大腹园蛛拖丝蛋白基因的克隆和序列研究

1、.多 重 P C R 、热 启 动 P C R 等 方 法 进 行 扩 增 ，并 根 据 实 验 结 果 最 终 确 定 了长 距 离 P c R 反 应 对 复 杂 基 因 的扩 增 。通 过 多种 引物 对 实验 、M gCI :浓 度 梯 度 实验 、引物 浓 度 梯 度 实 验 、退 火 温 度 梯 度 实 验 、延 伸 时 间梯 度 实 验 、tou ch do wn 循 环 等 实 验 对 P C R 以及 R T-P C R 反 应 条 件 进 行 优 化 ， 以扩 增 大 腹 园蛛 拖 丝 蛋 白基 因 。凝 胶 纯 化 、 回 收 扩 增 获 得 的 大 腹 园 蛛 拖 丝

2、蛋 白基 因 D N A ，克 隆 于 p D rive 载 体 ，筛 选 转 化 子 ，并 经 P C R 、酶 切 和 序 列 分 析 鉴 定 阳性 克 隆 。将 其 中 的 一 个 克 隆 基 因 片 段 构 建 入 p E T 犯 a(+) 蛋 白表 达 载 体 。本 论 文 以 D N A 为 模 板 ，通 过 P C R 扩 增 获 得 了编 码 大 腹 园蛛 拖 丝 蛋 白基 因 的克 隆 Av D S I，序 列 长 2 199bp ，序 列 分 析 表 明不 含 基 因 内含 子 ; 通 过 R f-P C R ，获 得 了编 码 大 腹 园蛛 拖 丝 蛋 白基 因 的 克

3、隆 Av R S Z ，序 列 长 95 1bp ;序 列 比较 分 析 推 测 大 腹 园蛛 拖 丝 蛋 白基 因存 在 着 两 种 组 分 ，Av R sZ 克 隆 为 编 码 大 腹 园蛛 拖 丝 蛋 白基 因组 分 一1，Av D sl 克 隆 可 能 为 大 腹 园蛛 拖 丝 蛋 白基 因 的 另 一 组 分 一2 。 获 得 了 可 以表 达 大 腹 园 蛛 拖 丝 蛋 白基 因Av R sZ 的 pE T-R sZ 表 达 载 体 。这 些 成 果有 助 于进 一 步研 究 大 腹 园蛛 拖 丝 蛋 白基 因 的基 因 组 成 和 结 构 特 征 、 为 应 用 蛋 白质 剪 接

4、 技 术 开 发 蜘 蛛 拖 丝 蛋 白的研 究 提 供 了基 因 克 隆 ，构 建 的表 达 载 体 为 进 一 步 研 究 蜘 蛛 拖 丝 蛋 白基 因 的 表 达 、表 达 蛋 白 的 结 构 以及 应 用 表 达 蛋 白进 行 人 工 纺 丝 奠 定 了 基 础 。关键 词 : 大 腹 园蛛 ，拖 丝 蛋 白基 因 ，克 隆 ，表 达 载 体：C lo n in g a n d S eq u en ee A n a ly sis o f A ra n eu s Ve n trieo su sD r a g lin e S ilk P re te in G e n eA B S T R

5、A C TSP ider drag lin e silk w ith un iqu e eh aracteristies of h igh stren gth an d elastieity b e eo m es a g o o d n atu ral P ro tein fib e几 an d w a s n am ed b io stee l in sP id er 5 sev en d lfl笼re n t fu n ctio n al silk s.SP ider drag lin e silk Protein 15 com Po sed o f rePeate d seque ne

6、es，h igh G C an d nu m e ro u s ite ratio n s o f fo u r d iffe re nt a m in o a e id m o tifs. It 15 d iffi e u lty to design Prim ers for P C R an d R 卫P C R ，an d also it 15 d iffi cu lty to obtain e o m P le t g e n e o f sP id e r dr ag lin e silk P ro te in b e e au se o f th e c o m P e titio

7、 n betw een tem P late s an d Pri m ers. Ai P resent，there are n o reP orts on the eom P lete sP id er drag lin e silk g en e an d the m o lecu lar w eigh t. T he ge ne e lon in g an d e x P re ssio n m ak e P ro gr e ss slo w ly . R e n H o n g ling e tal e o n stru e te dth e e D N AP la gu e lib

8、ra ryan do n lyg o t ab o ut1 .7 kbAx an e u s v e n trie o su s d ra g lin e silk P ro te in g e n e . B e e k w itt e ta l o n ly a m P lifie d 3 0 0 b P a n d 7 O 0 b P d ra g lin e silk P ro te in ge n e b y P C R fro m Ai an eu s B ic e nt e n ar iu s g e n o m e D N A .Th is P ap e r e h o se

9、A ra n e u s ve n trie o su s a s a re se arc h m ate ria l，an d th ege n o m e D N Aan d tot a l R N Aw e re e Xtr a cte d fro mth e sP e e ia l g lan d n am e d力厂m ajor am Pu late (M A ) g lan d .M an y P rim ers w ere design ed an d syn thesed .Th e drag line silk Protein gene w as 田卫P lified 饰 n

10、orm al P C R ，m u ltiP le P C R an d h ot start P C R e ta l. P C R an d R T 一P C R e o nd itio n s we re o P tim ize d b y P rime rsexP e rim e n ts，M g C 12 e o n e e nt rat io n g ra d ie nt e x P e rim e n ts，P rim e r e o n e e n tra tlon gr ad ie nt e XP e rim e nt s ，an n e a lin g te m P e r

11、a tu re gr ed ie nt e xP e rim e n ts ，e x te n d in g tem P e ra tu re gr a d ient e xP e rim e nt s，to u e h d o wn e y e le e XP e rim e nt s eta l. Th ed rag lin e silk 拼 ot e in g e n e s we re e lon e d in to p D riv e v e etor an d Se 明 e n e e d ，exP re ssion v e cto r o f P E T- R S Z w a s

12、 e o n stru e te d .Th e e lo n e s o f Ai an eu s v e n trie o su s dr ag linesilk Pr ot e in g e n e Av D S Ian d Av R S Z w e re o b ta in e d . 乃刃D S 1 e o m P o se d o f n o in tro n w as 2 19 9 b P a n d Av R S Z w as 9 5 1bP . Av D S 1 an d 八夕R S Z w ere presum ed to b e A ran eu s v e n trie

13、 o su s first fib ro in Pr ot e in g e n e an d an o th e r d rag lin e silk P ro te in g e n e . Th e re e o m b ln ant P las m id n a 们ne d P E 不 R S Z w a s e o n sttu cte d . T h is 15 a Pr e lu d eto re s e arc h th e s加 c tU re an d e xP re ssio n o f A ra n e u s v en tri e o su s d ra g lin

14、e s ilk Pr ot e in g e n e an d th e b a se o f P ro te in 叭 ifia l fila tu re b y ap P ly in g P ro te in sP lie in g .K E Y W O R D S : Ai ane u s v e ntr ie o su s ，sP id e r d ra g line silk P ro te in g e ne ，e lo n ing ，e XP re s sio n v e e to r7目录第 一 章 绪 论 .，.11.1 蜘 蛛 丝 蛋 白 的特 性 .，.，.11.2 蜘

15、蛛 丝 蛋 白基 因 的 结 构 、 克 隆 和 表 达 的研 究 进 展 .，.，.31.3 应 用 前 景 .，.61.4 本 论 文 的研 究 内容 、 目的 和 意 义 .，.7第 二 章 实 验 材 料 和 方 法 ，.、.，.，.82 .1 实 验 材 料 .，.，.，.，二，.，.，二，.82 .1.1 菌 株 和 载 体 .，.，.，.82 .1.2 酶 与 试 剂 .，.，二，.，.，. 102 .1.3 常 用 试 剂 与 培 养 基 的 配 制 .102 .1.4 主 要 仪 器 .，.，.132.2 实验 方 法 .，.，、.，142 .2 .1 大 腹 园蛛 主 壶

16、腹 腺 腺 体 的解 剥 分 离 .142 .2 .2 引物 的 设 计 与 合 成 .，.，.，.142 .2 .2 .1 对 国 际 基 因库 中 的拖 丝 蛋 白基 因 比对 和 分 析 . 142 .2 ，2 .2 引 物 的 设 计 与 合 成 .，二，. .142.2 .3 不 同方 法 提 取 大 腹 园 蛛 主 壶腹 腺 基 因 组 D N A .、.142 .2 .3.1 苯 酚/氯 仿 法 .，二，.··.··.····一142 .2 .3 .2 S D S 法 .，162.2 .3 .3 基

17、因 组 D N A 提 取 试 剂 盒 法 .，. 172 .2.4 琼脂 糖凝 胶 电泳 .·.，···································一182 .2 .5 模 板 D N A 准 备 .，二，.，.

18、83;.·.·.·182.2.6 大 腹 园蛛 主 壶 腹 腺 体 总 R N A 的 提 取 . 182 .2 .6 .1 实 验 准 备 .，.··.··.·182 .2 .6 .2 总 RN A 的 提 取 ，二，.，.，.·······1·················

19、·、··192 ，2 .6 .3 甲醛 变 性 电泳 .，.，.，.·.·······192 .2.7 聚 合 酶 链 式 反 应 .，.，.，.，.202 .2 .7 .1 长 距 离 P C R 反 应 的 确 立 .，.，.202.2 .7 .2 长 距 离 P C R 反 应 体 系 的优 化 .，.202 .2 .7 .3 长 距 离 P C R 反 应 条 件 的优 化 .，.，.202.2 .8 反转 录 聚 合 酶 链 式 反应 .212 .2 .8 .1 R J，反

20、应 体 系 的优 化 .，.，.212 .2 .8 .2 R l、反 应 条 件 的优 化 .，.，.，.，.212 .2 .8 .3 P C R 反 应 的 优 化 .，二，.，.，.212.2 .9 目的 片 段 的 琼 脂 糖 凝 胶 回 收 、二，.，.222.2 .10 连 接 反 应 .，.、，、.232.2 .11 感 受 态 细 胞 的 制 备 .，.232.2 .12 质 粒 的 转 化 .，.，.242 .2 .13 转 化 子 的筛 选 .·.··········

21、····，············252 .2 .14 质 粒 的 提 取 .，.，.····.·.·····252 .2 .15 重 组 质 粒 的 鉴 定 .，.·····，·········&#

22、183;························262 .2 .15.1 重 组 质 粒 的 P C R 鉴 定 .262.2 .15.2 重 组 质 粒 的 酶 切 鉴 定 .，.，.262 ，2 .16 序 列 测 定 .，.，.，.，.·········&

23、#183;······262 .2 .17 序 列 分 析 .·.···········，··262 .2 .18 表 达 载 体 p E T-R S Z 的构 建 .，.，.，.272.2 .18.1 获 取 pE T 犯a(+)载 体 的双 酶切 回 收 片 段 .，.，.，.272.2 .18.2 引物 的 设 计 与 合 成 .，.，.，272 .2 ，18.3 获 取 目的基 因 的双

24、酶 切 回 收 片 段 .，二，.272 .2 .18 .4 连 接 反 应 .，.，.，·.·····，·272 .2 .18 .5 转 化 子 的筛选 .、，.，.········282 .2 .18 .6 重 组 质 粒 pE T-R SZ 测 序 鉴 定 .，、，.282 .3 实 验 流 程 .，.28第 三 章 结 果 与 分 析 .，.303 .1 大 腹 园蛛 主 壶 腹 腺 体 的 解 剖 分 离 .303 .2 大 腹 园蛛

25、拖 丝 蛋 白基 因 Av D sl (Ar ane us v entricosus drag line sil k D N A I) 的 克隆 .，.313 .2 .1 大 腹 园蛛 主 壶 腹 腺 体 的基 因组 D N A 的 提 取 .，.，.，.313 .2 .2 扩 增 引 物 的 设 计 与 合 成 .，.，.，.323 .2 .3 聚 合 酶 链 式 反 应 的优 化 .，.323 .2 .4 与 载 体 的连 接 反 应 .·············

26、;·······························343 .2 .5 重 组 质 粒 p D 一Av D sl 的 P C R 鉴 定 ，.，.343 .2 .6 重 组 质 粒 p D 一八夕D SI 的 酶 切 鉴 定 .353.2 .7 测 序 结 果 及 序 列 分

27、析 .，.363 .2 .7 .1 Av D S I 拖 丝 蛋 白基 因序 列 .363 .2.7 .2 Av D S I 拖 丝 蛋 白氨 基 酸 序 列 .373 .2 .7.3 Av D S I 拖 丝 蛋 白基 因序 列 的 重 复 性 结 构 特 点 .，.383.2 .7 .4 八刃D S I 拖 丝 蛋 白氨 基 酸 序 列 的 重 复 性 结 构 特 点 .383.2 .7.5 Av D S I 拖 丝 蛋 白氨 基 酸序 列 mo tif的 结 构特 点 .393 .2 .7.6 Av D S I 拖 丝 蛋 白基 因序 列 检 索 和 分 析 结 果 .，.39 3.3

28、大 腹 园蛛 拖 丝 蛋 白基 因 彻 R s Z (为 an eu s ventr ieo su s 击峪 line silk m KN A Z ) 的 克 隆 .，.，.，.4 0 3，3 .1 大 腹 园蛛 主 壶 腹 腺 体 的 总 R N A 的提 取 .，.403 .3 .2 引物 的 设 计 与 合 成 .，.，.403 .3.3 反转 录 聚 合 酶链 式 反应 的优 化 .413 .3.4 与载 体 的连 接 反应 .，.，.，.，.，二413 .3 .5 重 组 质 粒 p D 一Av R S Z 的 P C R 鉴 定 .，.423 .3 .6 重 组 质 粒 p D 一

29、Av R sZ 的 酶 切 鉴 定 .433 .3 .7 测 序 结 果 及 序 列 分 析 .，.，.·.··433 .3 .7 .1 Av R S Z 拖 丝 蛋 白基 因序 列 .433 .3 .7 .2 Av R S Z 拖 丝 蛋 白氨 基 酸 序 列 .，.，.，.443 .3 .7.3 Av R S Z 拖 丝 蛋 白氨 基 酸 序 列 m otif 的 结 构 特 点 .，.443 .3 .7 .4 八刃R S Z 拖 丝 蛋 白基 因序 列 检 索 和 分 析 结 果 .，.453 .3 大 腹 园蛛 拖 丝 蛋 白基 因表 达 载 体 的构 建

30、 .、.473 .3 .1 含 有 大 腹 园蛛 拖 丝 蛋 白一 段 基 因 的 获 得 .，.473 .3.2 重 组 质 粒 p E T-R SZ 的获 得 .，.，.，.，.473 .3 .3 重 组 质 粒 p E T-R SZ 的 酶 切 鉴 定 .，.483 .3 .4 重 组 质 粒 p E T-R S Z 的 测 序 .483.3 .5 表 达 载 体 的 构 建 图 .，.，4 9第 四章 讨 论 .，.，.，二、.，.，.504 .1 对 Av D sl 克 隆 的 分 析 .，.，.504 .2 对 Av R S Z 克 隆 的 分 析 .，.514.4 大腹 园蛛 拖

31、 丝 蛋 白基 因表 达 载 体 的构 建 .524 .3 大 腹 园蛛 拖 丝 蛋 白基 因两 种 组 分 的推 测 ，.52 第 五 章 结 论 .，.，.，.541 结 论 .，.，.、.，.542 创 新 点 .，.543 难 点 .，.，.，.55参 考 文 献 .，.，.，.，.56英 文 缩 写 词 .，.，.61在 学 期 间 参 与 的研 究 项 目和 发 表 的 文 章 ，.、.、.，.，.62第 一 章 绪 论蜘 蛛 丝 是 一 种 高 分 子 蛋 白纤 维 ，具 有 其 他 纤 维 不 可 比拟 的 强 度 大 、弹 性 好 、柔 软 、 质 轻 、抗 断 裂 、耐 紫

32、 外 线 等 优 点 ，它 在 干 燥 状 态 或 是 潮 湿 状 态 下 都 能 保 持 很 好 的 性 能 ， 并 具 有 较 好 的 耐 低 温 性 能 。由于 蜘 蛛 丝 是 由蛋 白质 构 成 ，并 且 可 生 物 降解 和 回 收 ，不 会对 环 境 造 成 污 染 ，是 生 产 绿 色 织 物 优 异 的 纺 织 材 料 I1。如 果 能够 用 人 工 的 方 法 大 量 而经 济 地 生 产 这 种 纤 维 ，必 将 对 纺 织 业 的发 展 产 生 深 远 的 影 响 。但 是 ，蜘 蛛 吐 丝 量 远 比家 蚕 要 少 ，且 具 有 同类 相 食 的特 性 ，无 法 象 家

33、 蚕 一 样 高 密 度 养 殖 ，因 此 ，蛛 丝 很 难 像 蚕 丝 一 样 通 过 驯 化 的 方 法 大 量 获 得 。利 用 基 因 工 程 的 方 法 获 得 天 然 蛛 丝 蛋 白就 自然 成 为 蜘 蛛 丝 开 发 生 产 的 必 由之 路 。1.1 蜘 蛛 丝 蛋 白 的 特 性蜘 蛛 属 节 肢 动 物 门 ，蛛 形 纲 ，蜘 蛛 目I2。蜘 蛛 拥 有 七 套 专 门产 丝 腺 体 ，分 别 连 接 于 前 纺 丝 器 、中 纺 丝 器 和 后 纺 丝 器 这 三 对 不 同 的 纺 丝 器 。其 中 ，连 接 于 前 纺 丝 器 的 有 主 壶腹 腺 、梨 状 腺 ;

34、连 接 于 中纺 丝 器 的有 小 壶 腹 腺 、管 状 腺 和 葡 萄 状 腺 ; 连 接 于 后 纺 丝器 的有 集 合 状 腺 ，鞭 毛 状 腺 I3J。这 些 腺 体 能 分 别 产 生 七 种 不 同类 型 的 纤 维 和 胶 粘 物 : 主 壶腹 腺 (M ajor aJ叮pullate ) 产 生 拖 丝 (D r眼line silk); 小 壶 腹 腺 (M ino r 田，pullate ) 产 生捕 捉 丝(Te mP 0rary caPturesPiral sil k); 鞭 毛 状 腺 (Flag ell iform ) 产 生 网螺 旋 丝 核 心 部 分 的鞭 毛

35、样 丝 (C ore fib er of the cap turesPiral); 管 状 腺 (Tu buliform ) 产 生 包 卵 丝 (E g g case sil k ); 葡 萄 状 腺 体 (Ac iniform ) 产 生 包 装 丝 (Wr app ing sil k) : 聚 合 丝 腺 体 (A gg regate) 产 生 粘 合 物 (Stick y glue ); 梨 状 腺 体 (Piriform ) 产 生 固着 丝 4-l 8。在 蜘 蛛 的七 种 丝 中 ，蜘 蛛 拖 丝 将 高抗 张 强 度 和 高 弹 性 奇 妙 地 集 于 一 体 ，是 其 他 纤

36、 维 材 料 无 法 比拟 的 (如 表 1一1 ) ，已成 为 自然 界 力 学 性 能最 优 良的天 然 蛋 白质 纤 维 ， 素有 “生 物 钢 ”之 称 119一2j。表 1一l 蜘 蛛 拖 丝 与 其 它 高 强 纤 维 的 力 学 性 能 比较 122断 裂 伸 长率强 度模 量断 裂 能( % )( G P a )( G p a )( J / K g )拖 丝9 . 8 0 一 3 2 . 1 00 . 3 0 一 1 . 8 01 一 3 0I X 1 0K e v l a r3 . 6 03 . 3 07 53 X 10高 强 聚 脂 纤 维13 . 001 . 1 01 4

37、S X 10钢丝1 . 101 . 7 72 0 02 X 10 3蜘 蛛 丝 或 胶 粘 物 虽 具 有 不 同 的物 理 和 化 学 性 质 ，但 其 化 学 本 质 是 蛋 白质 ，基 本 组 成 单 元 为氨 基 酸 (如 表 1一2 ) 。蜘 蛛 丝 含 有 约 17 种 左 右 氨 基 酸 ，各 种 氨 基 酸 的含 量 因 蜘 蛛 的种 类 不 同 而 存 有 一 定 的 差 异 。蜘 蛛 丝 中较 大 的 7种 氨 基 酸 含 量 占其 总 量 的 百 分 之 九 十 ， 它 们 分 别 为 甘 氨 酸 、 丙 氨 酸 、 谷 氨 酸 、 脯 氨 酸 、 丝 氨 酸 、 亮 氨

38、 酸 和 精 氨 酸 。表 1 一 2 不 同种 类 蜘 蛛 拖 丝 的 主 要 氨 基 酸 组 成 (%) 231氨 基 酸十 字 园蛛大 腹 园蛛络 新 妇 蛛甘 氨 酸4 1.3035 .3048 .69丙 氨 酸18 .3017.8 824 .8 5谷 氨 酸11.8612 .7310 .49脯 氨 酸9 .5512 .682 . 15丝 氨 酸4 .744 .9 02 . 11亮 氨 酸1，761.352 .6 3精 氨 酸0 .491.5 51.9 4蜘 蛛 丝 的 分 子 结 构 是 由原 纤 丝 组 成 ，而 原 纤 丝 又 由 120 nm 微 原 纤 组 成 ，微 原 纤

39、是 由蜘 蛛 丝 蛋 白构 成 的 高 分 子 化 合 物 。蜘 蛛 丝 的 分 子 构 象 为 p 一折 叠 链 ，分 子 链 沿 着 纤 维 轴 线 的 方 向呈 反 平 行 排 列 ，相 互 间 以氢 键 结 合 ，形 成 折 曲 的栅 片 ，其 多 肤 链 排 列 整 齐 、密 集 形 成 结 晶 区 ，栅 片 间 为 非 结 晶区 ，由于 结 晶 区 的 多肤 链 分 子 间 以氢 键 结 合 ，因 而 分 子 间 作 用 力 很 大 ，沿 着 纤 维轴 线 方 向排 列 的 晶 区结 构 使 纤 维在 外 力作 用 时有 较 多 的分 子 链 能承 受 外 力作 用 ，使得 蜘 蛛

40、 丝 具 有 高 强 度 。蜘 蛛 丝 非 结 晶 区分 子 链 呈 p 一转 角状 ， 当 受 到 拉 伸 时 可 能 形 成 a 一转 角 螺 旋 ，从 而 赋 予 蜘 蛛 丝 良好 的弹 性 。而 沿 着 纤 维 轴 线 方 向排 列 的 晶态 p 一折 叠链 栅 片 可 以看 作 具 有 多 功 能 铰 链 作 用 ，在 非 结 晶 区 域 内 形 成 一 个 模 量 较 高 的 薄 壳 ，从而 使 蜘 蛛 丝 具 有 较 高 模 量 和 良好 弹 性 。蜘 蛛 丝 蛋 白 的 空 间 结 构 侧主 要 由非 结 晶状 态 部 分 和 结 晶 状 态 部 分 构 成 。结 晶状 态 部

41、 分 主 要 由丙 氨 酸 残 基 序 列 组 成 ，并 形 成 反 向平 行 的 p 一折 叠 片 层 ，多 个 p 一折 叠 片层 的 部 分 而 成 为 结 晶状 态 ; 非 结 晶状 态 的部 分 由富 含 甘 氨 酸 的 单 链 多 肤 构 成 ，形 成 a - 螺 旋 起 连 接 晶体 部 分 的 作 用 。 p 一片层 之 间 以 p 一转 角 相 连 ，而 Q 一螺 旋 所 构 成 的 非 结 晶状 态 的 部 分 将 各 p 一片 层 连 成 一 个 线 状 整 体 。由于蛛 丝 蛋 白特 殊 的 结 构 特 征 ，使 得 蛛 丝 蛋 白呈 现 出具 有 非 常 明显 优 势 的物 理 化 学 性 质 I2s拐: l) 强 度 高 ，拖 丝 的 强 度 至 少 是钢 材 的 5 倍 ; 2) 弹 性 大 ，是 人 造 纤 维 的 3一 10 倍 ; 3) 抗 辐 射 ; 4) 具 有 一 定 的 热 稳 定 性 ，在 2 50 高温 下 它 能 保 持 稳 定 ，只能 在 25 0