蛋白质的研究方法0

1、1高高 级级 生生 物物 化化 学学2 蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法 第一节第一节 蛋白质对象的选择和样品的获取蛋白质对象的选择和样品的获取3 一、研究对象的选择一、研究对象的选择无论何种来源的生物材料一般都含有成千上万种不同无论何种来源的生物材料一般都含有成千上万种不同的蛋白质分子；的蛋白质分子；在一种生物组织中，同时又存在着多种蛋白质组分。在一种生物组织中，同时又存在着多种蛋白质组分。虽然它们都具有肽链结构，但在虽然它们都具有肽链结构，但在分子大小分子大小、极性极性以以及及电荷电荷上会有所差异。上会有所差异。 4 选择研究蛋白质的原则选择研究蛋白质的原则： 在组织中含量比较高在组织中含

2、量比较高 相对比较稳定的蛋白质（如血液中的相对比较稳定的蛋白质（如血液中的HbHb；肌肉中的；肌肉中的 肌球蛋白和肌动蛋白等）肌球蛋白和肌动蛋白等）从模式生物基因组测序结果来看，每一种生物有机体从模式生物基因组测序结果来看，每一种生物有机体内都还有大量的蛋白质（内都还有大量的蛋白质（5050左右）从来没有被研究左右）从来没有被研究过。过。5获取蛋白质样品的方法获取蛋白质样品的方法： u直接从生物组织中提纯蛋白质直接从生物组织中提纯蛋白质为主为主u根据基因组测序获得的信息根据基因组测序获得的信息 （1 1）可以获得所要研究的特定蛋白质的）可以获得所要研究的特定蛋白质的AAAA序列。序列。 （先根

3、据推出的（先根据推出的AA序列合成对象蛋白中的一段肽，用它去获得有关的抗体，序列合成对象蛋白中的一段肽，用它去获得有关的抗体，然后用抗体去探测蛋白质的存在，甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象然后用抗体去探测蛋白质的存在，甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象蛋白）蛋白） （2 2）去获得有关基因的）去获得有关基因的cDNAcDNA全序列，然后通过重组全序列，然后通过重组DNA技术去表达重组蛋白。技术去表达重组蛋白。 有偏差，甚至完全是假象。有偏差，甚至完全是假象。 即使推测得到的蛋白质编码信息是对的，在细胞内还存在转录后的即使推测得到的蛋白质编码信息是对的，在细胞内还存在转录后的RNARNA加工，

4、翻译后的蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。加工，翻译后的蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。 6直接从生物组织中提纯蛋白质直接从生物组织中提纯蛋白质应用各种分辨效果好的应用各种分辨效果好的化学化学及及物理化学物理化学方法方法蛋白质的分离纯化包括以下过程：蛋白质的分离纯化包括以下过程：1.1. 破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质 抽提出来；抽提出来； 2.2.将有关的蛋白质分级沉淀下来将有关的蛋白质分级沉淀下来; ; （盐析法或有机溶剂法）（盐析法或有机溶剂法）3.3.应用应用层析法层析法或或电泳法电泳法使它们各自分开使

5、它们各自分开； 4.4.蛋白质结晶；蛋白质结晶；5.5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。蛋白质纯度鉴定和含量测定。7制备过程中注意事项：制备过程中注意事项： 要求自始至终保持在要求自始至终保持在天然状态天然状态1.1. 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温，避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。重金属等的影响。2. 2. 通常都在低温条件下操作。通常都在低温条件下操作。3. 3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高 水平。水平。8二、细胞的破碎二、细胞的破碎 少数蛋白质少数蛋白质-存在于细胞外面的（如血液和体液中等），存在于细胞外面的（如血液和

6、体液中等）， 大多数蛋白质大多数蛋白质-都存在于细胞的里面。都存在于细胞的里面。 一般固形生物材料首先都必须加以破碎，一般固形生物材料首先都必须加以破碎， 以释放出细胞内的蛋白质组分。以释放出细胞内的蛋白质组分。 生物材料生物材料 必须新鲜必须新鲜 1. 1. 材料材料 -80-80 2. 2. 或者制成干粉（丙酮）或者制成干粉（丙酮） 3. 3. 低温存放低温存放 破碎的方法：破碎的方法：1. 机械破碎法机械破碎法：利用利用机械机械力的搅切作用，使细胞研碎力的搅切作用，使细胞研碎 高速搅切器、玻璃匀浆器、家用搅肉器、研钵、高速搅切器、玻璃匀浆器、家用搅肉器、研钵、 玻璃珠高速匀浆器以及静压器

7、（高压破碎）。玻璃珠高速匀浆器以及静压器（高压破碎）。2.渗透破碎法渗透破碎法：利用低渗条件，使细胞溶胀破碎。利用低渗条件，使细胞溶胀破碎。红血球放于水中，便发生自溶。红血球放于水中，便发生自溶。 3.交替冻融法交替冻融法：生物组织经冻结后，细胞内液结冰生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀，而使细胞胀破。膨胀，而使细胞胀破。4.超声波法超声波法： 利用超声波震荡，使细胞膜上所受张利用超声波震荡，使细胞膜上所受张 力不均而解体。力不均而解体。5.酶消化法酶消化法： 利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等 对细胞膜或细胞壁的分解作用，使它对细胞膜或细胞壁的分解作用，使它 们

8、解体们解体10*抽提作用抽提作用： 生物材料在破碎的过程中，通常被浸在生物材料在破碎的过程中，通常被浸在适当的缓冲液中，使细胞中的蛋白质等内容适当的缓冲液中，使细胞中的蛋白质等内容物释放到这种溶液中去。物释放到这种溶液中去。膜蛋白的处理：复杂膜蛋白的处理：复杂 细胞膜的结构细胞膜的结构12按其所在按其所在位置位置大体可分为：大体可分为：两种类型两种类型 外周蛋白（外周蛋白（通过次级键和外膜脂质的通过次级键和外膜脂质的极性头极性头螯合在一起）螯合在一起） 固有蛋白（固有蛋白（嵌合在膜双层中，它通过嵌合在膜双层中，它通过疏水作用疏水作用 与与膜内部脂质层膜内部脂质层的疏水性尾部相结合的疏水性尾部相

9、结合 具有具有螺旋结构）螺旋结构）外周蛋白外周蛋白-选择适当离子强度及选择适当离子强度及PHPH的含有的含有EDTAEDTA的的 缓冲液抽提（高盐溶液）缓冲液抽提（高盐溶液）固有蛋白固有蛋白-？13* *增溶作用：增溶作用： 抽提固有蛋白质时，既要削弱它与抽提固有蛋白质时，既要削弱它与膜脂的疏水性结合，又要使它仍保持疏膜脂的疏水性结合，又要使它仍保持疏水基暴露在外的水基暴露在外的天然状态天然状态，这一过程通，这一过程通常称为增溶作用。常称为增溶作用。14 常用的增溶试剂有：常用的增溶试剂有： 有机溶剂有机溶剂-易使蛋白质变性易使蛋白质变性离液性离子离液性离子-CNCN- -、CIOCIO4 4

10、- -及及I I- -等虽能削弱疏水等虽能削弱疏水 作用，也易使蛋白质变性。作用，也易使蛋白质变性。磷酸酯酶磷酸酯酶-水解去磷酯，只适用于那些仅仅部水解去磷酯，只适用于那些仅仅部 分插入双层的膜蛋白分插入双层的膜蛋白. . 去污剂去污剂-同时包含有疏水和亲水部分同时包含有疏水和亲水部分. . 按其结构特征按其结构特征: :阴（阳）离子去污剂阴（阳）离子去污剂 两性离子去污剂两性离子去污剂 非离子型去污剂等。非离子型去污剂等。 去污剂去污剂：一类具有一类具有 亲水性头部亲水性头部 疏性尾巴疏性尾巴 的双亲性（的双亲性（amphipathicamphipathic）脂类分子）脂类分子作用：作用：

11、既可以破坏细胞的既可以破坏细胞的磷脂双层结构磷脂双层结构，又可以与具有，又可以与具有疏水性表面的疏水性表面的膜蛋白结合膜蛋白结合，从而阻止释放出来的膜蛋，从而阻止释放出来的膜蛋白通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。白通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。 16临界微团浓度临界微团浓度（critical micelle concentration，CMC)： 每一种去污剂都具有一特征性的每一种去污剂都具有一特征性的CMC。 CMCCMC值与其分子中值与其分子中疏水部分疏水部分与与亲水部分亲水部分的结构有的结构有 关。关。 当当 去污剂去污剂 低于此值的时候，去污剂分子在水溶液低于此值的

12、时候，去污剂分子在水溶液中将不形成微团，达到此值的时候，微团开始形成。中将不形成微团，达到此值的时候，微团开始形成。 17有的有的去污剂的亲水性头部可离子化去污剂的亲水性头部可离子化（即含有一带电基团）（即含有一带电基团）如如： 脱氧胆酸钠（脱氧胆酸钠（sodium deoxycholatesodium deoxycholate）和）和 十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfatesodium dodecylsulfate，SDSSDS）等）等；有的有的去污剂不能解离，所以分子中缺少带电基团去污剂不能解离，所以分子中缺少带电基团，如：如： Triton X-100

13、 Triton X-100，辛基葡萄糖苷，辛基葡萄糖苷( octylglucoside( octylglucoside）等。）等。18 离子化去污剂（离子化去污剂（SDSSDS）：作用：作用： 其其“疏水尾巴疏水尾巴”破坏蛋白质分子的疏水性部分的结构，破坏蛋白质分子的疏水性部分的结构， 其带电的其带电的“头部头部”破坏蛋白质分子中的氢键和离子键。破坏蛋白质分子中的氢键和离子键。作用的结果是作用的结果是：使任何蛋白（不管是膜蛋白还是水溶性：使任何蛋白（不管是膜蛋白还是水溶性 蛋白）都蛋白）都，并，并溶溶 液中，同时液中，同时。在部分情况下，当去污剂被透析掉后，蛋白质可以复性在部分情况下，当去污剂

14、被透析掉后，蛋白质可以复性并恢复生物活性。并恢复生物活性。 19SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel SDS-polyacrylamide gel electrophoresiselectrophoresis，SDS-PAGESDS-PAGE）：）：就是利用就是利用SDSSDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白完全变性的特性。完全变性的特性。这样经过这样经过SDSSDS变性的蛋白质在电场中完全变性的蛋白质在电场中完全按大小按大小分离开。分离开。 20非离子去污剂非离子去污剂：相对温和，一般相对

15、温和，一般不会使蛋白质变性不会使蛋白质变性。只是将蛋白质。只是将蛋白质分子从膜上溶解下来而已。分子从膜上溶解下来而已。当当 去污剂去污剂 其其CMCCMC值的时候，去污剂分子与膜蛋值的时候，去污剂分子与膜蛋白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解而不聚集。而不聚集。当当 去污剂去污剂 其其CMCCMC值的时候，去污剂分子将与膜值的时候，去污剂分子将与膜磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的形式存在。形式存在。一般选择非离子去污剂一般选择非离子去污剂来来保持膜蛋白生物活性保持膜蛋白生物活性 22 2

16、3 稳定剂：稳定剂：防止蛋白质分子可能被同时释放的蛋白质水解酶降解、防止蛋白质分子可能被同时释放的蛋白质水解酶降解、Pr空间结构可能被温度或化学试剂等环境因素破坏而空间结构可能被温度或化学试剂等环境因素破坏而丧失生物学活性等。丧失生物学活性等。处理处理：需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂；：需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂； 在低温下操作；在低温下操作； 加入稳定剂加入稳定剂(如甘油等）如甘油等）24细胞碎片的去除细胞碎片的去除离心离心( centrifugation)( centrifugation) 原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度的颗粒（

17、如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质量越大、或密度越高沉降的速度越快。量越大、或密度越高沉降的速度越快。沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的底部形成；底部形成；上清：绝大多数蛋白分子或蛋白复合体保留在细胞上清：绝大多数蛋白分子或蛋白复合体保留在细胞抽提液中即上清中抽提液中即上清中 25 三、目标蛋白质的分离、纯化三、目标蛋白质的分离、纯化 -蛋白质的分级沉淀和层析分离蛋白质的分级沉淀和层析分离将不同蛋白质分开的性质主要包

18、括：将不同蛋白质分开的性质主要包括： 分子量的大小分子量的大小 带电情况带电情况 水溶性水溶性 与某种物质的特异高亲和力等与某种物质的特异高亲和力等 26 （一）蛋白质的分级沉淀（一）蛋白质的分级沉淀 常用的方法有常用的方法有盐析法盐析法和和有机溶剂法有机溶剂法。 蛋白质颗粒表面有一层水膜蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层，也称水化层。水化层的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒而沉淀。而沉淀。蛋白质有两性解离性质蛋白质有两性解离性质。如果溶液的。如果溶液的PHPH值偏离了值偏离了PIPI，所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分

19、所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分散能力。散能力。 27#28等电点（等电点（PIPI）：）：1.1.能破坏蛋白质分子水化作用能破坏蛋白质分子水化作用2.2.是减弱分子间同性相斥作用的因子是减弱分子间同性相斥作用的因子 PI PI能降低蛋白质在水中的溶解度，使能降低蛋白质在水中的溶解度，使PrPr 29 盐析法盐析法 概念概念：蛋白质在不同浓度的蛋白质在不同浓度的中性盐中性盐溶液中溶液中溶解度溶解度 有不同程度的降低，采用添加有不同程度的降低，采用添加中性盐中性盐的方法的方法 使各种蛋白质依次分别沉淀出来的方法。使各种蛋白质依次分别沉淀出来的方法。 优点：操作简便优点：操作简便 对易

20、变性的蛋白质有一定的保护作用，对易变性的蛋白质有一定的保护作用， 适用范围十分广泛。适用范围十分广泛。 缺点：分辨能力差，纯化倍数低缺点：分辨能力差，纯化倍数低301 1盐析基本原理盐析基本原理在蛋白质水溶液中添加无机盐，可以产生两种在蛋白质水溶液中添加无机盐，可以产生两种影响：影响： (1)(1)盐离子盐离子与与PrPr分子分子中的中的 极性基团极性基团 离子基团离子基团 作用作用 降低降低PrPr分子的活度系数，趋使其溶解度分子的活度系数，趋使其溶解度 。(2)(2)盐离子盐离子也与也与水水这种偶极分子作用，使水分子的活这种偶极分子作用，使水分子的活 度降低，导致度降低，导致PrPr水合程

21、度的减少，从而趋使水合程度的减少，从而趋使PrPr溶溶 解度解度 。31 * *盐溶（盐溶（salting in)salting in)-当溶液中的盐离子强度比较当溶液中的盐离子强度比较低的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而低的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而增加，这种现象叫做增加，这种现象叫做.* *盐析（盐析（salting out )-salting out )-但当溶液中的盐离子强度但当溶液中的盐离子强度比较高的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增比较高的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而降低，这种现象叫做加而降低，这种现象叫做 . .一定的盐浓度下，每一种蛋白都有

22、一不同的特异溶一定的盐浓度下，每一种蛋白都有一不同的特异溶解度。解度。 322 影响盐析作用的因素影响盐析作用的因素（1 1）盐的种类）盐的种类（2 2）PHPH和温度和温度# #（3 3）蛋白质浓度）蛋白质浓度% %33（1 1）盐的种类）盐的种类对同一种对同一种PrPr而言，价数愈高的盐离子，盐析能力而言，价数愈高的盐离子，盐析能力也愈强也愈强: : PO3-4SO42-C2O42-（CHOHCOO-）2 ACCLNO3-Br -I-CNS- K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+ 负离子价数较高的中性盐（如硫酸盐、磷酸盐等）负离子价数较高的中性盐（如硫酸盐、磷酸盐等）的的KsKs值常较一价

23、中性盐的值常较一价中性盐的KsKs值高。值高。 Ks:盐析常数（价数较高时，盐析常数（价数较高时，Ks 值也较大）。代表盐析的效率，值也较大）。代表盐析的效率， 是与是与Pr及盐种类有关及盐种类有关 的特性常数。的特性常数。34硫酸铵硫酸铵（常用盐析剂）（常用盐析剂） 优点：盐析能力较强优点：盐析能力较强 具有较高的溶解度具有较高的溶解度 较低的溶解度温度系数较低的溶解度温度系数 价格低廉价格低廉 不产生副作用。不产生副作用。 缺点：缓冲能力较差缺点：缓冲能力较差 PHPH难控制难控制# #35（2 2）PHPH和温度和温度S S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶

24、解度 除取决于除取决于PrPr的种类，还受的种类，还受PHPH及温度影响及温度影响: : PH=PI PH=PI时，时，S S。的数值极小。的数值极小 S S。随温度增加而减低。随温度增加而减低。盐析过程中，若增高温度，有助于盐析过程中，若增高温度，有助于PrPr的析出。的析出。# #36（3 3）蛋白质浓度）蛋白质浓度 PrPr较高较高，在较低无机盐浓度时，在较低无机盐浓度时, ,蛋白质便开蛋白质便开 始析出，盐析界限比较宽。始析出，盐析界限比较宽。 PrPr较低较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析，需要无机盐的浓度也高，即盐析 界限变窄。界限变窄。 解决办法解决办法：对于高浓度的蛋白质对于高

25、浓度的蛋白质 可以应用可以应用稀释稀释作用来调节盐析浓作用来调节盐析浓 度界限，有利于混合物的分离。度界限，有利于混合物的分离。 37 蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低。 但蛋白质浓度愈高时，其他蛋白质的共沉淀作用但蛋白质浓度愈高时，其他蛋白质的共沉淀作用 也愈强也愈强 所以当蛋白质溶液太浓时，应适当稀释，所以当蛋白质溶液太浓时，应适当稀释， 通常在通常在2.52.53.03.0之间比较合适。之间比较合适。381.1.基本原理一基本原理一（1）在）在PI附近，附近，Pr主要以偶极离子形式存在。此时若添加主要以偶极离子形式存在。此时若添加 有机溶剂，

26、由于有机溶剂，由于有机溶剂有机溶剂有较低的介电常数，可使溶液有较低的介电常数，可使溶液 介电常数介电常数减小，增强了偶极离子间静电引力，从而使分减小，增强了偶极离子间静电引力，从而使分 子集合而沉淀出来。子集合而沉淀出来。（2）有机溶剂有机溶剂本身的水合作用会破坏本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也表面的水合层，也 促使促使Pr变得不稳定而聚集析出变得不稳定而聚集析出. Q1 Q2库仑定律库仑定律： F = 2 F：2 2个带电质点之间的相互作用力个带电质点之间的相互作用力 ：2 2个带电质点之间的距离个带电质点之间的距离 ：介电常数介电常数有机溶剂法有机溶剂法 分辨力比盐析方法高，提纯效

27、果好分辨力比盐析方法高，提纯效果好 39 溶剂溶剂 介电常数介电常数 乙醚乙醚 4.33 丙酮丙酮 21.4 乙醇乙醇 21 甲醇甲醇 33 水水 -80 甘氨酸溶液甘氨酸溶液 137 （2.5M） 在低在低的环境中，的环境中，PrPr上基团间的作用力会受上基团间的作用力会受到影响到影响, , 超过限度时，使蛋白质变性。超过限度时，使蛋白质变性。40 解决办法：解决办法：1.1.有机溶剂沉淀一般都须控制在低温条件下进行。有机溶剂沉淀一般都须控制在低温条件下进行。2.2.添加甘添加甘AAAA，调节溶液中的介电常数不致过低，调节溶液中的介电常数不致过低， 创造合适的分离条件。创造合适的分离条件。

28、另：蛋白质本身是多价离子，对溶液介电常数另：蛋白质本身是多价离子，对溶液介电常数 有相当贡献。有相当贡献。 ( (当蛋当蛋白质浓度太低时，如添加有机溶剂过度白质浓度太低时，如添加有机溶剂过度 会产生变性现象，这时加入甘会产生变性现象，这时加入甘AAAA等物质，可等物质，可 以避免蛋白质变性以避免蛋白质变性) )。41 2. 2. 影响有机溶剂沉淀影响有机溶剂沉淀PrPr的因素的因素 （1 1） PHPH值值 PH=PIPH=PI时时 蛋白质的溶解度最低。按蛋白质的溶解度最低。按PIPI来调节来调节PHPH值，值， 有利于分离。有利于分离。 （2 2）蛋白质浓度）蛋白质浓度 PrPr越高，加入一

29、定量有机溶剂后，越高，加入一定量有机溶剂后，PrPr析出越多。析出越多。 此时溶液的此时溶液的也相应提高，可以减少也相应提高，可以减少PrPr的变性。的变性。 Pr Pr越高越高,Pr,Pr分子间作用引起的共沉淀现象也显著分子间作用引起的共沉淀现象也显著 增强，这样分离效果差，不利于分级沉淀。增强，这样分离效果差，不利于分级沉淀。 只有选择恰当的只有选择恰当的PrPr才有可能获得良好的分高效果才有可能获得良好的分高效果。42（3 3）离子强度）离子强度 中性盐的加入能促使中性盐的加入能促使PrPr在有机溶剂中溶解，在有机溶剂中溶解， 并且能防止并且能防止PrPr的变性。但含盐过多，却会使的变性

30、。但含盐过多，却会使PrPr 过度析出，不利于分级沉淀。过度析出，不利于分级沉淀。 一般一般0.05M0.05M的稀盐溶液。的稀盐溶液。（4 4）多价阳离子）多价阳离子 PrPr与多价的阳离子如（与多价的阳离子如（ ZnZn2+2+、 CuCu2+2+等）能结等）能结 合成复合物。这种复合物在有机溶剂中往往使合成复合物。这种复合物在有机溶剂中往往使PrPr 溶解度变小。溶解度变小。 43 ( (二）二）蛋白质的层析分离法蛋白质的层析分离法 （色谱法）（色谱法）最基本的特征：最基本的特征： 固定相固定相 流动相流动相44 原理原理 各种物质得以分离的最基本原因：就在于它们在这各种物质得以分离的最

31、基本原因：就在于它们在这 两个相之间具有不同的分配系数两个相之间具有不同的分配系数. .两相作相对运动时，两相作相对运动时， 这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分 配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最 大的分离效果。大的分离效果。45 层析分离能力的实质层析分离能力的实质物质的分配问题物质的分配问题 *分配系数：分配系数： 当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和移动相两相内的定相和移动相两相内的浓度之比浓度之比是一个常数，这称为分是

32、一个常数，这称为分配系数配系数。 C1 K = C2 *质量分配系数：质量分配系数：若不用浓度而用若不用浓度而用物质的绝对量的比值物质的绝对量的比值来表示，则称为质来表示，则称为质量分配系数即：量分配系数即： Vs D= K Vm Vs : 固定相的体积固定相的体积 Vm : 流动相的体积流动相的体积46 层析种类：层析种类： 气相层析气相层析 按按两相状态两相状态来分来分 液相层析液相层析 吸附层析吸附层析 分配层析分配层析 按按层析机理层析机理来分来分 离子交换层析离子交换层析 凝胶排阻层析凝胶排阻层析 亲和层析亲和层析 柱层析柱层析 按按操作方式操作方式来分来分 薄层层析薄层层析 纸层析

33、纸层析层析法分离、纯化层析法分离、纯化：Pr、多肽和多肽和AA47 离子交换层析法离子交换层析法*原理：原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相） 填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树 脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的 阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来，于是两

34、种蛋白质被分开。质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。48固定相：固定相：1.1.纤维素纤维素- - DEAE DEAE纤维素、纤维素、 CM CM纤维素纤维素2.2.葡聚糖葡聚糖49u纤维素纤维素 : : 骨架为柔性长链骨架为柔性长链1.1.加入量加入量-加入层析柱的蛋白质量通常纤维素量加入层析柱的蛋白质量通常纤维素量 的十分之一。的十分之一。2.2.提高分辨率，样品体积应尽可能地少。提高分辨率，样品体积应尽可能地少。3.3.在洗脱时，可以通过在洗脱时，可以通过改变洗脱缓冲液的改变洗脱缓冲液的PHPH， 而使蛋白质分子电荷减少而被解吸下来，也而使蛋白质分子电荷减少而被解吸下来，也 可以通过可

35、以通过提高洗脱缓冲液中离子强度提高洗脱缓冲液中离子强度，减弱，减弱 蛋白质分子与载体亲和力的办法，将蛋白质蛋白质分子与载体亲和力的办法，将蛋白质 组分逐一洗脱下来。组分逐一洗脱下来。50u葡聚糖的离子交换树脂葡聚糖的离子交换树脂: :骨架为三维网状结构骨架为三维网状结构 优点优点：1. 1. 同时具有分子筛的作用同时具有分子筛的作用2. 2. 因其高度的网状结构，所带有的交换基团也比纤维因其高度的网状结构，所带有的交换基团也比纤维 素多得多。交换容量为离子交换纤维素的素多得多。交换容量为离子交换纤维素的3 35 5倍。倍。 缺点：缺点： 它的床体积常受它的床体积常受PHPH或盐浓度影响而变化，

36、对分离或盐浓度影响而变化，对分离效果有一定程度的干扰。效果有一定程度的干扰。 51凝胶排阻层析凝胶排阻层析又称又称分子筛或凝胶过滤分子筛或凝胶过滤（gel filtrationgel filtration）原理：原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔径的分子将不能进入柱时，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小的分子进入能容纳它（全排出）。较小的分子进入能容纳它的孔穴，绕道而行，在柱内保留时间就的孔穴，绕道

37、而行，在柱内保留时间就比较长。这样，较大的分子被先洗脱下比较长。这样，较大的分子被先洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的达到相互分离的目的. .5253常用过滤层析凝胶的截留分子量范围54用作凝胶的载体物质有三类用作凝胶的载体物质有三类： u 交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶 商品名为商品名为 Sephadex GSephadex Gu 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 商品名为商品名为Bio-gel PBio-gel P ( (丙烯酰胺丙烯酰胺 + N+ N，N N- -次甲基二丙烯酰胺聚合而成次甲基二丙烯酰胺聚合而成 P P值表示不同的交联度

38、值表示不同的交联度) )u 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 商品名为商品名为 SepharoseSepharose或或 Bio-gel ABio-gel A （从海藻琼脂中分离除去琼脂胶后的中性级成分从海藻琼脂中分离除去琼脂胶后的中性级成分 是是D-D-半乳糖和半乳糖和3,6-3,6-脱水脱水-L-L-半乳糖相间重复结半乳糖相间重复结 合而成的链状化合物）合而成的链状化合物）55琼脂糖凝胶优点：琼脂糖凝胶优点：1.1.其机械强度比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝其机械强度比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶好得多。胶好得多。2.2.对蛋白质等高分子的吸附作用也小得多对蛋白质等高分子的吸附作用也小得多3.3.适用分子量

39、的范围宽，最大可以到适用分子量的范围宽，最大可以到10108 8。56凝胶排阻层析的应用：凝胶排阻层析的应用：1.1.作为分析工具作为分析工具 ( (分子量差别大的物质分子量差别大的物质) ) 2.2.作为脱盐工具作为脱盐工具(Sephadex G-25)(Sephadex G-25)3.3.高分子溶液的浓缩高分子溶液的浓缩 ( (不稳定的高分子不稳定的高分子) )4.4.去除热原物质去除热原物质(DEAE-A-25)(DEAE-A-25)5.5.物质的分离提纯物质的分离提纯6.6.用于测定高分子物质的分子量用于测定高分子物质的分子量57吸附层析法吸附层析法原理：原理：柱层析中，含有柱层析中，

40、含有Pr分子的混合物随流动相通分子的混合物随流动相通 过由过由吸附剂吸附剂组成的固定相时，组成的固定相时，Pr分子通过各分子通过各 种次级作用能够吸附在吸附剂上种次级作用能够吸附在吸附剂上,由于不同分由于不同分 子的吸附能力不同，可以通过洗脱使它们逐子的吸附能力不同，可以通过洗脱使它们逐 一解脱出来，而使混合物得以分离。一解脱出来，而使混合物得以分离。优点：优点：1.1.物理吸附，吸附能量比较低，洗脱也比较容易。物理吸附，吸附能量比较低，洗脱也比较容易。2.2.操作简便，吸附剂容易获得，价格较低廉操作简便，吸附剂容易获得，价格较低廉 58固定相固定相：吸附剂吸附剂磷酸钙凝胶磷酸钙凝胶磷酸钙胶磷

41、酸钙胶CaCa3 3（POPO4 4）2 2磷酸氢钙胶磷酸氢钙胶CaHPOCaHPO4 42H2H2 2O O羟基磷酸钙胶羟基磷酸钙胶CaCa5 5（POPO4 4）3 3OH OH 羟基磷灰石羟基磷灰石 磷酸钙胶对蛋白质的吸附作用原理磷酸钙胶对蛋白质的吸附作用原理: :主要是由于主要是由于 . Ca. Ca2+2+与与PrPr负电荷性基团负电荷性基团 结合。结合。 . . 磷酸基团与磷酸基团与PrPr正电荷基团正电荷基团59 流动相流动相： 洗脱剂洗脱剂-柠檬酸盐柠檬酸盐作用：柠檬酸离子因与作用：柠檬酸离子因与CaCa2+2+有更强的相互作用，有更强的相互作用， 它能大大它能大大降低降低蛋白

42、质和凝胶的吸附能力。蛋白质和凝胶的吸附能力。 NaClNaCl，KCIKCI甚至浓度高达甚至浓度高达3M3M时，也不影响时，也不影响PrPr负电荷负电荷的吸附，相反这些盐可以大大降低的吸附，相反这些盐可以大大降低PrPr正电荷的吸附。因正电荷的吸附。因此在高浓度的这些盐溶液中应用羟基磷灰石进行层析时，此在高浓度的这些盐溶液中应用羟基磷灰石进行层析时，可以专门吸附酸性蛋白质及中性蛋白质而排除碱性蛋白可以专门吸附酸性蛋白质及中性蛋白质而排除碱性蛋白质。质。60亲和层析法亲和层析法1.1.原理原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。分

43、子可逆结合的特性。 如，如，酶的活性部位能和底物酶的活性部位能和底物 抑制剂抑制剂 辅助因子专辅助因子专 一性地结合一性地结合, ,改变条件又能使这种结合解除改变条件又能使这种结合解除. . 酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间合蛋白与结合物之间 。 这些被作用的对象物质称之为这些被作用的对象物质称之为配基（配基（ligand) ligand) 。 61固定相固定相-配基配基固定在固定在固相载体固相载体上上62632.2.优点优点：具有高度的吸附专一性：具有

44、高度的吸附专一性 层析过程简便、快速层析过程简便、快速3.3.载体的选择载体的选择：(1)(1)必须具有高度亲水性，使必须具有高度亲水性，使PrPr分子容易与它接近分子容易与它接近. .(2)(2)非专一性吸附要十分小。非专一性吸附要十分小。(3)(3)必须具有大量可供活化而能与配基结合的基团。必须具有大量可供活化而能与配基结合的基团。 常用载体常用载体：纤维素、纤维素、 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、 聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃等等。 64高效液相层析法（高效液相层析法（HPLCHPLC） 液相层析液相层析: :凡是以液体作为流动相的层析法。凡是以液体

45、作为流动相的层析法。高效液相层析法高效液相层析法: : 高压输液的情况下高压输液的情况下, ,数分钟甚至数分钟甚至1min1min就可就可以完成一次理想的分离以完成一次理想的分离, ,这种方法为这种方法为HPLC.HPLC.条件条件: 1.柱长柱长 50-100cm, 50-100cm, 柱径柱径2-3mm;2-3mm; 2. 2.固定相载体颗粒的直径通常固定相载体颗粒的直径通常10-15um;10-15um; 3. 3.高压输液泵加压，一般压力在高压输液泵加压，一般压力在20-200Kg/cm20-200Kg/cm2 2 4. 4.保持保持1ml/min1ml/min的流速的流速65 固定相

46、固定相: :聚苯乙烯凝胶聚苯乙烯凝胶 多孔性二氧化硅微球多孔性二氧化硅微球 多孔玻璃珠等多孔玻璃珠等 流动相流动相: : (1(1）与固定相不互溶或溶解很少）与固定相不互溶或溶解很少; ; （2 2）避免与固定相发生不可逆反应；）避免与固定相发生不可逆反应； （3 3） 对样品要有适当的溶解度；对样品要有适当的溶解度； （4 4）与采用的检测器相适应。）与采用的检测器相适应。 666768 HPLC分析图谱051 01 52 0OD380nm0 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 0051 01 52 00 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 00 .0 1 50 .0 2 0R

47、e te n tio n tim e (m in )051 01 52 0OD380nm0 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 00 .0 1 5051 01 52 00 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 00 .0 1 50 .0 2 00 .0 2 5ABCDD N P -O PP ro d u c tProductProductProductD N P -O PD N P -O PD N P -O PR e te n tio n tim e (m in )051 01 52 00 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 0R e te n tio n tim e (m i

48、n )051 01 52 00 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 00 .0 1 5ProductD N P -O PProductD N P -O PM 8 -PEFA : C A s u s p e n s io n (c o n tro l)B : C M T -3 (1 0 g /m l)C : P h e n a n th ro lin e (5 m M )D : E D T A (5 m M )E : E x tra c t fro m C AF : M M P -8 (1 0 0 g /m l70分类：分类：(1)(1)液一液分配层析液一液分配层析：利用溶质在流动相中分配

49、系利用溶质在流动相中分配系 数的差别而达到分离目的，数的差别而达到分离目的， 是应用最多的方法之一。是应用最多的方法之一。(2)(2)液一固吸附层析液一固吸附层析: :利用溶质在固体吸附剂上吸利用溶质在固体吸附剂上吸 附能力的差别而达到分离目的。附能力的差别而达到分离目的。(3)(3)离子交换层析离子交换层析：通过溶质和固体（树脂）的离子通过溶质和固体（树脂）的离子 交换作用，利用不同溶质离子交交换作用，利用不同溶质离子交 换能力的差别而达到分离目的。换能力的差别而达到分离目的。(4)(4)凝胶渗透层析凝胶渗透层析：按溶质分子量大小而分离，也即按溶质分子量大小而分离，也即 分子筛层析。分子筛层

50、析。 71 第二节第二节蛋白质的检测和鉴定蛋白质的检测和鉴定72 一般可通过以下几个方面进行：一般可通过以下几个方面进行： 光谱学特性光谱学特性 电泳行为电泳行为 特异抗体反应特异抗体反应 特异生物学活性特异生物学活性 N N一末端氨基酸序列测定一末端氨基酸序列测定 质谱检测质谱检测 排阻层析排阻层析 73 一、光谱学特性一、光谱学特性 蛋白质光谱特性的总原则是：蛋白质光谱特性的总原则是：当一定波长的光（即电磁波）与当一定波长的光（即电磁波）与PrPr分子接触分子接触时，所吸收的或反射的辐射能量与时，所吸收的或反射的辐射能量与PrPr分子结分子结构特征和浓度是密切相关的。构特征和浓度是密切相关

51、的。 圆二色谱、磁共振技术、圆二色谱、磁共振技术、X X一射线晶体衍射法、红外一射线晶体衍射法、红外光谱、拉曼光谱技术等光谱学技术等。光谱、拉曼光谱技术等光谱学技术等。 74 不同波长范围的电磁波与其作用后的剩余能量值反不同波长范围的电磁波与其作用后的剩余能量值反映的是蛋白质分子的不同特征映的是蛋白质分子的不同特征: :190 -200nm190 -200nm波长范围的光吸收反映的是波长范围的光吸收反映的是蛋白质主链蛋白质主链上的酞胺键中电子的被激发；上的酞胺键中电子的被激发；230 - 300nm230 - 300nm波长范围的光吸收谱（最大吸收值在波长范围的光吸收谱（最大吸收值在280nm

52、280nm波长处）反映的是波长处）反映的是蛋白质分子中芳香族氨基酸蛋白质分子中芳香族氨基酸侧链上电子的被激发。侧链上电子的被激发。所以一般情况下，溶液在所以一般情况下，溶液在280nm280nm波长处（属紫外波长处（属紫外光范围）的光吸收能力被当做是光范围）的光吸收能力被当做是存在存在蛋白质的证据。蛋白质的证据。75二、电泳检测二、电泳检测 蛋白质分子为两性电解质，在不同蛋白质分子为两性电解质，在不同PHPH的溶液中带的溶液中带有不同的电荷，从而在直流电场中能够泳动，这就是有不同的电荷，从而在直流电场中能够泳动，这就是电泳现象电泳现象。按按介质状态介质状态来分来分: :自由电泳自由电泳 区带电

53、泳区带电泳按按操作原理操作原理可分为可分为: : 一般电泳一般电泳 等电电泳等电电泳 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 免疫电泳等免疫电泳等 76自由电泳自由电泳-以以溶液溶液为介质，在溶液中将蛋白质分离为介质，在溶液中将蛋白质分离 缺点缺点: :自由电泳过程中扩散严重，分辨率有限自由电泳过程中扩散严重，分辨率有限区带电泳区带电泳-在固体支持物上所进行的电泳在固体支持物上所进行的电泳 固体支持物有固体支持物有: :滤纸、醋酸纤维薄膜、滤纸、醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 优点优点: :分辨率很高。分辨率很高。77SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（

54、SDS-PAGE)SDS-PAGE) SDSSDS ( (十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠) )是阴离子型去污剂是阴离子型去污剂(Sodium dodecyl sulfate, SDS)(Sodium dodecyl sulfate, SDS) Q Q u = u = （迁移率）（迁移率）6r 6r u u 与与 Q Q、 r r有关有关 若蛋白质分子带有足够的电荷，在若蛋白质分子带有足够的电荷，在SDS-PAGESDS-PAGE中进中进行电泳，由于分子筛效应，行电泳，由于分子筛效应， u u 仅取决于分子的大小。仅取决于分子的大小。因此因此 SDS SDS一凝胶电泳可以按一凝胶电泳可以按蛋白质分

55、子大小的不同蛋白质分子大小的不同将其将其分开。分开。 这时，若以分子量的对数（这时，若以分子量的对数（logMlogM）对相对于染料前沿）对相对于染料前沿的迁移率（的迁移率（RfRf）作图，呈现线性关系。）作图，呈现线性关系。 7879 这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的分子量范围：分子量范围： 5 5胶浓度时，适用于分子量胶浓度时，适用于分子量6 6200200万的区间；万的区间； 10 10胶浓度时，适用于分子量胶浓度时，适用于分子量1.61.67 7万的区间；万的区间； 15 15胶浓度时，适用于分子量胶浓度时，适用于分子量1.21.24.5

56、4.5万的区间。万的区间。 80聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF） PrPr分子有一定的分子有一定的PIPI，当它处在一个由当它处在一个由阳极阳极 阴极阴极梯度逐渐增加的梯度逐渐增加的介质中，并通过以直流介质中，并通过以直流电时，它便电时，它便“聚焦聚焦”在与在与其其PIPI相同的相同的pHpH位置上。位置上。 PIPI不同的蛋白质泳动后不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而形成位置不同的区带而得到分离。得到分离。82优点：优点：1.1.有很高的分辨率；有很高的分辨率；2.2.可以区分等电点只有可以区分等电点只有 0.01 pH

57、0.01 pH单位差异的蛋白质；单位差异的蛋白质；3.3.根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量；根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量；4.4.对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。83能形成能形成 PH PH 梯度的物质必须具有以下特性：梯度的物质必须具有以下特性：（1 1）有足够的缓冲能力，样品存在时也能保持稳定）有足够的缓冲能力，样品存在时也能保持稳定 的的PHPH梯度；梯度；（2 2）有足够的电导能力，以使一定的电流能够透过；）有足够的电导能力，以使一定的电流能够透过；（3 3）是小分子的物质，电泳后易于除去；）是小分子的物质，电泳后易于除去；（4 4）

58、化学组成与被分离的蛋白质物质不同，不干扰）化学组成与被分离的蛋白质物质不同，不干扰 测定；测定；（5 5）不会使蛋白质变性或与其发生副反应）不会使蛋白质变性或与其发生副反应 84双向电泳双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis） 第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳-PIPI第二向采用第二向采用SDSSDS一凝胶电泳一凝胶电泳-分子量分子量 由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率85双向

59、PAGE86 双向电泳技术缺点，具有以下特征的蛋白质在二维双向电泳技术缺点，具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被检测到：电泳中还很难被检测到：等电点（等电点（pl)pl)值很大或很小的，比如大于值很大或很小的，比如大于8 8和小于和小于4 4的那些蛋白质；的那些蛋白质；分子质量很大的蛋白质，比如大于分子质量很大的蛋白质，比如大于l00kDal00kDa的蛋白的蛋白质就比实际的少了，而大于质就比实际的少了，而大于150kDa150kDa的蛋白质就几的蛋白质就几乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些大蛋白质都能清楚地被观察到；大蛋白质都能清楚地被观

60、察到；疏水性蛋白质。疏水性蛋白质。 免疫电泳免疫电泳 将将电泳分离电泳分离和和专一性免疫沉淀专一性免疫沉淀相结合的分析方法：相结合的分析方法： 蛋白质样品先在琼脂或琼脂糖凝胶中电泳，然后在蛋白质样品先在琼脂或琼脂糖凝胶中电泳，然后在与泳动路线相距几毫米的槽中放入针对该样品的免疫血与泳动路线相距几毫米的槽中放入针对该样品的免疫血清。由于双向扩散的结果，形成抗原一抗体复合物的免清。由于双向扩散的结果，形成抗原一抗体复合物的免疫沉淀弧线疫沉淀弧线由于免疫反应有由于免疫反应有很高的专一性，很高的专一性，可用于可用于鉴定鉴定PrPr的的纯度，分析样品纯度，分析样品中蛋白质的组分中蛋白质的组分。PH 8.