生物化学实验：层析技术分离生物大分子(凝胶过滤）

1、凝胶层析凝胶层析分离蛋白质分离蛋白质本次试验分两次完成。本次试验分两次完成。1、讲解技术原理，装柱练习，连接装置等。、讲解技术原理，装柱练习，连接装置等。2、上样分离，打印图谱等。、上样分离，打印图谱等。生物大分子制备方法基本设计思路生物大分子制备方法基本设计思路n流程：选材流程：选材破碎破碎抽提抽提浓缩浓缩分离纯化分离纯化(各种层析技术）各种层析技术） 检测纯度（电泳技术）检测纯度（电泳技术）n生化实验三大分离技术：n离心技术n层析技术n电泳技术层析技术分离生物大分子层析技术分离生物大分子n1 1、定义、定义n层析分离是一个动态过程，它是由一个层析分离是一个动态过程，它是由一个流动相流动相（

2、移动着的气体或液体）对另一个（移动着的气体或液体）对另一个固定相固定相（不移（不移动的固体或液体）作相对连续移动，动的固体或液体）作相对连续移动，流动相流动相里含里含有要分离的有要分离的混合物质混合物质，在移动过程中，各种物质，在移动过程中，各种物质受到受到固定相固定相不同程度的作用（如吸附、离子交换不同程度的作用（如吸附、离子交换作用）等，达到分离。作用）等，达到分离。n2 2、分类：、分类：n吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、n亲和层析、聚焦层析等。亲和层析、聚焦层析等。一、凝胶层析原理 凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状凝

3、胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶层析来分离生物大分子主要是根据多的颗粒物质。用凝胶层析来分离生物大分子主要是根据多孔凝胶对近似于球形不同半径的生物大分子具有不同的排孔凝胶对近似于球形不同半径的生物大分子具有不同的排阻效应实现的。阻效应实现的。即是依据分子量的不同来进行分离的。即是依据分子量的不同来进行分离的。 大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而小分子不被排阻，可只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，一些中等大小的分自由扩散，渗透进入凝

4、胶内部的筛孔，一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。层析技术公式层析技术公式n分配系数分配系数n VeVe Vo VonKavKav= =n Vt Vt - Vo - VonVtVt层析床总体积层析床总体积nVeVe洗脱液体积洗脱液体

5、积nVoVo外水体积外水体积n分子量大，全排出分子量大，全排出 Ve= Vo KavVe= Vo Kav=0=0n分子量中分子量中 Ve= Vo+ KavVi 0 KavVe= Vo+ KavVi 0 Kav11n分子量小，进入内部分子量小，进入内部 Ve= Vo+ Vi KavVe= Vo+ Vi Kav=1=1二、各类凝胶的结构和性能二、各类凝胶的结构和性能n1.1. 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（SephadexSephadex）n SephadexG50SephadexG50、 SephadexG75SephadexG75、 SephadexG100SephadexG100、n2 2. .琼

6、脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（sepharosesepharose）n Sepharose2BSepharose2B、4B4B、6B6Bn3.3.聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel-pBio-Gel-p）n n4.sephacryl (4.sephacryl (交联交联葡聚糖和双丙烯酰胺共聚）葡聚糖和双丙烯酰胺共聚）n5.Superdex（交联交联琼脂糖和葡聚糖共聚）琼脂糖和葡聚糖共聚）层析凝胶的选择层析凝胶的选择 n1. 1. 型号型号n根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。 n2.2. 凝胶用量计算凝胶用量计算n rr2 2h hn干凝胶用量（克）干凝

7、胶用量（克）= = n 膨胀度膨胀度 还应增加还应增加10-20%10-20%n3.柱的直径与长度柱的直径与长度n 根据经验，组别分离时，大多根据经验，组别分离时，大多采用采用20-30cm20-30cm长的层析柱长的层析柱。n 分级分离时，一般需要分级分离时，一般需要100cm100cm左右长的层析柱，其直径在左右长的层析柱，其直径在1-5cm1-5cm范围内，长度范围内，长度L L与直径与直径D D的比值的比值L/DL/D一般宜在一般宜在7-107-10之间之间.实验流程及方法：实验流程及方法： 制备固定相（装柱）制备固定相（装柱） 平衡平衡上样上样洗脱洗脱收集收集检测检测实验所需设备实验

8、所需设备:层析柱层析柱;恒流泵恒流泵;自动部分收集器自动部分收集器;核酸蛋白检测仪核酸蛋白检测仪;电脑电脑(记录仪记录仪)实验操作实验操作1 1、凝胶的溶胀、凝胶的溶胀n称取称取7g Sephadex G-75 7g Sephadex G-75 于于250 mL250 mL烧杯中加入洗烧杯中加入洗脱液脱液100mL100mL，置于室温溶胀，置于室温溶胀2-32-3天，反复倾泻去掉天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸沸水浴中煮沸2-32-3小时（可去处颗粒内部的空气以小时（可去处颗粒内部的空气以及灭菌）。（及灭菌）。（此

9、部分已经完成）此部分已经完成）n使用时在超声波中超声使用时在超声波中超声1010分钟。分钟。n2 2、装柱、装柱n 取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。n 在柱中加入洗脱液（约在柱中加入洗脱液（约1/31/3柱床高度），将凝胶浓浆缓柱床高度），将凝胶浓浆缓慢倾入柱中，待凝胶沉积慢倾入柱中，待凝胶沉积1cm-2cm1cm-2cm高度后打开出水口，流高度后打开出水口，流速一般用速一般用3-5mL/10min3-5mL/10min（预先恒流泵调好，记录流速预先恒流泵调好，记录流速）。）。胶面上升到柱上端胶面上升到柱上端1cm1cm处则装柱完毕。处则装柱完毕。n

10、注意注意装柱过程中凝胶不能分层装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片。然后关闭出水口，静置片刻，待凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用刻，待凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1-21-2倍床体积的倍床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。n3 3、柱子质量的测定、柱子质量的测定n 吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面，）。打开出水口，使残吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面，）。打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪吸取余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪吸取0.25ml0.25ml（5mg/ml5mg/ml）蓝色葡聚糖）

11、蓝色葡聚糖-2000-2000液体，小心地绕柱壁一圈（距离液体，小心地绕柱壁一圈（距离胶面胶面2mm2mm）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开恒流泵（恒流泵（开始收集！），开始记录！开始收集！），开始记录！待溶液渗入胶床后，关闭出水口，待溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用3-3-5mL/10min5mL/10min的速度开始洗脱，自动收集器收集时间为的速度开始洗脱，自动收集器收集时间为10min10min每管。最后每管

12、。最后作出洗脱曲线（由记录仪完成）。观察蓝色葡聚糖移动情况，若蓝线作出洗脱曲线（由记录仪完成）。观察蓝色葡聚糖移动情况，若蓝线平直，则装柱良好。平直，则装柱良好。n注意：蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液（注意：蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液（1-21-2倍床体积）继续倍床体积）继续平衡一段时间，以备下步实验使用。平衡一段时间，以备下步实验使用。4 4、蛋白质混合样品的分离、蛋白质混合样品的分离 吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面）。打开出水口，使残余吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面）。打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪吸液体降至与胶面相切（但不要干

13、胶），关闭出水口。用移液枪吸取标准蛋白溶液取标准蛋白溶液0.5mL 0.5mL ，小心地绕柱壁一圈（距离胶面，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm2mm）缓慢）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开恒流泵（加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开恒流泵（开开始收集！），开始记录！始收集！），开始记录！待溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少待溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用3-3-5mL/10min5mL/10min的速度开始洗脱，同时用核酸蛋白检测仪测定的速度开始洗脱，同时用核酸蛋白检测仪测定A280A280，自，自动收集器收集时间为动收集器收集时间为10min10min每管。最后作出洗脱曲线（由记录仪完每管。最后作出洗脱曲线（由记录仪完成）。成）。5 5、数据处理：、数据处理：n以以A280A280为纵坐标，为纵坐标，t t