高速逆流色谱分离技术

1、2008.4.13高速逆流色谱分离技术高速逆流色谱分离技术及其应用及其应用王 晓主要内容主要内容逆流色谱简介逆流色谱简介高速逆流色谱分离原理高速逆流色谱分离原理pH区带逆流色谱的分离原理及应用区带逆流色谱的分离原理及应用高速逆流色谱分离天然产物的应用实例高速逆流色谱分离天然产物的应用实例逆流色谱发展趋势逆流色谱发展趋势 Introduction of Countercurrent Chromatography, CCC逆流色谱简介逆流色谱简介 HSCCC 分离系统分离系统PumpPump SolventReservoirFractionCollectorRecorderor PCHPLC,TL

2、CMS, NMR AnalysisUV, ELSD, MSSampleInjectorMultilayerCoil PlanetCentrifugeDetector逆流色谱的原理及发展过程逆流色谱的原理及发展过程分配定律：分配定律：NernstNernst, 1891 , 1891 年，年，1 12 2两组分两组分K K相差较大：一次萃取可得到分离相差较大：一次萃取可得到分离较小：多次萃取较小：多次萃取逆流分配法，逆流分配法，2020世纪世纪4040年代年代, ,创始人创始人CraigCraig逆流色谱逆流色谱(DCCC(DCCC) )收集器收集器 进样器进样器溶剂溶剂泵泵约约300300根管

3、柱根管柱上行法上行法 收集器收集器 进样器进样器溶剂溶剂泵泵约约300300根管柱根管柱下行法下行法 缺点缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程长，需要几十小时才能完成一次几个组分的分离长，需要几十小时才能完成一次几个组分的分离高速逆流色谱的原理高速逆流色谱的原理 利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相，利用恒相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相，利用恒流泵连续输入另一相，溶质在两相之间反复分配，按流泵连续输入另一相，溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次

4、序，被依次洗脱。分配系数的次序，被依次洗脱。单相性流体动力学平衡单相性流体动力学平衡两相液体在行星式运动的螺旋管内的两相液体在行星式运动的螺旋管内的混合与分配混合与分配逆流色谱的优点逆流色谱的优点A A、无固相载体，避免了有效成分不可逆吸附和峰形拖、无固相载体，避免了有效成分不可逆吸附和峰形拖尾等缺点；尾等缺点；B B、粗提物可进样分离，分离纯化与制备可同步完成，、粗提物可进样分离，分离纯化与制备可同步完成，有机溶剂消耗少，无损失、高效、快速和制备量大等有机溶剂消耗少，无损失、高效、快速和制备量大等优点优点; ;C C、与、与HPLCHPLC相比，相比，HSCCCHSCCC进样量较大，最多可达

5、几克，进样量较大，最多可达几克，是是HPLCHPLC的的10104 4-10-105 5 倍倍; ;D D、与常压和低压色谱相比，、与常压和低压色谱相比，HSCCCHSCCC的分离能力强，经的分离能力强，经过过1 1次分离就可以得到次分离就可以得到1 1个甚至多个单体，并且分离时个甚至多个单体，并且分离时间短。间短。 逆流色谱分离体系的构成逆流色谱分离体系的构成硬件硬件几何设计几何设计- 螺旋管行星式离心分螺旋管行星式离心分离仪离仪柱径柱径管柱体积管柱体积软件软件- 溶剂体系溶剂体系操作条件操作条件-流速流速柱温柱温转速转速 逆流色谱应用的因素逆流色谱应用的因素 溶剂系统的选择是应用逆流色谱的

6、关键。溶剂系统的选择是应用逆流色谱的关键。 对于其溶剂系统的选择，目前尚无充分对于其溶剂系统的选择，目前尚无充分的理论依据，一般根据实验积累经验。的理论依据，一般根据实验积累经验。 对于一个定型的机器来说，制备分离能对于一个定型的机器来说，制备分离能力决定于溶剂系统的选择和仪器参数力决定于溶剂系统的选择和仪器参数ULUiUiUiiVVAAAK212ULUiUiUiiVVAAAK212(1:2:0.8:2.2)(1:2:0.8:2.2)(1:2:1:2) (1)(1)首先预测要分离物质的极性首先预测要分离物质的极性, , 溶解性特点，溶解性特点，粗粗 选几个溶剂体系。选几个溶剂体系。 (2)(2

7、)建立目标化合物的建立目标化合物的TLCTLC、HPLCHPLC分析条件分析条件。 （3 3）利用）利用HPLCHPLC测定测定K K，并计算容量因子，并计算容量因子a a，1.5K0.5, a21.5K0.5, a2，能够获得理想的分离能够获得理想的分离, ,我们研究表我们研究表明在高极性化合物以明在高极性化合物以K2K2，能获得稳定的分离，能获得稳定的分离。 （4 4）制备性分离。）制备性分离。l溶剂溶剂系统选择的基本步骤系统选择的基本步骤水溶性和强极性水溶性和强极性正丁醇正丁醇- -醋酸醋酸- -水水正丁醇正丁醇- -甲醇甲醇- -水水( (缓冲液缓冲液) )正丁醇正丁醇- -乙酸乙酯乙

8、酸乙酯- -水水( (缓冲液缓冲液) )乙酸乙酯乙酸乙酯- -水水( (缓冲液缓冲液) )中等极性中等极性( (氯仿溶解氯仿溶解) )氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -水水乙酸乙酯乙酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水正己烷正己烷- -乙酸乙酯乙酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水( (石油醚石油醚- -乙酸乙酯乙酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水) )弱极性弱极性( (正己烷溶解正己烷溶解) )正己烷正己烷- -乙腈乙腈正己烷正己烷- -甲醇甲醇- -水水正己烷正己烷- -乙酸乙酯乙酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水( (石油醚石油醚- -乙酸乙酯乙酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水) )天然产物天然产物HSCCCHSC

9、CC溶剂系统选择溶剂系统选择（皂苷、强心苷、黄（皂苷、强心苷、黄 酮苷、多酚类等）酮苷、多酚类等）（香豆素、醌类、苯丙（香豆素、醌类、苯丙 素、生物碱、黄酮等）素、生物碱、黄酮等）（萜类、甾体、脂肪酸等）（萜类、甾体、脂肪酸等）Selection of solvent systemsHSCCC黄酮类化合物黄酮类化合物生物碱化合物生物碱化合物蒽醌类化合物蒽醌类化合物香豆素化合物香豆素化合物萜类化合物萜类化合物木脂素类化合物木脂素类化合物多酚类化合物多酚类化合物目前目前HSCCCHSCCC的技术定位的技术定位（1）精细分离）精细分离（2）高纯度、高附加值物质制备）高纯度、高附加值物质制备（3）精确

10、测定的高效前处理）精确测定的高效前处理 高速逆流色谱在天然产物分离高速逆流色谱在天然产物分离中的应用举例中的应用举例Application of HSCCC in separation of natural products HOH3COHNOHOH3COHNOHOH3COHNOAU0.000.100.200.300.400.50Minutes5.0010.0015.0020.0025.0030.00AU0.000.200.400.600.80Minutes5.0010.0015.0020.0025.0030.00AU0.000.501.00nm250.00300.00350.00227.82

11、79.8AU0.000.200.400.60nm250.00300.00350.00227.8278.6AU0.000.050.100.15Minutes5.0010.0015.0020.0025.0030.00AU0.000.020.040.060.080.100.12Minutes5.0010.0015.0020.0025.0030.00AU0.000.200.400.60nm250.00300.00350.00278.6No.Solvent systemsHonokiolSeparation factors (a)Magnolol Hexane:ethyl acetate: methan

12、ol:waterK1 K211:1:1:16.96(2.18)15.2021:0.8:1:0.82.92(2.20)6.4331:0.6:1:0.61.03(2.51)2.5941:0.4:1:0.40.38(2.39)0.9151:0.4:1.1:0.40.26(3.12)0.8161:0.4:1.2:0.40.21(2.86)0.6071:0.2:1:0.20.06(3.50)0.21Table 1 Partition coefficients and separation factors (a) of honokiol and magnolol 分离溶剂系统的选择分离溶剂系统的选择 和厚

13、朴酚与厚朴酚高速逆流色谱分离和厚朴酚与厚朴酚高速逆流色谱分离 AU0.000.200.400.60Minutes5.0010.0015.0020.0025.0030.0035.00AU0.001.002.00nm220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.0025.730BAU0.000.100.200.30Minutes5.0010.0015.0020.0025.0030.0035.00AU0.000.501.001.502.00nm220.00240.00260.00280.00300.00320.00340.00

14、360.00380.0017.258C和厚朴酚和厚朴酚厚朴酚厚朴酚23连续制备分离连续制备分离 Separation and Purification Technology 57 (2007) 235239pressure of 30 MPa, a temperature of 50 0C, and a sample particlesize of 4060 meshChromatogram of the crude extract by preparative HSCCC. n-hexane-ethyl acetate- methanol-water (1:0.5:1:0.5, v/v);

15、sample size: 1.5 g; retention of stationary phase: 55%. (A)AU0.000.200.40Minutes5.0010.0015.0020.00AU0.000.200.40Minutes5.0010.0015.0020.00AU0.000.200.40nm250.00300.00350.00279.8(B)Phtochem. Anal. (2008)(A)(C)(B)aaaChromatograms of the crude extract from Angelica sinensis by analytical HSCCC OOOOOOF

16、igure 1 Chemical structure of Z-ligustilide Absorbance ( m AU ) / 254nmTime (min)Figure 3 Chromatograms of the crude extract from Angelica sinensis by preparative HSCCC. AU0.000.200.400.600.80Minutes5.0010.0015.0020.0025.0030.00(B)AU0.000.200.40nm250.00300.00350.00279.8327.4AU0.000.200.40Minutes5.00

17、10.0015.0020.0025.0030.00(A)Figure 4 (A) HPLC chromatogram of the extract from Angelica sinensis.; (B) HPLC analyses and UV spectrum of the Z-ligustilide purified with HSCCC. 超临界超临界COCO2 2 萃取条件的优化及放大萃取条件的优化及放大高速逆流色谱分离与纯化高速逆流色谱分离与纯化 HPLC HPLC 分析及分析及HSCCCHSCCC峰的鉴定峰的鉴定分离溶剂系统的选择分离溶剂系统的选择 0.20.40.60.811.

18、21.42630344050601020 2040 4060Pressure(MPa) Temperature() Particlesize(mesh)Extraction Yield(mg/g)psoralen isopsoralenFig. 3 Effects of pressure, temperature, and sample particle size on yield of psoralen and isopsoralen. 用超临界用超临界COCO2 2萃取补骨脂的最优萃取条件萃取补骨脂的最优萃取条件: :萃取压萃取压力力26MPa26MPa、萃取温度、萃取温度6060、物料的

19、粒度为、物料的粒度为40-6040-60目。目。Hexane-ethyl acetate-methanol-water补骨脂素和异补骨脂素的逆流色谱分离补骨脂素和异补骨脂素的逆流色谱分离（）OOOOOOHexane-ethyl acetate-methanol-water(1:0.7:1:0.8)（）AU0.000.200.400.60Minutes2.004.006.008.0010.0012.0014.00AU0.000.501.00nm250.00300.00350.0010.610(C)AU0.000.200.40Minutes2.004.006.008.0010.0012.0014.

20、00AU0.000.200.40nm250.00300.00350.0011.920牛蒡子中含有木脂素化合物，主要成分为牛蒡子牛蒡子中含有木脂素化合物，主要成分为牛蒡子苷等苷等 抗肾病变作用抗肾病变作用 抗肿瘤作用抗肿瘤作用 增强机体免疫功能增强机体免疫功能 牛蒡子苷在肠道微生物的作用下可转变为牛蒡子牛蒡子苷在肠道微生物的作用下可转变为牛蒡子苷元，苷元具有抗白血病和抗苷元，苷元具有抗白血病和抗HIV-1HIV-1的活性的活性 OOHOHOHOOHCH3OOOCH3OCH3OHPLC 分析及分析及HSCCC峰的鉴定峰的鉴定分离溶剂系统的选择分离溶剂系统的选择 高速逆流色谱分离与纯化高速逆流色谱分

21、离与纯化 样品的提取样品的提取 乙醇加热回流乙醇加热回流 粉碎牛蒡子粉碎牛蒡子 减压浓缩减压浓缩 石油醚石油醚 乙酸乙酯乙酸乙酯 正丁醇正丁醇萃取萃取大孔吸附树脂大孔吸附树脂 30%30%乙醇洗脱乙醇洗脱 逆流色谱分离纯化牛蒡子苷逆流色谱分离纯化牛蒡子苷 AU0.000.100.200.30Minutes5.0010.0015.0020.0025.00AU0.000.501.00nm250.00300.00350.0011.278(A)AU0.000.100.200.30Minutes5.0010.0015.0020.0025.00AU0.000.501.00nm250.00300.00350

22、.0011.292(B)Ethyl acetaten-butanol ethanolwater (5:0.5:1:5)Preparative Separation cichoric acid from Echinacea purpurea byHigh-speed Counter-current ChromatographyABa A 正己烷正己烷/乙酸乙酯乙酸乙酯/甲醇甲醇/水水(1:4:2:5.5 ) B正己烷正己烷/乙酸乙酯乙酸乙酯/甲醇甲醇/0.5%乙酸乙酸 n-hexaneethyl acetatemethanolwater (1:0.8:1:1, v/v) Isolation an

23、d identification of four flavonoid constituents from the flowers of Paeonia suffruticosa by high-speed counter-current Chromatography. Journal of Chromatography A, 2005 1075:127-131 牡丹花化学成分的分离与鉴定牡丹花化学成分的分离与鉴定聚酰胺柱聚酰胺柱, ,乙醇梯度洗脱乙醇梯度洗脱30%30%乙酸乙酯萃取物乙酸乙酯萃取物60%60%90%90%HSCCCHSCCCHSCCCHSCCC原料乙醇超声萃取石油醚萃取物石油醚

24、萃取物正丁醇萃取物正丁醇萃取物图图1 30%乙醇洗脱物的制备乙醇洗脱物的制备HSCCC色谱图色谱图OOHOHORha (1 6) Glc O OOHOHGlc-O-OOHOOHOHGlc-O-OOHOOOHOHGlc - O - OH图图2 90%2 90%乙醇乙醇洗脱物的制备洗脱物的制备HSCCC色谱图色谱图. 氯仿、甲醇和氯仿、甲醇和水（水（5:3:2,V/V5:3:2,V/V）OOHOHHO芹菜素芹菜素OOOHOHHOH山奈山奈酚酚OOHOHOHHO木樨草素木樨草素PH区带精制逆流区带精制逆流色谱色谱PH Zone Refining CCC Introduced by Ito in 19

25、94逆流色谱逆流色谱 Mechanism of pH-zone-refining CCC Advantage of this method 优点 Large sample capacity 上样量大 Concentrating minor impurities for detection onitored by the pH of the effluent pH计监测馏分 Yielding highly concentrated fractions 产物浓缩应用举例应用举例Application of PH-Zone-Refining CCCJournal of Separation Scie

26、nce 2007 HOHOCCHOCOOHCOCOCHCOOHCH2OHOHOHOOHOHOHHStructure of salvianolic acid B Chromatogram of the crude extract from S. miltiorrhiza Bunge by pH-z- CCC separation. Solvent system: MtBEwater (1:1, v/v), 10 mM TFA in the upper organic stationary phase and 10 mM aqueous ammonia in the lower phasesamp

27、le size: 2.0 g; AU0.000.501.00Minutes5.0010.0015.0020.0025.0030.00(Crude sample)123AU0.000.200.400.600.801.00Minutes5.0010.0015.0020.0025.0030.00（A）1AU0.000.501.00nm250.00300.00350.00AU0.000.501.00Minutes5.0010.0015.0020.0025.0030.00(B)3AU0.000.501.00nm250.00300.00350.00AU0.000.200.400.600.801.00Min

28、utes5.0010.0015.0020.0025.0030.00AU0.000.501.00nm250.00300.00350.00(C)2Journal of Chromatography A, 2006， 1103，166-169 ()()ba采用采用MTBE-MTBE-乙腈乙腈- -水系统，以三氟乙酸为保留酸，氨水为洗脱碱，分离紫锥菊水系统，以三氟乙酸为保留酸，氨水为洗脱碱，分离紫锥菊提取物，从提取物，从3.03.0提取物中获得提取物中获得563mg563mg，纯度为，纯度为95%95%的菊苣酸的菊苣酸 Preparative separation of alkaloids from

29、the crude extract of Corydalis decumbensJournal of Chromatography A, 1115 (2006) 267270Analysis and identificationAnalysis and identificationSelection of solvent systemSelection of solvent systemSampleSampleSeparation by pH zone refining CCCSeparation by pH zone refining CCCSample preparation Sample

30、 preparation Extracted by 95% EtOHExtracted by 95% EtOH Residue Residue 1%HCl1%HCldepositdepositAcidic extractAcidic extractNH3-waterNH3-water Selection of solvent system Kbase 1 Good solubility of the sample in the solvent Kacid 1 MtBE : H2O =1:1 MtBE : CH3CN:H2O=2:2:3system(A)(B)(C)Fig.2. pH-Zone-

31、refining CCC separation of the extract from C. decumbens. (A) retainer: 5 mM TEA, eluter: 5 mM HCl; (B) retainer: 10 mM TEA, eluter: 10 mM HCl 10 mM (C) retainer: 10 mM TEA, eluter: 10 mM HClABCAU0.000.200.400.600.80Minutes2.004.006.008.0010.0012.00321AAU0.000.501.00nm220.00380.00AU0.000.501.00Minut

32、es2.004.006.008.0010.0012.00AU0.001.002.00nm220.00380.00AU0.000.20Minutes2.004.006.008.0010.0012.00CAU0.000.200.400.60Minutes2.004.006.008.0010.0012.00AU0.001.002.00nm220.00380.003DprotopinetetrahydropalmatinebicucullineNOOOHONHHOOFig. 1. Structure of neferineFig. 2 Chromatogram of the crude neferin

33、e extracted from Nelumbo nucifera Gaertn by pH-zone-refining counter-current chromatographyAU0.000.100.200.300.40Minutes5.0010.0015.0020.0025.00AU0.000.501.00nm250.00300.00350.00221.9283.3(C)0.000.100.200.300.400.500.60Minutes5.0010.0015.0020.0025.00Fig. 3. The results of HPLC analyses of the crude

34、neferine extracted from Nelumbo nucifera Gaertn and purified by pH-zone-refining CCC fractionAU0.000.050.100.150.200.25Minutes5.0010.0015.0020.0025.000.000.020.040.060.080.100.12Minutes5.0010.0015.0020.0025.00(A)(B)Conclusion PH-zone-refining CCC produced efficientseparations of alkaloids ，acids from gramquantities of crude extract from from natural products. HSCCC技术是分离技术领域的一种,并不排斥其它分离技术,相反与其它技术(超临界、超声波、微波、大孔树脂技术等)的结合加快达到我们的目标. 从植物中分离纯化微量化学成分,不仅仅是个技术问题, 还需要一技术策略.超临界萃取超临界萃取( (中低极性化中低极性化合物合物