动物细胞工程制药 (4)

1、关于动物细胞工程制药关于动物细胞工程制药 (4)现在学习的是第一页，共71页第一节第一节 概述概述第二节第二节 动物细胞的形态和生理特性动物细胞的形态和生理特性第三节第三节 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得第四节第四节 动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基第五节第五节 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的基本方法第六节第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式动物细胞大量培养的方法和操作方式第七节第七节 动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器第八节第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求动物细胞产品的纯化方法和质量要求第九节第九节 动物细胞制药的前景与展望动物细

2、胞制药的前景与展望现在学习的是第二页，共71页培养细胞的种类培养细胞的种类 原代细胞培养原代细胞培养 传代细胞培养传代细胞培养培养基不同培养基不同 液体培养液体培养 固体培养固体培养 培养容器和方式不同培养容器和方式不同 静止培养静止培养 旋转培养旋转培养 微载体培养微载体培养 中空纤维培养中空纤维培养 固定化培养固定化培养第五节第五节 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的基本方法现在学习的是第三页，共71页一、细胞分离一、细胞分离1、离心分离法、离心分离法：主要用于从含有细胞的体液，如血液、羊水、：主要用于从含有细胞的体液，如血液、羊水、胸腹水中分离细胞，胸腹水中分离细胞，8001000 r

3、/min离心离心510min2、消化分离法、消化分离法：将生物体的组织块剪碎：将生物体的组织块剪碎用用消化液消化液消化，消化，使组织松散成细胞悬液使组织松散成细胞悬液用缓冲液洗涤、离心、去除用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液残留的消化液获得所需细胞获得所需细胞现在学习的是第四页，共71页消化液的用途消化液的用途：取材进行原代培养时需要将组织块消化解：取材进行原代培养时需要将组织块消化解离形成细胞悬液；传代培养时将贴壁细胞从瓶壁上消化下离形成细胞悬液；传代培养时将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。来。 常用的消化液常用的消化液：胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（：胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰）、胰酶酶

4、-柠檬酸盐、胰酶柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶、链酶蛋白酶、木、胶原酶、链酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等瓜蛋白酶等现在学习的是第五页，共71页二、细胞计数二、细胞计数1、自动细胞计数器计数、自动细胞计数器计数原理：原理：让一定体积的细胞悬液流经一个小孔，并在两个让一定体积的细胞悬液流经一个小孔，并在两个电极间通过，此时通过的细胞就会对电极间的电流产生电极间通过，此时通过的细胞就会对电极间的电流产生干扰而使电压发生改变，这样就会在电子计数器上形成干扰而使电压发生改变，这样就会在电子计数器上形成一个信号被记录下来。一个信号被记录下来。优点：优点：计数速度快计数速度快缺点：缺点：无法分辨活细胞和死细胞，误

5、将细胞结团记录无法分辨活细胞和死细胞，误将细胞结团记录为单个细胞，使计数值偏低为单个细胞，使计数值偏低现在学习的是第六页，共71页2、血球计数板计数、血球计数板计数现在学习的是第七页，共71页 酚蓝染色：死细胞呈蓝色酚蓝染色：死细胞呈蓝色 苯胺黑染色：负染色法，细胞本身不染色苯胺黑染色：负染色法，细胞本身不染色2、血球计数板计数、血球计数板计数现在学习的是第八页，共71页3、结晶紫染色细胞核计数法、结晶紫染色细胞核计数法原理：原理：结晶紫染液属碱性染料，低渗，有螯合钙离子结晶紫染液属碱性染料，低渗，有螯合钙离子的作用，可使细胞分散解离和破碎，将细胞核染成蓝的作用，可使细胞分散解离和破碎，将细胞

6、核染成蓝色。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即色。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即细胞数。细胞数。现在学习的是第九页，共71页4、MTT染色计数法染色计数法MTT：3-(4，5-二甲基噻唑二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 原理：原理：活细胞内的线粒体脱氢酶能将活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不可转变为不可溶性的紫色的甲溶性的紫色的甲臜臜结晶，可溶于二甲亚砜（结晶，可溶于二甲亚砜（DMSO）。）。 MTT结晶形成的量与细胞数成正比。用酶标仪在结晶形成的量与细胞数成正比。用

7、酶标仪在490nm处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。灵敏度高；灵敏度高；MTT有致癌性，有致癌性，DMSO极易渗透皮肤。极易渗透皮肤。现在学习的是第十页，共71页三、细胞传代三、细胞传代 悬浮细胞的传代悬浮细胞的传代：加入一倍或几倍的生长液，然后分：加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶种两只或多只培养瓶 贴壁细胞的传代贴壁细胞的传代：先消化再分种：先消化再分种现在学习的是第十一页，共71页贴壁细胞传代的注意事项贴壁细胞传代的注意事项 消化前确定细胞有无污染消化前确定细胞有无污染 加入消化液量要适当，摇动时能盖满单层细胞即可加入消化液量要适当

8、，摇动时能盖满单层细胞即可 消化时间不宜过长，室温静置消化时间不宜过长，室温静置2-5min 终止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培养基终止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培养基 分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数以分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数以20-30万个万个/ml，每次每次1传传2或或1传传3为宜；为宜； 已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过2-3次次 二倍体细胞每次传代时应写上传代次数二倍体细胞每次传代时应写上传代次数 传代后每天或隔一天换液，传代后每天或隔一天换液，3-5d传代一次传代一次现在学习的是第十二页，共71页四、细胞的冻

9、存和复苏四、细胞的冻存和复苏1、细胞的冻存、细胞的冻存采用液氮低温（采用液氮低温（-196）冻存：加保护剂如）冻存：加保护剂如甘油甘油和和二甲亚砜二甲亚砜；冷冻速度以冷冻速度以1/min的速度下降为宜的速度下降为宜注意事项注意事项：冻存前一天换液培养；冻存前一天换液培养；细胞密度以细胞密度以1-2106个个/ml为宜；为宜； 冻存用培养基应与实际使用的一致，冻存用培养基应与实际使用的一致，DMSO过滤除菌；过滤除菌； 检查安踣的密封性；检查安踣的密封性；标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。现在学习的是第十三页，共71页2、细胞的复苏、细胞的复苏（总的要求是（

10、总的要求是快融快融）注意事项注意事项： 操作中注意防护，戴面罩和手套；操作中注意防护，戴面罩和手套； 从液氮中取出后，立即丢入从液氮中取出后，立即丢入37-40温水的搪瓷杯中，并搅温水的搪瓷杯中，并搅动加速融化；动加速融化； 用乙醇消毒安踣外表；用乙醇消毒安踣外表； 尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液；尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液； 隔天观察细胞生长情况，再换液一次。隔天观察细胞生长情况，再换液一次。现在学习的是第十四页，共71页一、动物细胞大规模培养的方法一、动物细胞大规模培养的方法二、动物细胞培养的操作方式二、动物细胞培养的操作方式第六节第六节 动物细胞大量培养的方法和动物细胞大

11、量培养的方法和操作方式操作方式现在学习的是第十五页，共71页一、动物细胞大规模培养的方法一、动物细胞大规模培养的方法 依细胞种类：依细胞种类： 原代培养原代培养 传代培养传代培养依培养基：依培养基： 液体培养液体培养 固体培养固体培养现在学习的是第十六页，共71页 依培养容器和方式：依培养容器和方式： 静止培养、旋转培养、静止培养、旋转培养、 搅拌培养、微载体培养搅拌培养、微载体培养 中空纤维培养、中空纤维培养、 固定床或流化床培养固定床或流化床培养 从生产实际分为：从生产实际分为： 悬浮培养悬浮培养 贴壁培养贴壁培养 贴壁贴壁-悬浮培养悬浮培养现在学习的是第十七页，共71页1、悬浮培养、悬浮

12、培养 即让细胞自由地悬浮于培养基内生长繁殖。适用于一即让细胞自由地悬浮于培养基内生长繁殖。适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。贴壁细胞。优点：优点：操作简便，培养条件比较单一，操作简便，培养条件比较单一，传质传质和和传氧传氧较好，容易较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴细扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴细菌发酵的经验；可连续收集部分细胞进行移植继代培养，菌发酵的经验；可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械

13、损害；细胞及机械损害；细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。隆培养。缺点：缺点：细胞体积较小，较难采用灌流培养，细胞密度较低细胞体积较小，较难采用灌流培养，细胞密度较低现在学习的是第十八页，共71页 培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，需采培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，需采用搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及一定速度通用搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及一定速度通入入含含5%CO2的无菌空气的无菌空气，保持细胞悬浮状态并维持培，保持细胞悬浮状态并维持培养液溶解氧和养液溶解氧和pH。 不同

14、细胞悬浮条件不同。为使细胞不致凝集、成团或沉不同细胞悬浮条件不同。为使细胞不致凝集、成团或沉淀，在配制培养基的基础盐溶液中淀，在配制培养基的基础盐溶液中不加钙和镁离子不加钙和镁离子。间。间歇或连续更换部分培养液，可维持歇或连续更换部分培养液，可维持pH值，若使用值，若使用HEPES缓冲盐溶液可不必连续通入含缓冲盐溶液可不必连续通入含5%CO2的空气。的空气。现在学习的是第十九页，共71页悬浮培养的反应器悬浮培养的反应器现在学习的是第二十页，共71页2、贴壁培养、贴壁培养 是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于

15、兼性贴方法。适用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。壁细胞。优点：优点：适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养缺点：缺点：操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，传代或扩大培养时需先消化，培养条件不易均一，传传代或扩大培养时需先消化，培养条件不易均一，传质和传氧较差。质和传氧较差。现在学习的是第二十一页，共71页3、贴壁、贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）悬浮培养（假悬浮培养） 微载体培养微载体培养 包埋和微囊培养包埋和微囊培养 结团培养结团培养现在学习的是第二十二页，共71页（1）微载体培养）微载体培养 将动物细

16、胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法，或称微培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法，或称微珠培养法。珠培养法。 制备微载体的材料主要有：制备微载体的材料主要有： 葡聚糖葡聚糖 明胶明胶 玻璃玻璃 纤维素纤维素等等现在学习的是第二十三页，共71页 微载体培养的优点：微载体培养的优点： 既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的基本要求，又由于载体体积很满足绝大多数细胞的基本要求，又由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由悬小

17、，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。现在学习的是第二十四页，共71页理想微载体需具备的条件理想微载体需具备的条件 微载体表面性质与细胞有良好的微载体表面性质与细胞有良好的相容性相容性；微载体的材料无毒性；微载体的材料无毒性； 微载体的材料是微载体的材料是惰性惰性材料；材料； 材料比重为材料比重为1.030-1.045 g/ml；粒径粒径60-250 m（溶胀后），大小均一；（溶胀后），大小均一； 具有好的光学透明性；具有好的光学透明性； 基质的性质是软性的；基质的性质是软性的；可耐可耐120 高温，便

18、于采用高压蒸汽灭菌高温，便于采用高压蒸汽灭菌 原料充分，制作简便，价格低廉，可反复使用原料充分，制作简便，价格低廉，可反复使用现在学习的是第二十五页，共71页 从从固 体 微 载 体固 体 微 载 体发 展 到发 展 到多 孔 微 载 体多 孔 微 载 体（p o r o u s microcarrier）或）或多孔微球多孔微球：极大增大了供细胞贴：极大增大了供细胞贴附的比表面积，同时适用于悬浮细胞的培养。附的比表面积，同时适用于悬浮细胞的培养。现在学习的是第二十六页，共71页（2）包埋和微囊培养）包埋和微囊培养包埋法：包埋法：将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶

19、原及血纤维等海绵状基质中等海绵状基质中 微囊法：微囊法：由包埋法衍生而来，将包埋的颗粒经液化由包埋法衍生而来，将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊处理而成为微囊 可用于包埋细胞的载体材料：可用于包埋细胞的载体材料：人工合成的高分子聚合人工合成的高分子聚合物物（聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等等）、糖类糖类（如纤维素、琼脂、琼脂糖、（如纤维素、琼脂、琼脂糖、K-卡拉胶、卡拉胶、海藻酸钙、壳聚糖等海藻酸钙、壳聚糖等）、蛋白质蛋白质（如胶原、明胶、纤维如胶原、明胶、纤维蛋白等蛋白等）现在学习的是第二十七页，共71页包埋或微囊培养法的优点包埋或微囊

20、培养法的优点包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害。切力的损害。 可以获得较高的细胞密度，一般都在可以获得较高的细胞密度，一般都在107-108 个个/ml以上。以上。 当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。从而有利于下游产物的纯化。 可采用多种生物反应器进行大规模培养。可采用多种生物反应器进行大规模培养。现在学习的是第二十八页，共71页包埋或微囊培养培养装置包埋或微囊培养培养装置现在学习的是第二十九页，共71页中空纤维培养器优点中空纤维培养器优点

21、现在学习的是第三十页，共71页（3）结团培养）结团培养 利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法培养，可获得高密度的细胞。的方法培养，可获得高密度的细胞。 优优 点点：操作简便，节省了用于微载体的成本。：操作简便，节省了用于微载体的成本。现在学习的是第三十一页，共71页二、动物细胞培养的操作方式二、动物细胞培养的操作方式 分批式操作分批式操作补料补料-分批（或流加式）操作分批（或流加式）操作（细菌生产中常用）（细菌生产中常用） 半连续式操作半连续式操作 连续式操作连续式操作（个别情况下用于悬浮细胞的培养）（个别情况下用于悬浮细胞的培养） 灌流式

22、操作灌流式操作现在学习的是第三十二页，共71页1、分批式操作、分批式操作将细胞和培养基将细胞和培养基一次性加入一次性加入反应器内进行培养，此后细反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。培养结束。 先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。作

23、用后，将反应物取出。现在学习的是第三十三页，共71页2、半连续式操作、半连续式操作定义：定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。 优点：优点：操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和

24、产品产量一直保持在较收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。高的水平。现在学习的是第三十四页，共71页3、灌流式操作、灌流式操作 定义：定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。但细胞留在反应器内，使细时不断地补充新鲜培养基。但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。胞处于一种不断的营养状态。现在学习的是第三十五页，共71页细胞可处在较稳定的良好的环境中，营养条件好，有细胞可处在较稳定的良好的环境中，营

25、养条件好，有害代谢废物浓度低；害代谢废物浓度低；可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量产品产量；产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于有利于产品质量产品质量的提高；的提高；培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高，培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高，生产成生产成本本明显降低。明显降低。灌流式操作的优点灌流式操作的优点现在学习的是第三十六页，共71页一、动物细胞生物反应器的类型一、动物细胞生物反应器的类型二、动物细胞生物反应器的检测控制系统二、动物细胞生物反应器的检测控制系统三、培

26、养条件的控制三、培养条件的控制第七节第七节 动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器现在学习的是第三十七页，共71页生物反应器必备条件生物反应器必备条件制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性无毒性的的 生物反应器的结构必须使之具有良好的生物反应器的结构必须使之具有良好的传质传质、传热传热和和混合混合的性能的性能 密封性能密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物的污良好，可避免一切外来的不需要的微生物的污染染 对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节对培养环境中多种

27、物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精确度高，能保持环境质量的均一控制，控制的精确度高，能保持环境质量的均一现在学习的是第三十八页，共71页可长期连续运转可长期连续运转 容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积胞或微生物的沉积拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒，便于操作维修拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒，便于操作维修设备成本尽可能低设备成本尽可能低生物反应器必备条件生物反应器必备条件现在学习的是第三十九页，共71页按规模大小可分为：按规模大小可分为：实验室规模：实验室规模：20L，用于培养工艺的研究，用于培养工艺的研究

28、;中试规模：中试规模：20100L，提供一定量的产品，供纯，提供一定量的产品，供纯化、临床前的各种检测和临床观察，也包括进一步化、临床前的各种检测和临床观察，也包括进一步的工艺优化实验的工艺优化实验;生产规模：生产规模：100L，用于生产，提供产品。，用于生产，提供产品。动物生物反应器动物生物反应器现在学习的是第四十页，共71页一、动物细胞生物反应器的类型一、动物细胞生物反应器的类型 搅拌罐式生物反应器搅拌罐式生物反应器气升式生物反应器气升式生物反应器 透析袋或膜式生物反应器透析袋或膜式生物反应器 中空纤维生物反应器中空纤维生物反应器 固定床或流化床式生物反应器固定床或流化床式生物反应器 Ce

29、llGen plus生物反应器生物反应器现在学习的是第四十一页，共71页1、搅拌罐式生物反应器、搅拌罐式生物反应器现在学习的是第四十二页，共71页2、气升式生物反应器、气升式生物反应器现在学习的是第四十三页，共71页3、透析袋或膜式生物反应器、透析袋或膜式生物反应器现在学习的是第四十四页，共71页4、中空纤维式生物反应器、中空纤维式生物反应器现在学习的是第四十五页，共71页5、固定床或流化床式生物反应器、固定床或流化床式生物反应器现在学习的是第四十六页，共71页6、CellGen plus生物反应器生物反应器现在学习的是第四十七页，共71页二、动物细胞生物反应器的检测控制系统二、动物细胞生物反

30、应器的检测控制系统 培养过程中需检测的物化参数：有些需要培养过程中需检测的物化参数：有些需要在线检测在线检测，如如温度温度、pH、搅拌速度搅拌速度、溶氧溶氧等；有些则需要等；有些则需要取样离线取样离线检测检测，如活细胞数、氨基酸浓度分析、葡萄糖乳酸和，如活细胞数、氨基酸浓度分析、葡萄糖乳酸和铵离子的检测等，有些则需在铵离子的检测等，有些则需在检测后计算检测后计算后才能获得，后才能获得，如细胞的群体倍增时间、细胞的比增长率、葡萄糖消耗如细胞的群体倍增时间、细胞的比增长率、葡萄糖消耗率、乳酸产率、生物反应器生产率等。率、乳酸产率、生物反应器生产率等。现在学习的是第四十八页，共71页 动物细胞对搅拌

31、引起的剪切力和气泡很敏感，要保持动物细胞对搅拌引起的剪切力和气泡很敏感，要保持所需的溶氧很困难，常采用的措施有：所需的溶氧很困难，常采用的措施有： 改变进气的组成：不同比例的改变进气的组成：不同比例的O2、N2、CO2和空气和空气 加大通气流量加大通气流量 适当提高转速适当提高转速 在反应器外通气在反应器外通气 加入血红蛋白加入血红蛋白适当提高罐压适当提高罐压现在学习的是第四十九页，共71页三、培养条件控制三、培养条件控制 动物细胞生长缓慢，又具有锚地依赖性，培养时为防止动物细胞生长缓慢，又具有锚地依赖性，培养时为防止污染，除反应器密封性能良好外，还需添加污染，除反应器密封性能良好外，还需添加

32、抗生素抗生素，培，培养过程还要求培养器、管道及接头处所用材质不可释放养过程还要求培养器、管道及接头处所用材质不可释放出对细胞有毒害的物质。出对细胞有毒害的物质。 在分批培养时，随细胞生长，营养消耗，必然产生乳酸在分批培养时，随细胞生长，营养消耗，必然产生乳酸等代谢物的积累，引起细胞衰退死亡，需要等代谢物的积累，引起细胞衰退死亡，需要更换培养液更换培养液或移植继代培养。或移植继代培养。现在学习的是第五十页，共71页 动物细胞培养过程亦应控制一定的环境条件，如培养动物细胞培养过程亦应控制一定的环境条件，如培养温度、溶解氧、温度、溶解氧、pH、罐压及搅拌速度。、罐压及搅拌速度。动物细胞对环境变化适应

33、能力较微生物细胞小得多，故条动物细胞对环境变化适应能力较微生物细胞小得多，故条件控制精密度要求更高。其中特别重要的是溶解氧和件控制精密度要求更高。其中特别重要的是溶解氧和pH的的控制控制现在学习的是第五十一页，共71页Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺细胞和狂犬病毒的培养工艺现在学习的是第五十二页，共71页一、动物细胞产品常用的纯化方法一、动物细胞产品常用的纯化方法二、动物细胞产品的质量要求二、动物细胞产品的质量要求第八节第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求动物细胞产品的纯化方法和质量要求现在学习的是第五十三页，共71页下游纯化工作费钱、难度大下游纯化工作费钱、难度大 成分复杂：成分复杂：工

34、程细胞表达的产品，常常和细胞内容物、工程细胞表达的产品，常常和细胞内容物、培养基成分，特别当采用有血清培养基时小牛血清中的培养基成分，特别当采用有血清培养基时小牛血清中的各种蛋白成分都将与产物混杂在一起，这些成分的物化各种蛋白成分都将与产物混杂在一起，这些成分的物化性质常常和目的产物非常相似，因此很难将他们分离开性质常常和目的产物非常相似，因此很难将他们分离开 作用于人体的药物纯度要求高：作用于人体的药物纯度要求高：由于产品多数用于人体，由于产品多数用于人体，为防杂质对人体的有害作用，对产品的纯度要求很高为防杂质对人体的有害作用，对产品的纯度要求很高现在学习的是第五十四页，共71页大多数动物细

35、胞表达的大多数动物细胞表达的产物产量低，生物活性不稳定产物产量低，生物活性不稳定，因，因此要求纯化过程中所有的操作都应该非常温和、精细，包此要求纯化过程中所有的操作都应该非常温和、精细，包括溶液的温度、括溶液的温度、pH和盐离子强度等都需要严格控制，要和盐离子强度等都需要严格控制，要有相当精密的设备和检测仪器。有相当精密的设备和检测仪器。 由于细胞产品多种多样，它们的氨基酸组成、结构、相由于细胞产品多种多样，它们的氨基酸组成、结构、相对分子质量大小和等电点等都不尽相同，因此对分子质量大小和等电点等都不尽相同，因此分离纯化分离纯化技术的通用性差技术的通用性差，必须根据每一种产品的特点研究开发，必

36、须根据每一种产品的特点研究开发出适合于该产品的专用的分离纯化技术。出适合于该产品的专用的分离纯化技术。现在学习的是第五十五页，共71页一、动物细胞产品常用的纯化方法一、动物细胞产品常用的纯化方法离心（低温离心）离心（低温离心）离子交换层析离子交换层析 凝胶层析凝胶层析 亲和层析亲和层析盐析和有机溶剂沉淀盐析和有机溶剂沉淀透析透析 高压液相层析高压液相层析现在学习的是第五十六页，共71页盐析和有机溶剂沉淀盐析和有机溶剂沉淀 盐析：盐析：溶液中加入无机盐类，破坏蛋白质分子周围的水溶液中加入无机盐类，破坏蛋白质分子周围的水化膜，使蛋白质溶解度降低而析出。化膜，使蛋白质溶解度降低而析出。最常用的中性盐

37、最常用的中性盐有有硫酸铵硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。调节盐浓度和、硫酸钠和氯化钠等。调节盐浓度和pH常同时使用。常同时使用。盐析时蛋白不易变性，结束后需要进行透析、超滤脱盐。盐析时蛋白不易变性，结束后需要进行透析、超滤脱盐。 有机溶剂沉淀：有机溶剂沉淀：加入与水可混溶的有机溶剂，如乙醇、加入与水可混溶的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，也可使蛋白质沉淀。为了避免蛋白质甲醇、丙酮等，也可使蛋白质沉淀。为了避免蛋白质变性必须在低温下操作。变性必须在低温下操作。现在学习的是第五十七页，共71页透透 析析 原理原理：蛋白质分子较大，不能通过半透膜，可以据此：蛋白质分子较大，不能通过半透膜，可以据此将蛋白质

38、与相对分子质量较小的杂质分开。将蛋白质与相对分子质量较小的杂质分开。现在学习的是第五十八页，共71页高压液相层析（高压液相层析（HPLC，high-pressure liquid chromatography） 使用颗粒极细的介质，在高压下分离蛋白质或其他使用颗粒极细的介质，在高压下分离蛋白质或其他分子混合物的层析技术。分子混合物的层析技术。 柱效比经典柱色谱柱高。在色谱柱出口处常常配以高灵敏柱效比经典柱色谱柱高。在色谱柱出口处常常配以高灵敏度的监测器，以及自动描记、分布收集的装置，并用计算度的监测器，以及自动描记、分布收集的装置，并用计算机进行色谱条件的设定及数据处理。机进行色谱条件的设定及

39、数据处理。 现在学习的是第五十九页，共71页二、动物细胞产品的质量要求二、动物细胞产品的质量要求对工程细胞的要求：对工程细胞的要求： 有细胞系的历史资料有细胞系的历史资料 有细胞特性的资料有细胞特性的资料 无细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括反转录病毒无细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括反转录病毒等外来有害因子的污染等外来有害因子的污染现在学习的是第六十页，共71页生产工艺（细胞培养和纯化工艺）的要求：生产工艺（细胞培养和纯化工艺）的要求： 对生产厂房、原材料和试剂的要求对生产厂房、原材料和试剂的要求 对细胞培养的要求对细胞培养的要求 对纯化过程的要求对纯化过程的要求现在学习的是第六十一页，共

40、71页 产品纯度产品纯度 产品生物活性产品生物活性 产品比活性：每毫克蛋白质中含有多少单位生物学活性产品比活性：每毫克蛋白质中含有多少单位生物学活性（U/mg） 产品蛋白质性质的鉴定产品蛋白质性质的鉴定 产品中杂质的检测产品中杂质的检测 产品的稳定性产品的稳定性 产品临床前的安全性和有效性评价产品临床前的安全性和有效性评价 产品临床试验的安全性和有效性评价产品临床试验的安全性和有效性评价对产品的质量要求：对产品的质量要求：现在学习的是第六十二页，共71页一、改进表达载体，提高表达水平和产量一、改进表达载体，提高表达水平和产量二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本二、利用代谢工程，改进培养

41、工艺，降低生产成本三、抑制细胞凋亡，延长培养周期三、抑制细胞凋亡，延长培养周期四、采用糖基化工程，提高产品质量四、采用糖基化工程，提高产品质量五、转基因动物的研究五、转基因动物的研究六、组织工程的研究六、组织工程的研究第九节第九节 动物细胞制药的前景与展望动物细胞制药的前景与展望现在学习的是第六十三页，共71页一、改进表达载体，提高表达水平和产量一、改进表达载体，提高表达水平和产量 采用更强的启动子和增强子采用更强的启动子和增强子 更好的利用扩增系统或寻找高表达位点更好的利用扩增系统或寻找高表达位点 采用和改造更好的宿主细胞采用和改造更好的宿主细胞现在学习的是第六十四页，共71页二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本二、利用代谢工程，改进培养工艺，降