蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和

1、蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。目标蛋白质的分离决不是一件轻而易举的事情，因为要把它与性质、大小和结构十分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难。有些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低，这无疑将增加获取足量蛋白质的难度。 目标蛋白质的分离纯化程序主要包括目标蛋白质的分离纯化程序主要包括: 材料的选择；组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液；蛋白质初步提纯；选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要

2、在较低温度下(04)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。一、蛋白质是两性电解质一、蛋白质是两性电解质 根据蛋白质的分子结构，很容易得出构成蛋白质的两性解离的基础是氨基酸残基的侧链可解离的基团。 作为两性电解质，每种蛋白质都有其等电点(pI) ，这与它所含的氨基酸种类和数量有关。 所有的蛋白质，不管它具有什么样的功能，都能在细胞内起一定的缓冲作用。 1. 蛋白质的电泳分离蛋白质的电泳分离 凝胶电泳是目前常用的一种生化方法。用于蛋白质分离的用于蛋白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶是由单体丙烯酰胺和交联凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶

3、，该凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成，其最大的特点是凝胶的孔径可根剂甲叉双丙烯酰胺配制而成，其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行选择。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性据需要进行选择。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性电泳和变性电泳。电泳和变性电泳。3.1 透析透析3.2 层析原理层析原理3.3 凝胶过滤凝胶过滤3.4 离子交换层析离子交换层析3.5 亲和层析亲和层析3.6 电泳电泳3.7 蛋白质氨基酸序列确定蛋白质氨基酸序列确定3.8 肽的化学合成肽的化学合成主要内容1.1 透透 析析按照分子大按照分子大小进行分离。小进行分离。分离取决于分离取决于透析袋截留透析袋

4、截留的分子量。的分子量。透析液透析液浓缩的蛋白浓缩的蛋白混合样品混合样品 透析袋透析袋 开始透析开始透析处于平衡状态处于平衡状态 层析也称之色谱，基本原理是分析样品作层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。中各个成分的目的。 层析因固相介质不同又分为层析因固相介质不同又分为、和和等各种层析。等各种层析。1.2 层析原理层析原理 将作为固相成分的

5、将作为固相成分的不溶性基质，例如葡不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。用平衡液平衡。 然后加样品，再用然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。适当的溶剂洗脱。 样品中各种成分通样品中各种成分通过柱子取决于与固相过柱子取决于与固相成分的相互作用，最成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成出来，达到将各个成分分离的目的。分分离的目的。 凝胶层析是按照蛋凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排过滤、分子筛层析或排阻层析。阻层析。

6、单个凝胶珠本身象单个凝胶珠本身象“筛子筛子”。不同类型凝。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。胶的筛孔的大小不同。1.2 凝胶过滤层析凝胶过滤层析带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进入小分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子不大分子不能进入珠能进入珠内，经珠内，经珠之间缝隙之间缝隙流出流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意凝胶过滤层析过程示意图图小分子小分子大分子大分子凝胶基质凝胶基质凝胶凝胶珠珠 如果被分离的样品中各个成分受溶液如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行正电荷，有时带负电荷，此

7、时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。样品的分离。 离子交换层析的固相是离子交换层析的固相是离子交换体离子交换体，包括离子交换树脂、，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。 带有带有SO3 或或COO基团，通常以基团，通常以SO3Na 或或COOH形形式出现的叫做阳离子交换基式出现的叫做阳离子交换基； 带有带有N（C2H5）基团通常以）基团通常以N（C2H5）Cl出现的叫做出现的叫做阴离子交换基阴离子交换基。1. 3 离子交换层析离子交换层析阳离子交换基阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，羧甲基纤维素弱

8、酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂阴离子交换基阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素弱碱性，二乙氨乙基纤维素：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。值。当当pI pH时，蛋时，蛋白质带净正电荷。白质带净正电荷。已知蛋白已知蛋白X等电点为等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答案答案：建立阴离

9、子交换柱，比如建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用。用pH8.5的缓的缓冲液平衡柱子，同时蛋白冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于溶解于pH8.5的缓冲液中，在此的缓冲液中，在此pH值下蛋白值下蛋白X带有负电，将含有蛋白带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。阳阳离离子子交交换换层层析析过过程程离子交离子交换树脂换树脂蛋白质蛋白质高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗加加样样平平衡衡液液洗洗收集收集 依赖于蛋白质和它的配体（依赖于蛋白质和它

10、的配体（ligand）之间的相互作用来分）之间的相互作用来分离的。离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。 当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结

11、合，而其它没有结合柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高层析就可使蛋白质的纯化提高1000至至10000倍。倍。1.4 亲和层析亲和层析含配体溶液含配体溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样混合蛋白样品品平衡液平衡液带有配体的树脂带有配体的树脂珠（或胶粒）珠（或胶粒）亲和层析过程亲和层析过程 蛋白质在水中可形成一种稳

12、定的亲水胶体。 细胞原生质的主要成分是蛋白质，原生质的胶体状态主要原生质的胶体状态主要是由蛋白质的胶体性质所造成的。是由蛋白质的胶体性质所造成的。 盐溶现象：盐溶现象：在盐溶液很稀的范围内，随着盐浓度的增加，球状蛋白质的溶解度也随之增加（图例），此现象称作盐溶盐溶(salting-in) 。任何物质的溶解度都取决于溶质分子间的相对亲和力及溶质分子与溶剂分子的相对亲和力。任何降低溶质分子相互作用的因素以及加强溶质分子与溶剂分子相互作用的因素都有助于增加溶解度。 盐析现象：盐析现象：随着盐浓度的继续升高，例如，达到饱和和半饱和的程度，蛋白质的溶解度逐渐变小，彼此之间相互凝聚而发生沉淀，此现象称作盐析盐析(satting-out) 。 离子强度离子强度() CZn21/21.5 蛋白质的胶体性质与盐析分离蛋白质的胶体性质与盐析分离图例练习题练习题 1. 某种蛋白质当用凝胶过滤法测定其分子量为90kD，而用SDS-PAGE测定其分子量为60kD，无论是否有巯基乙醇存在都如此。为什么会有二种不同的结果？你认为哪种方法更准确？ 2. 从下面的信息确定某一蛋白质亚基组成： 1). 用凝胶过滤法，测定其分子量为200kD， 2). 用SDS-PAGE，测定其分子量为100kD， 3). 在巯基乙醇