前患者,由于病情已不适其他治疗的患者。 10、禁忌症 肝硬化患者严重失代偿,高度腹水,有上
20、消化道出血史者。 肝功能明显异常者:胆红素(TBiL)85umol/L(慢性肝炎患者45umol/L)谷丙转氨酶(ALT)400u/L,凝血酶元活动度(PTA)50%,血小板(PLT)40×109/L。 酒精性、药物性及自身免疫性肝病。 合伴有恶性肿瘤、艾滋病、精神疾病及严重的心脑血管疾病,糖尿病、肾功能不全者。 对注射有严重过敏史的过敏体质者,正在使用免疫抑制药物或器官移植后长期使用免疫抑制剂的患者。
21、 有明确感染如结核、细菌感染者或有发热者。 孕妇或哺乳期妇女,育龄妇期患者接受治疗时必须坚持避孕。 11、CIK细胞治疗的步骤一: 治疗前检查肝功能,乙肝二对半(定量),HBVDNA定量,血常规,凝血功能等常规项目。 用成分血分离采血机(spectrav6.1)采集患者外周血单核细胞,采集细胞数(1-4)×109,体积大约4070ml,采集时间约需45分钟。
22、 将采集到的细胞在符合GMP实验室条件下进行处理、培养、诱导、激活,用无血清培养基调整细胞浓度至(1-2)×106/ml(进口无血清培养基,不用外源性血清培养,避免了交叉感染的可能性)置于透气性培养袋中,在不同时间内加入一定剂量的rhIFNr、IL2、antiCD3mAD等各种细胞因子,37,5%CO2悬浮培养,所有操作过程均在严格无菌条件下进行,此过程需要912天。 CIK细胞治疗的步骤二: CIK细胞悬液的制备及回输。于培养后的第10天将CIK细胞分3次在第10、13、15天回输给患者。每次取CIK细胞悬液的1/3体
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