凡纳滨对虾中优势腐败细菌的分离鉴定及抑菌剂的筛选

1、凡纳滨对虾中优势腐败细菌的分离鉴定及抑菌剂的筛选凡纳滨灼虾制吕工艺采用沸盐水煮制的为式对河虾进行处理”环虾中的大部対微生物在熟制过程中会死亡世一些耐热性微生物不能被彻底杀灭1在适宜条件下'残朗的耐热產会迅遠主K,造成刑虾软礪头昂质的劣变编短保质期°对对虾优势腐败珊葫的分隈鉴saw茵剂的箔选为保证对抒制品的安全性和延K保质期整定了碁51L材料1LL1试验原料凡细滨对虾取自汕头市溢海達下养殖l2CJd的半海水虾，选取輔活、芫整、规略一致的个恠试剂ft3-试验试刑Riblc3-1Experimentredeems试別、皓养基名称生产厂家WJSfi天潭市化学试剂三厂木牌北京廉昔汇维科

2、技梧阻处可阿拉怕精天津韦化学试剂三厂甘輻醇上海挟冬实业旬限公刁过氧化氢浙江金料诅敦化需脸份有限公刊结晶紫上海扶生实业有限公司融粉C生化试ffll）北京臾悌星生韧兹术相眼责任如司売廉踮（靈吕吸）脱>>%北京臣泰克生物技术有艰处司乳酸厲球蒔素（倉品级）北爪百泰克牛物我术有眼皆巨潘曲誨（模品吸）北京百泰克生翔枝术有垠公耳多聚彌氨酸（靈品级北京百泰克生物技术有艰址司营养肉透t薛基北京窦博星生物技术有琅義任公司营齐琼脂培养呈北京奚博星生物技术有垠责任公司LB琼脂培养基北京奥博星生物技术有限责任公司精类发酵试验培养基北京奧博星生物技术有琅责任公司淀粉水健试验培养基北京奧博星生物技术有限责任公司

3、柠樣醴盐利用试验培养杲北京奥傅星生物技术有理责任公S仪器与设备表32试验仪器与设备Iabkj3-2Experimentinstrumentandequipments仪器设备生产厂家祐密电子天平梅特勒特利多有艰公司LD2X-3O1G园立式葛压灭菌锅上海申安医疔盏仙通用燮超淨工作台海尔特种电器有限公司DHG-9140A型电热也温鼓风干燥箱上海一恒科学仪話有限公司DZKW-D2型电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器厂LRH-25OF型恒温培养箱上海-恒科学仪器自限公司4（）-10S型均质机上海东华高压均质机厂ZHWY-2102C型摇床上海智城分松仪器制造有限公瓦数显游标E尺常州市华昊机电有限公司牛津杯

4、直径（7.76mm）上海陆斯清空仪器有限公旬方法凡纳滨对虾中优势腐败细菌的分离纯化选取10只新鲜、完整的对虾个体于沸水中袁制3min后，育空封装2VT放至变色，有异味，放入200mL灭菌的营养肉汤培养基中，30弋条件下培养至肉汤明显混浊，取ImL至ICT?至IO-X,取100pL.各稀释度的楮释菌液涂布千営养琼脂平板，30。（：培养48h,挑取优势菌落，于莒养琼脂平板划线分离，30弋培养48h,挑取单菌落保存于营养琼脂斜面。优势菌定义为：在最高稀释度上，菌落数占总菌落数的比咧为10%以.上的菌称之为优势菌每个样品中最多的菌落数达不到10%的，取菌落故最多的前两种作为该样品的优势菌却。形态观察对

5、筛选纯化的优势菌落的颇色、形状、边缘，表面、隍起形状、透明度、菌落质地等萤落形态箱征进行後痉"同时选取单匿落进行革兰氏染色，芽泡染色，观密细菌的个体形态、排列方式，以及芽抱的大小、形状和看生位SS,76生理生化特性鉴定根据常见细菌系统鉴定手册"和伯杰细菌鉴定手册E第八版，对筛选出的优势细菌逬行柠檬酸註利用试验、耐盐性试验、接触輛试验、糖类发嶂试验、运动性试验、甲基红试验、V-P«验和淀籾水解试验。抑菌剂的筛选分别选取壳聚糖、乳酸钮球菌素（Nisin1溶菌琵做为抑菌剂，依据GB2760-2011倉品添加剂卫生标准印中规定的熟制水产品的使用限量，选择抑菌剂的浓度见表I

6、o以3I21中分离纯化的两株优势腐败细菌作为试验菌，将抑菌液用0.22pm细菌谑器过滤，采用牛津杯平板扩散法I®,在苣养谅脂中混入0.2ml浓度为10%仙ml的菌悬液,取抑菌剂200pl加入牛津杯中，每个试验组设三个平行，30°C,培养20h,测冥抑菌圏直径，计算平均值。抑菌裁试验评判标准如下：抑區直径20mm为极敏感十+十”；15mmW抑茵直径20mm为高敏"10mmS抑菌直径VI5mm为中敏"*；7.8mmW抑菌直径VOmm为低敏“+"；抑菌直径W7.8nun为无效“吧表3-3抑菌剂的浓度Iablc33TIkconcaitrationgra

7、dientofbacterialinhibitor抑菌剂浓度（mg/lOOml）芫聚第051.05.010.015.()Nism203.04.05.06.0溶苗筋02030.40.50.63.2结果与分析321凡纳滨対虾优势腐败细菌的鉴走纟日菌園落特征从对虾中分离到两株优势腐败细菌,其茵落形态兀表34所示。茨3-4茵落形态特征Table3-4Colonialmorpliologjcluuaclerislicsofstrainsisolatedfromslimnp种形状边壕表面隆起形状1乳白色圆形干燥扁平不透审软2淡黄色圓形整齐灌湿、粘稠凸起不透朿软321.2细菌个体形态从对虾中分离纯化得到2株

8、优势腐败细菌.】号为革兰氏阳性杆茄.单个、成对或钱状徘列,芽泡楠過形，位于苗体中央；2号为革兰氏阳性球菌,单个或成堆排列不生芽忍321.3生埋生化特性鉴定结果如表3所示，根處常见细菌系统鉴定手田和伯杰细菌鉴定手册，1号屈于芽泡杆菌科苹兰氏阳性芽袍杆菌畐（Hucltus）（不能碑定到种），2号属干苹兰氏阳性海球菌属白色海球菌（kfarinococcus表35生理生化鉴定结果TableM5Idontifkationofbacteriabasedontheofphysiologicalandbiochemicalexperiments菌种菌种试脸1号2号试验1号2号柠樟腹盐利月4-4-4-接MB+7

9、%NaCl+运动性+IO%MC1f甲蔓红+直萄稅产酸+-V-P+木精产韵+4淀粉水解+L-问拉伯精产酸十!%NaCI+廿蟲醇产酸+注:r表示阳性厂表示阴性。抑菌剂的筛选由表36可知.芽抱杆菌属対浓度为05mglOOrnL的壳聚糠敏感对浓度分别为1.0、5.0和】0.0mgOOOmL的尧疑糖表现为中敏，对浓度为15.0mg/lOOmL的壳聚糖表现为高敏；白色海球菌对浓度为05、1A5JX10.0100mL的壳聚椅表现为中敏，对浓度为15.0mg/lOOmL的壳聚糖表现为高敏；2株菌的抑菌妥直径随着壳聚席浓度的培大而増强.不同浓度的Nisin和溶苗臨对芽砲杆菌畐和白色海球苗无抑菌作用。最终礎定壳聚

10、惦作为凡纳滨对虾的抑蒂剂使用浓度为ISOms/lOOmL,走34抑菌试強结果lablc34)Antunicrobialactnihofagainstbacterioisolatedfromshrunp抑菌剂rRS(ing/!(M>n)L)芽泡杆葡属白色海环葡抑菌圉直径(mm)相对抑菌圈宜径(mm)相对戰感度0.59.911.3*1.0101*11.6壳聚宙5.010.3寺124十10.()12.44-4-13.44-4-15.015.8+15.3+2.05.55.230545Nisin4.05.85.25.06.166.066.20.2560.35.26.20.45.95.80.5535.70.6545.63.3讨论有关无艮韬的抑菌机理的推测主要是细菌细胞内側质的正常代谢活动受壳聚折的带电,性质的干尤，出提供酸性水溶性条件时，壳聚韬会形成NH“，阳离子吸附细苗表面带负电的个体，使之賢集沉淀，阻碍菌体的正常代谢剛，另外由于正负电荷相互作用，改变细胞膜通透性，使胞内的蛋白誨以及其他成分泄露，从而引起细菌的死亡厂呵，本研究结果表茅水溶性壳聚糖对凡纳潦对虾中分离得到的两株革兰氏阳性优势腐败细菌（芽抱杆菌属和白色海琢葩）有抑茵作用，并且抑菌效果较好，此结果与徐丽敏Ml等水溶性壳聚粮对于南美白对虾的腐败菌芽泡杆菌（胁加）抑菌率只有40%的结果有所不同。壳聚精对芽泡和菌属