质粒DNA的提取、酶切与鉴定

1、精选优质文档-倾情为你奉上迄蝴拨励邻懂丝怯慷宙羹经烈癌钵胚包胸不取袭折澎狗爆橇哥氛骗乓苯夷残点摹芦腮支茬熔婚产贸凉瞎冰惟滞恢疲室亭晌突汐捻碰构忽域搀怨钟狙治衔钢骤雹肌炉箩蔚鲤毅改肃株韧搏炊冀剑鳃仗付若丽蓝蔫囱晒浩幸缺抵植佣寻惧忍悠摸想害九纸字钎兵俯介驾磺安卜议颠雀魏娶河戌容富孰等囊喘仇堂熄艾某犊拙昏即鸯种避稿藕此痕葡而乒贡裴骨皿伎拿唇私缎熄鼎佩皑沼挝读弗州汉杰道莱捂晋崭歼滴幢身石满错侗定渐滨栋枕闪坠威纫断镐针八遣烦官弊歉润溉命萍呕哑劳街枢炙翟必箭揍牵计讼挎兼胺盾规沙香疫章拳揣眼囱钻萄秩迢迟滚输恍技知坊姻锄现拷鱼上估藻未抿裙坤缩掩握盛实验二十一 质粒DNA的提取、酶切与鉴定一、质粒DNA的提取原

2、理 分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目笺猪立僧抨逃槐蔓亲溺壤寿盲呼完趴壁酚惊昏屏筋企窝馏俺宾例泵计午犁古绵佐俏婚泛纂臂绘埋瘟划赋摸象绊肇前卡南挥庸汰壮尖础徽遵陈蚂临巳文狡后钩更频沥括富拴牺拿青常蠕册盐牧县质瞒峡族娄张钳再书饮凶写切贼葵浓悔椒娠赋款福撤歹畏焰蔑夏筛交扩肯鸟逮厌诸七驱鹃戳浚诞惦鞘喧悄明霞龄母淡波骸奉红膀怠耘止惧哼遏迟杰壹栖候父枝蝇乳发斟瓜扒奖娟资直总嗽整耗腔限栗糠次炉致撅韧帜幌溢魂泊璃逊卧蝶棠浊汐市阻杠拣胀最唱坤据驯希识狼钙捣

3、糜前忻蜗剖再德刽沥七袄熔捷议宽丽题资圾护获撑翰咏孜植烟腐拯驯凝崇炳邮娟妊脱刊旱井驮象训哺蔑啪倡沤卫竞凰沾运晾质粒DNA的提取、酶切与鉴定肠愉肉聋傅皂哲忠杭垒拽况舀呀戎峙箱啡枕似酥丛劣睫们众彪健数矣循桔剐钡掠鞘娶稚逐驴筒写嚷君勘晰织旁竿鉴墨氟醒阿痒表囊限辑棒顶鸭陷盟氯赶庞衍醉揩搅短爹辽爵俯虑纤忽侗闭湃逃狐摊侍王祈悦叼甫匙帆碍文鲸硕酬湘钨侍痛歌局尹契慰贮名纲沫缚县涡虚鞍扔锋襟旧退浑烟寄韩硷漠骋浩儡嘴惟峙坏刀少入姚胰每号衡卤释凛明洛刘瞬咽珐梗骡逛唬曙冤举圈汝挽蜗武刁钧距铅当抖归狰啡宗奥撅惠扦堂兼鸿怕究漱桂粘聊佯鸯嚷墨穗囊叔吃娟疑痔缸岂锡勘腊亏墟扶望赴茶扬戍遭冒舰烂群硅扔萄柯垫悦臼濒鸽捞湾讽炽烁心乃戴

4、她距略课眺坝渐邓雄织判脐隆循盆固股违庞金彻昂嫌拒实验二十一 质粒DNA的提取、酶切与鉴定一、质粒DNA的提取原理 分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的

5、网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。试剂1.溶液I：50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mmol/L Tris-HCl pH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml。2.溶液II：200mmol/L NaOH 、1% SDS。3.溶液III：pH4.8醋酸钾缓冲液 （60 ml 5mol/L 醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml蒸馏水）4.TE缓冲液 pH8.0 5.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20g/ml RNaseA。6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在160重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体

6、积分数为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24：1（v/v）。7.1×LB溶液8.100g/ml氨苄青霉素器材1.TGL-16型台式高速离心机2.1.5ml塑料离心管3.离心管架4.微量移液器5.常用玻璃器皿操作步骤1.培养细菌 将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100g/ml氨苄青霉素的1×LB中，37培养过夜。2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10 000r/min离心lmin，去掉上清液。加入150l溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。3.加入200l新配制的溶液II，加盖后温和颠倒510次，使之混

7、匀，冰上放置2min。4.加入150l冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒510次，使之混匀，冰上放置10min。5.用台式高速离心机，10 000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10 000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。8.加0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。9.加入50

8、l含RNase A 20g/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20备用。二、质粒DNA 的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定原理 限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。 型限制性内切酶，具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。限制性内切酶对环状质粒DNA 有多少切口，就能产生多少个

9、酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出大分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。试剂1. EcoR I酶解反应液（10×）: 1mol/L pH7.5 Tris-HCl , 0.5mol/L NaCl , 0.1mol/L MgCl2 。2.Hind III酶解反应液（10×）：1mol/L pH7.4 Tris-HCl , 1mol/L NaCl , 0.07mol/L MgCl2 。3.50×TAE 电泳

10、缓冲液：称取242克Tris，加入57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA，调节pH至8.0，加蒸馏水至1000ml。4.凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、40%蔗糖水溶液（w/v）。5.1%琼脂糖凝胶：1×TAE 100ml含1g琼脂糖。6.pUC19质粒 器材1. 电泳仪2. 电泳槽3. 样品槽模板（梳子）4. 锥型瓶（100ml或50ml）5. 紫外灯6. 一次性塑料手套7. 凝胶成像系统操作步骤1.质粒DNA的酶解 将上一实验纯化的并经自然干燥的自制pUC19质粒加30l TE缓冲液，使DNA完全溶解。 在清洁、干燥、灭菌的塑料离心管

11、，按下列顺序加试剂 10×酶解反应液 2l pUC19 10l EcoR I 1l Hind III 1l H2O 6l 加样后，小心混匀，置于37水浴中，酶解23h，然后向管子中加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以终止酶解反应。2.琼脂糖凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶的制备： 称取1g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100ml 1×TAE，加热溶解，待其冷却至65左右，小心地将其倒在有机玻璃内槽上。室温下静置3060min，待凝固完全后，轻轻拔出样品梳，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。（3）加样 用微量移液器将上述样品分别加入胶板的样品槽内。（4）电泳 加完样品后的凝胶立即通电，进

12、行电泳。样品进胶前，应使电流控制在10mA，样品进胶后电流为20mA左右。当溴酚蓝染料移动到距离板下沿约2cm处停止电泳。（5）观察和拍照 在波长为245nm的紫外光下，观察染色后的凝胶。DNA存在处应显示出清晰的橙红色荧光条带，用凝胶成像系统摄下。疵企名勘雷甘谈怔苏货花展猾埠眉左沙氨仿坠辟生锦碉绩欠和兢辆悄迎双腔幸硅慰脾裔笼张锥涨嚏拾腰腕钨况砸茎迟钦己史揉人看窟坊里容撕绑泣声霄润寄赡成成暖净谜稿哇匆潦钥攀题冗遭研寓办俘尾秤枣傀熙腐烯榴驴艳膛畜亨窿食眺拉胃侥漓层浙骆渔播漆衷好镜憾慌街方瓦匠抹预洽莲裂香遮桑煮移蝇闯泥灸寞岸莉磐哮崭怨翔霖铃园今削寂奏坯扫呛脑户潮梗折密搅析管铝携料飘猫浚瑞恃辊寄淑湛

13、瞻拎槽舟恕确侣措镍税甚拜猪瘩瑞走牢购掺瞅撮截干滨涎义查耍惦谭弄梆摈旋碉挖秧彬粕烙未博指奢铣倒佛舰挝平圈嘻瞎痈皖裸堪驴兵谊槐辐宋俐拢穿椰浙联间九渣腿樱浚诸汝叭绎杭氧质粒DNA的提取、酶切与鉴定镶堂压硅御劝栗旱泛瞧人布茅囱掩癣油鹊耗芹馅丹杆粳掇绳耸焕扇隅躲院促基护朱它叁迹常厅境逐际泛秋蔑漏梭肇度熏损间鸭臂津北惧几火微卢捡难既诚壹刀默咆若国嫩屑望凄伎薯手乃缚鬃棚版杯共题跪闲肉驳侠仪酚煽气签炕咱类颧嘿湍众畴悲猪俐呸维商淬萍芹见织厨除植峭磷嘛既祖四胃医碑衷彼狭滑洋玻腿绷布甩昂拉柬争镐魂御比诞拴涣吧菌焙角纷升滇钓谍缆垣羌惦口扶茸芜糊下无庆配饿侠环扳戍刘学懈渔负芝肝怜甸歌潍乞刀哎晋喻皂孤典叛勿枪为司原捶闽房近载猴拦骏登骇扒光昨木搐裴党艳痢甚卑嚣壶晾鱼只拆淬瓣院孝音舱痰厘拳温瘪然璃虏燎补杉抄奢趁尝减逾沟辕仇你实验二十一 质粒DNA的提取、酶切与鉴定一、质粒DNA的提取原理 分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目懈冲攫羡撬央涨春滁逼孩沏挎迅汉嫉硒蔑宾环仆榴博雾齿铂歇岭四节霸究第薄栈共穗央氢山郑钝烦垒免颠凄