质粒DNA纯度的测定及其构型观察

1、实验二实验二实验目的实验目的进一步区分质粒进一步区分质粒DNA中染色体中染色体DNA和和RNA的的污染（污染（DNA的纯度的纯度）；）；观察质粒观察质粒DNA三种三种基本构象基本构象；可用此法纯化可用此法纯化DNA及计算出及计算出DNA的浓度的浓度。实验原理实验原理l 荧光物质荧光物质GoldviewGoldview在紫外光照射下能发出荧光在紫外光照射下能发出荧光。当。当DNADNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的GoldviewGoldview就插入就插入DNADNA分子中形成荧光络合物，使发射的荧光分子中形成荧光络合物，使发射的荧光增强几十倍增强几十倍。l

2、荧光的强度正比于荧光的强度正比于DNADNA含量含量，如将已知的标准样品，如将已知的标准样品做电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。做电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。l 电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外灯下拍照，只需电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外灯下拍照，只需5-5-10ng10ng的的DNADNA，就可从照片上比较鉴别，就可从照片上比较鉴别。实验原理实验原理l在一定电场强度下，在一定电场强度下，DNADNA分子的迁移取决于分子的迁移取决于分子筛效应，即分子筛效应，即DNADNA分子本身的分子本身的大小大小和和构型构型( (相对分子质量不同的相对分子质量不同的DNADNA片段泳动速度不片段泳动速度

3、不一样一样) ) 。因此，。因此，凝胶电泳凝胶电泳不仅可分离不仅可分离不同不同相对分子质量相对分子质量的的DNADNA，也可以，也可以分离相对分子分离相对分子质量相同、构型不同的质量相同、构型不同的DNADNA分子；分子；l在凝胶电泳中，在凝胶电泳中，DNADNA分子的迁移速度与分子分子的迁移速度与分子量的对数值呈反比关系量的对数值呈反比关系。l 可以此特征区别染色体可以此特征区别染色体DNADNA、质粒、质粒DNADNA和和RNARNA。l 若用小刀取下含质粒若用小刀取下含质粒DNADNA的凝胶带经洗脱则可得的凝胶带经洗脱则可得纯纯DNADNA，用单一切点的酶消化后，与已知分子量，用单一切点

4、的酶消化后，与已知分子量大小的标准大小的标准DNADNA片段进行电泳对照，观察其迁移片段进行电泳对照，观察其迁移距离就可估计出该样品分子量的大小。距离就可估计出该样品分子量的大小。实验原理实验原理l DNADNA分子在凝胶中泳动的速度还与分子在凝胶中泳动的速度还与DNADNA分子本身的构分子本身的构型有关型有关：l共价闭合环状共价闭合环状DNADNA（cccDNAcccDNA）, ,超螺旋结构泳动最快超螺旋结构泳动最快l两条都断开的线状两条都断开的线状DNADNA（LDNALDNA），线性），线性结构结构泳动速度居中；泳动速度居中；l一条链断开的开环一条链断开的开环DNADNA（ocDNAoc

5、DNA）, ,复制中间体泳动最慢。复制中间体泳动最慢。 因而可以通过电泳来区别质粒因而可以通过电泳来区别质粒DNADNA的构型。的构型。 实验方法实验方法选择适当大小的选择适当大小的电泳槽电泳槽和和点样梳点样梳，点样梳底部离电，点样梳底部离电泳槽水平面的距离为泳槽水平面的距离为1-2mm1-2mm。制备琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶：称取称取1%1%浓度的琼脂糖，加入浓度的琼脂糖，加入TAETAE缓冲液，在微波炉上熔解，待凝胶冷却到缓冲液，在微波炉上熔解，待凝胶冷却到5050左右左右时，加入时，加入GoldviewGoldview混匀后，轻轻倒入电泳槽水平板混匀后，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。

6、上，除掉气泡。待凝胶冷却至凝固后，待凝胶冷却至凝固后，取出点样梳取出点样梳，在电泳槽内，在电泳槽内加加入电泳缓冲液入电泳缓冲液，使其正好漫过凝胶表面。，使其正好漫过凝胶表面。在待测样品中加入在待测样品中加入6 6loading bufferloading buffer，混匀后小心，混匀后小心地进行点样。地进行点样。每孔加样量视梳子的大小和胶的厚度每孔加样量视梳子的大小和胶的厚度而定。而定。打开电源开关，打开电源开关，最高电压不超过最高电压不超过5V/cm5V/cm, ,即小电泳槽即小电泳槽不得超过不得超过50V50V；当琼脂糖浓度低于；当琼脂糖浓度低于0.5%0.5%时，电泳温度时，电泳温度不

7、能太高。不能太高。电泳时间随实验具体要求而定，一般待电泳时间随实验具体要求而定，一般待DNADNA带分开后带分开后即可停止，当即可停止，当溴酚蓝泳动至溴酚蓝泳动至2/32/3凝胶时可停止电泳凝胶时可停止电泳，约需约需1 1小时左右。小时左右。电泳结束后，小心取出凝胶，电泳结束后，小心取出凝胶，将凝胶放在紫外观察将凝胶放在紫外观察灯下观察电泳结果灯下观察电泳结果。 质粒构型观察示意图质粒构型观察示意图实验三实验三实验目的实验目的 从以上实验中提取到的质粒从以上实验中提取到的质粒DNA，为了要作，为了要作下一步的下一步的PCR或者酶切试验，必须测定或者酶切试验，必须测定DNA的纯度和浓度。的纯度和

8、浓度。 实验原理实验原理 核酸具有吸收紫外光线的能力，在波长为核酸具有吸收紫外光线的能力，在波长为260nm260nm的条件的条件下具吸收峰值，而蛋白质在下具吸收峰值，而蛋白质在280nm280nm时具有吸收峰值。时具有吸收峰值。 根据经验数据，纯核酸溶液根据经验数据，纯核酸溶液OD260=1.8OD260=1.82.02.0时，认为已时，认为已达到所要求的纯度。达到所要求的纯度。当当OD260=1260=1时时 dsDNA(dsRNA) = 50g/ml ssDNA(ssRNA) = 40g/ml 核苷酸核苷酸 = 20g/ml 当当RNAOD260/260/OD280 280 2.0 纯品

9、纯品当当DNA OD260/OD280 1.82.0 纯品纯品 2.0 RNA污染污染 1.8 pr污染污染实验方法实验方法-DNA浓度和纯度鉴定浓度和纯度鉴定取石英杯一只，加入取石英杯一只，加入去离子水去离子水2500l2500l，放入，放入751751型型分光光度计的比色槽中，使用氢灯，在分光光度计的比色槽中，使用氢灯，在260nm260nm处调零处调零。将水倒掉，换成将水倒掉，换成2490l2490l水和水和10l DNA10l DNA溶液的混合溶液的混合液，按照同样的方法测出液，按照同样的方法测出DNADNA样品在样品在OD280OD280的值。的值。按按公式算出所制备的公式算出所制备的DNADNA浓度及纯度浓度及纯度。DNADNA浓度浓度（g/mlg/ml）=OD260=OD260值稀释倍数值稀释倍数50g/ml50g/mlL L ；DNADNA纯度纯度= OD260/ OD280= OD260/ OD280（要求比值在（要求比值在1.8-2.01.8-2.0范围范围内）内）实验方法实验方法-RNA的浓度测定和吸收光谱绘制的浓度测定和吸收光谱绘制蒸馏水作为空白对照，蒸馏水作为空白对照，在在230nm230nm、 240nm 240nm 、 250nm 250nm 、260nm260nm、 270nm 270nm