分子生物学-6

1、核酸的制备核酸的制备核酸的制备核酸的制备基因组基因组 DNA 的制备的制备总总 RNA 的制备的制备质粒质粒 DNA 的制备的制备核酸的一般理化性质核酸的一般理化性质 1. DNA 的酸碱及溶解度性质的酸碱及溶解度性质 DNA 有磷酸和碱基，为两性大分子，但偏于酸性；有磷酸和碱基，为两性大分子，但偏于酸性； 可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇。可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇。2. DNA的高分子性质的高分子性质 粘度：粘度： DNA RNA；dsDNA ssDNA 沉降行为：溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉；沉降行为：溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉；3. 在室温条件下，在室温条件

2、下，DNA 在碱中变性，但不水解，在碱中变性，但不水解，RNA水解。水解。 碱基的共轭双键使核苷、核苷酸及核酸在碱基的共轭双键使核苷、核苷酸及核酸在 260 nm 附近附近有最大吸收峰。有最大吸收峰。 用紫外分光光度计测定核酸分子用紫外分光光度计测定核酸分子 在在 260 nm 处的光密度处的光密度值值 (optical density, OD 值值) 来定量来定量 DNA 和和 RNA。 OD260：单核苷酸：单核苷酸 ssDNA dsDNA 核酸核酸的紫外吸收的紫外吸收 苯酚及氯仿可使蛋白质变性，用于纯化核酸。苯酚及氯仿可使蛋白质变性，用于纯化核酸。 用用 Tris-HCl (pH 8.0

3、) 饱和酚去除饱和酚去除 DNA 溶液溶液中的蛋白质；中的蛋白质； 用用 Tris-HCl (pH 6.7) 饱和酚去除饱和酚去除 RNA 溶液溶液中的蛋白质中的蛋白质 酚酚:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇 25:24:1 酚酚:氯仿氯仿 1:1核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化 盐离子可中和核酸分子上的磷酸根；盐离子可中和核酸分子上的磷酸根； 2.5 倍体积的乙醇或倍体积的乙醇或 0.9 - 1 倍体积的异丙醇使倍体积的异丙醇使核酸沉淀；核酸沉淀； 在在 12000 x g 离心力作用下，促进核酸沉淀。离心力作用下，促进核酸沉淀。核酸的浓缩核酸的浓缩用于沉淀核酸的盐溶液用于沉淀核酸的盐溶液注：需用注：

4、需用 70 乙醇洗涤核酸沉淀以除去盐离子。乙醇洗涤核酸沉淀以除去盐离子。盐类盐类储存液储存液 (M)终浓度终浓度 (M)醋酸钠醋酸钠3.00.3醋酸铵醋酸铵10.02.0-2.5氯化锂氯化锂8.00.8氯化钠氯化钠5.00.2 建立基因组文库；建立基因组文库； 克隆特定的基因；克隆特定的基因； 用用 Southern 印迹检测某一基因的存在和拷印迹检测某一基因的存在和拷贝数；贝数； 用用 PCR 方法检测基因的存在及突变等；方法检测基因的存在及突变等； 进行进行 DNA 指纹分析。指纹分析。从细胞或组织中提取的基因组从细胞或组织中提取的基因组 DNA 的目的：的目的：一、基因组一、基因组 DN

5、A 的制备的制备(1) 细胞裂解细胞裂解 蛋白酶蛋白酶 K 和和 SDS 可破坏细胞膜及细胞中的蛋白质，可破坏细胞膜及细胞中的蛋白质，使基因组使基因组 DNA 从破碎的细胞中释放出来。从破碎的细胞中释放出来。(2) 蛋白质淬取蛋白质淬取 用酚用酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇 (25/24/1) 淬取蛋白质。淬取蛋白质。(3) 基因组基因组 DNA 沉淀沉淀 用用 0.1 倍体积的倍体积的 3 M NaAC 和和 2.5 倍体积的倍体积的 100% 乙乙醇沉淀醇沉淀 DNA, 用用 70% 乙醇除去乙醇除去 DNA 沉淀中的盐离子。沉淀中的盐离子。(4) 将基因组将基因组 DNA 溶解在溶解在 TE

6、 缓冲液中，使其终浓度为缓冲液中，使其终浓度为 1 mg/ml，置，置 4 C 保存。保存。(一一) 基因组基因组 DNA 的制备方法的制备方法(1) 防止内源性防止内源性 DNase 裂解缓冲液中的裂解缓冲液中的 EDTA使使 DNA免遭免遭 DNase 的降解。的降解。(2) 保证得到高分子量的基因组保证得到高分子量的基因组 DNA 在制备基因组在制备基因组 DNA 过程中应减少物理机械作用，过程中应减少物理机械作用，防止基因组防止基因组 DNA 的损伤。的损伤。(3) 保证基因组保证基因组 DNA 不被蛋白质所污染，否则将影响不被蛋白质所污染，否则将影响限制性内切酶对限制性内切酶对 DN

7、A 的酶切作用。的酶切作用。 高纯度高纯度 DNA 的的 OD260/OD 280 值大于值大于 1.7。(二二) 制备基因组制备基因组 DNA 时应注意时应注意哺乳动物基因组哺乳动物基因组 DNA1, 6. DNA/HindIII;2, 3. 大鼠基因组大鼠基因组 DNA；4, 5. 小鼠基因组小鼠基因组 DNA(三三) 基因组基因组 DNA 的检测的检测细菌基因组细菌基因组 DNA1. 1 Kb Plus DNA Ladder;2, 3. M. sm 基因组基因组 DNA1 2 31 2 3 4 5 6 纯化纯化 mRNA； 建立建立 cDNA文库；文库； 克隆特定的克隆特定的 cDNA；

8、 用用 Northern 印迹方法检测某一特定基因的印迹方法检测某一特定基因的表达；表达； 用用 RT-PCR 方法检测某一特定基因的表达。方法检测某一特定基因的表达。从组织或细胞中提取总从组织或细胞中提取总 RNA 的目的：的目的：二、总二、总 RNA 的制备的制备 异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠为强烈的异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠为强烈的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，使总结构破坏，使总 RNA 从细胞中释放出来。从细胞中释放出来。(一一) 异硫氰酸胍法提取总异硫氰酸胍法提取总 RNA 的原理的原理 异硫氰酸胍和异硫氰酸胍和 -巯基乙

9、醇等还原剂使巯基乙醇等还原剂使内源性内源性 RNase 变变性失活性失活, 防止防止 RNA 被降解。被降解。 焦碳二乙酯焦碳二乙酯 (DEPC) 使使外源性外源性 RNase 变性并变性并失活。失活。 用用 0.1% DEPC 配制缓冲液，然后高压灭菌除去配制缓冲液，然后高压灭菌除去 DEPC。 用用 0.1% DEPC 处理处理 EP 管、管、Tip 头。头。 置玻璃器皿于置玻璃器皿于 180 C 烤箱中烘烤小时。烤箱中烘烤小时。 (二二) 去除去除 RNA 酶酶 (RNase) 的方法的方法 注意：注意：DEPC 是潜在的致癌剂，须小心操作。是潜在的致癌剂，须小心操作。TRIzol 试剂

10、试剂 (Invitrogen 公司公司) 的主要成分为异硫氰酸胍、的主要成分为异硫氰酸胍、 -巯基乙巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠。醇和十二烷基肌氨酸钠。用用 TRIzol 试剂处理细胞或匀浆组织试剂处理细胞或匀浆组织氯仿萃取蛋白质氯仿萃取蛋白质沉淀沉淀 RNA洗涤洗涤 RNA 沉淀沉淀用用 RNase-free ddH2O 溶解溶解 RNA，并置，并置 -20 C保存保存检测检测 RNA (加加 l RNA到到% 琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中)(三三) 用用 TRIzol 试剂制备总试剂制备总 RNA rRNA 80%哺乳动物细胞的总哺乳动物细胞的总 RNA tRNA 和和 snRNA 10% mR

11、NA 1-3%(四四) RNA 的检测的检测用琼脂糖凝胶电泳检测：用琼脂糖凝胶电泳检测： 哺乳动物细胞总哺乳动物细胞总 RNA 中中18S rRNA 和和 28S rRNA 的大的大小及强度；小及强度； 细菌总细菌总 RNA 中中 16S rRNA 和和 23S rRNA 的的大小及大小及强度。强度。RNA 浓度浓度 = OD260 x 40 g/ml x 稀释倍数稀释倍数不同物种的不同物种的 rRNA 分子分子物种物种rRNA大小大小 (kb)人类人类18S1.928S5.0小鼠小鼠18S1.928S4.7果蝇果蝇18S2.228S2.8大肠杆大肠杆菌菌16S1.523S2.9RNA Mar

12、kers (0.28 - 6.58 kb);2. 小鼠脑组织中的总小鼠脑组织中的总 RNA;3. 大鼠脑组织中的总大鼠脑组织中的总 RNA1 2 3 RNA Markers (0.5 - 9.0 kb);2. 大肠杆菌总大肠杆菌总 RNA18S rRNA28S rRNA16S rRNA23S rRNA1.5 kb3.0 kb6.58 kb4.98 kb1 21.90 kb1.38 kb3.64 kb 2.60 kb 0.96 kb0.62 kb0.28 kb 用用 SDS 和和 NaOH 裂解细菌，使质粒裂解细菌，使质粒 DNA 从细从细胞中释放出来。胞中释放出来。 NaOH 使细菌的染色体使

13、细菌的染色体 DNA 及质粒及质粒 DNA 变性。变性。 用用 KAc 中和中和 NaOH，质粒，质粒 DNA 迅速复性并恢迅速复性并恢复天然的超螺旋结构复天然的超螺旋结构; 高分子量的染色体高分子量的染色体 DNA 难难于复性而与细胞碎片一起沉淀下来，而质粒于复性而与细胞碎片一起沉淀下来，而质粒 DNA 存在于上清中。存在于上清中。(一一) 碱裂解法原理碱裂解法原理三、质粒三、质粒 DNA 的制备的制备悬浮细胞悬浮细胞细胞裂解、基因细胞裂解、基因组组 DNA 及质粒及质粒 DNA 变性变性质粒质粒 DNA 复性复性收获携带质粒的大肠杆菌收获携带质粒的大肠杆菌将菌体悬浮在溶液将菌体悬浮在溶液

14、I (50 mM Tris-Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA; 100 g/ml RNase A) 中中加溶液加溶液 II (200 mM NaOH; 1% SDS)，5 分钟分钟加溶液加溶液 III (3 M KAc, pH 5.5)离心后取上清离心后取上清, 加入等体积的酚加入等体积的酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇离心后取水相离心后取水相, 加加 2.5倍体积的乙醇倍体积的乙醇离心后得到离心后得到 DNA 沉淀沉淀, 用用 70乙醇洗涤乙醇洗涤 DNA 沉淀沉淀空气干燥空气干燥 DNA 沉淀沉淀, 将将 DNA 溶解在溶解在 TE (10 mM TrisCl, pH 8.0; 1

15、mM EDTA, pH 8.0 ) 或或 ddH2O 中中(二二) 质粒的制备过程质粒的制备过程质粒提取试剂盒质粒提取试剂盒(1) OD260/OD280 值值OD260：测定质粒：测定质粒 DNA 在在 260 nm时的光吸收值时的光吸收值OD280：测定质粒中所污染的蛋白质在：测定质粒中所污染的蛋白质在 280 nm 时的光吸收值时的光吸收值OD260/OD280 值表示质粒的纯度值表示质粒的纯度:当当 OD260/OD280 1.7 时表示质粒较纯。时表示质粒较纯。质粒质粒 DNA 浓度浓度 = OD260 x 50 g/ml x 稀释倍数稀释倍数(三三) 质粒的鉴定质粒的鉴定(2) 质

16、粒的电泳质粒的电泳http:/ (electrophoresis)带电荷物质在电场中移带电荷物质在电场中移动的现象叫电泳。动的现象叫电泳。 DNA 或或 RNA 分子带负电荷，在电场作用下，分子带负电荷，在电场作用下，DNA 或或 RNA 分子由负极向正极移动。分子由负极向正极移动。 DNA 或或 RNA 分子量越大，迁移速率越慢，反分子量越大，迁移速率越慢，反之，分子量越小，迁移速率快。之，分子量越小，迁移速率快。 不同构象的不同构象的 DNA 或或 RNA 分子，迁移速率不同。分子，迁移速率不同。一、核酸电泳原理一、核酸电泳原理 用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和纯化用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和

17、纯化 DNA 分分子。子。 用变性琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定用变性琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定 RNA 分子。分子。 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 DNA 测序反测序反应中合成的系列单链应中合成的系列单链 DNA 片段片段 (5-500 bp)。 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同构象的单链用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同构象的单链 DNA 分子。分子。二、核酸电泳类型二、核酸电泳类型电泳仪电泳仪水平电泳装置水平电泳装置迁移方向迁移方向样品槽样品槽电泳缓冲液电泳缓冲液琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶- + 琼脂糖琼脂糖 (agarose) 是是 D- 和和 L-半乳糖残基通过半乳糖残基通过 -

18、(13) 和和 -(14) 糖苷键交替构成的线状聚合物，琼脂糖凝胶可糖苷键交替构成的线状聚合物，琼脂糖凝胶可形成孔径为形成孔径为 50 nm 到到 200 nm 的分子筛。的分子筛。 琼脂糖凝胶的分辨率较低，但分离范围较大。琼脂糖凝胶的分辨率较低，但分离范围较大。(一一) DNA 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1. 琼脂糖凝胶浓度与琼脂糖凝胶浓度与 DNA 分离效果分离效果琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶浓度浓度 (%)线状线状 DNA 分子的有效分离范围分子的有效分离范围 (kb)0.530 1.00.712 0.81.010 0.51.27 0.41.53 0.21.5-2.0% 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶细

19、胞凋亡时细胞凋亡时 DNA ladder 的检测的检测2. 常用电泳缓冲液常用电泳缓冲液缓缓冲冲液液工工作作液液储储存存液液/LTAE1 X50 X40 mM Tris-乙乙酸酸242 g Tris1 mM EDTA57.1 ml 冰冰乙乙酸酸100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)TBE0.5 X10 X45 mM Tris-硼硼酸酸108 g Tris1 mM EDTA55 g 硼硼酸酸40 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)TPE1 X10 X90 mM Tris-磷磷酸酸108 g Tris2 mM EDTA15.5 ml 磷磷酸酸40 ml 0.5 M EDTA

20、 (pH 8.0) 6X 样品缓冲液：样品缓冲液：0.25 溴酚蓝溴酚蓝0.25 二甲苯氰二甲苯氰 FF40 蔗糖蔗糖 溴酚蓝和二甲苯氰溴酚蓝和二甲苯氰 FF 用来预测用来预测 DNA 样品的电泳情况。样品的电泳情况。 在在 0.5X TBE 琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖凝胶电泳中: 溴酚蓝溴酚蓝 300 bp 的线状双链的线状双链 DNA 二甲苯氰二甲苯氰 FF 4000 bp 的线状双链的线状双链 DNA 蔗糖可以增加样品密度以保证蔗糖可以增加样品密度以保证 DNA 沉入加样孔内。沉入加样孔内。3. 样品缓冲液样品缓冲液DNA 碱基平面碱基平面NH2C2 H5H2N N+Br-溴化乙啶溴化乙啶

21、(Ethidium bromide, EB)EB/2.5 碱基碱基4. 琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中 DNA 的检测的检测EB 终浓度：终浓度： 0.5 g/ml(1) 将将 EB 直接加入琼脂糖凝胶中染色。直接加入琼脂糖凝胶中染色。 便于观察便于观察 DNA 的电泳情况，但的电泳情况，但 EB 嵌入嵌入 DNA 分子后，分子后， 会改变会改变 DNA 分子的迁移速率分子的迁移速率 。(2) 电泳结束后将琼脂糖凝胶浸入电泳结束后将琼脂糖凝胶浸入 EB 染色液中染色液中染色。染色。注意：注意：EB 是潜在的致癌剂，须小心操作。是潜在的致癌剂，须小心操作。EB 染色方法染色方法 致突变性低于致突变性低

22、于 EB； 敏感性高于敏感性高于 EB； 用于用于 DNA 和和 RNA 的染色；的染色； SYBR Green I 用于用于 dsDNA 的染色；的染色； SYBR Green II 用于用于 RNA，ssDNA 的染色的染色； 检测方便检测方便 SYBR Green I 激发光波长：激发光波长：290，380 和和 497 nm； SYBR Green II 激发光波长：激发光波长：254 和和 497 nm; 可用紫外光透射仪、可见光透射仪或激光扫描仪检测可用紫外光透射仪、可见光透射仪或激光扫描仪检测。SYBR Green 染色方法染色方法SYBR Safe DNA gel stain (Molecular Probes) 和和 EB 致突变性的致突变性的 Ames 测试结果测试结果琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶电泳及观察琼脂糖凝胶电泳及观察 凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像结果凝胶成像结果 为防止单链为防止单链 RNA 形成空间结构，需用变性的形成空间结构，需用变性的琼脂糖凝胶即甲醛琼脂糖凝胶即甲醛-琼脂糖凝胶分离琼脂糖凝胶分离 RNA分子。分子。 为防止外源性为防止外源性 RNase 的污染，所用的倒胶槽、的污染