细菌的基因重组

1、第五节第五节 细菌的基因转移细菌的基因转移和重组和重组编辑ppt2凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为称为基因重组基因重组（gene recombination）或或遗传重组遗传重组（genetic recombination），），简称简称重组重组。编辑ppt3作用：作用： 重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。新遗传型的个体。编辑ppt4重组与杂交的关系：重组与杂交的关系

2、：重组重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水分子水平平上的杂交上的杂交而一般所说的而一般所说的杂交杂交（hybridization）则是）则是细胞水平细胞水平上的一个概上的一个概念。念。杂交中必然包含着重组，杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。而重组则不限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交、准性杂交（真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexual hybridization）等及原核生物中的转化、转导、接合和原）等及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。生质体融合等都是基

3、因重组在细胞水平上的反映。编辑ppt5微生物中各种形式基因重组的比较重组范围重组范围供体和受体的关系供体和受体的关系整套染色体整套染色体局部杂合局部杂合高频率高频率低频率低频率部分染色体部分染色体个别或少数基因个别或少数基因细胞融合或细胞融合或联结联结性细胞性细胞真菌的有真菌的有性生殖性生殖体细胞体细胞真菌的准真菌的准性生殖性生殖细胞间暂时沟通细胞间暂时沟通细菌的接合细菌的接合性导性导细胞间细胞间不接触不接触吸收游离吸收游离DNA片段片段转化转化噬菌体携带噬菌体携带DNA转导转导由噬菌体提由噬菌体提供遗传物质供遗传物质完整完整噬菌体噬菌体溶源转变溶源转变噬菌体噬菌体DNA转染转染编辑ppt6基

4、因重组的意义 基因重组是杂交育种的理论基础。基因重组是杂交育种的理论基础。 杂交育种的优点：杂交育种的优点： 由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。一大步。 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。育种手段。编辑ppt7基因重组的意义 杂交育种的缺

5、点：杂交育种的缺点： 由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。获得了飞速的发展。编辑ppt8原核生物的

6、基因重组原核生物的基因重组原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。特点：特点： 片段性，仅一小段片段性，仅一小段DNADNA序列参与重组；序列参与重组； 单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单方向转移；向受体基因组）作单方向转移； 转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。编辑ppt9（一）接合（一）接合（conjugation，mating） 供体菌供体菌（“雄性雄性”）通过通过性毛性毛与与受体菌受体菌（“雌性雌性”）直接接触，把直接接触，把F F

7、质粒质粒或其携带的不同长度的或其携带的不同长度的核基因组片段核基因组片段传传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为接合接合。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是接合子接合子（conjugant）。）。编辑ppt101946年，年，Joshua Lederberg 和和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验细菌的多重营养缺陷型杂交实验通过细胞与细胞的直接接通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转触而产生的遗传信息的转移和重组过程移和重组过程编辑ppt11编辑ppt12中间平板

8、上长出的中间平板上长出的原养型菌落是两菌原养型菌落是两菌株之间发生了遗传株之间发生了遗传交换和重组所致！交换和重组所致！编辑ppt13AB-过滤器U U型管实验型管实验编辑ppt14 存在范围：存在范围： 细菌：细菌：G 较为多见如较为多见如E. coli(大肠杆菌大肠杆菌)、Salmonella(沙门氏菌)、Shigella(志贺氏菌)、Serratia(粘质沙雷菌)、Vibrio(弧菌属) 、Azotobacter(固氮菌) 、Klebsiella(克雷白氏杆菌属)和和Pseudomonas(假单胞菌属)等最为常见等最为常见 放线菌：放线菌：Streptomyces(链霉菌属) 、Noca

9、rdia(诺卡氏菌属) 接合还可发生在接合还可发生在不同属不同属的菌种之间，如的菌种之间，如E. coli与与Salmonella typhimurium之间或之间或S. typhimurium与与Shigella dysenteriae之间之间编辑ppt15大肠杆菌的接合机制大肠杆菌的接合机制接合作用是由一种被称为接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导因子的质粒介导F因子的分子量通常为因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性毛，上面有编码细菌产生性毛（sex pili）及控制接合过程进行的及控制接合过程进行的20多个基因。多个基因。含有含有F因子的细胞：因子的细胞：“雄性雄性”菌株（

10、菌株（F+），），其细胞表面有性毛其细胞表面有性毛不含不含F因子的细胞：因子的细胞：“雌性雌性”菌株（菌株（F-），），细胞表面没有性毛细胞表面没有性毛编辑ppt16F因子为附加体质粒因子为附加体质粒可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上编辑ppt17F F因子的四种细胞形式因子的四种细胞形式a）F F- -菌株菌株， 不含不含F因子，没有性毛，但可以通过接合作因子，没有性毛，但可以通过接合作用接收用接收F因子而变成雄性菌株（因子而变成雄性菌株（F+）；）；b）F F+ +菌株菌株， F因子独立存在，细胞表面有性毛。因子独立

11、存在，细胞表面有性毛。c）HfrHfr菌株菌株，F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上上，细胞表面有性毛。，细胞表面有性毛。d）FF菌株菌株，Hfr菌株内的菌株内的F因子因不正常切割而脱离染因子因不正常切割而脱离染色体时，色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，因子，特称为特称为F因子。因子。 细胞表面同样有性毛。细胞表面同样有性毛。编辑ppt18编辑ppt19编辑ppt20接合的一般过程接合的一般过程 接合时接合时F+细胞与细胞与F 细胞相遇，性菌毛与细胞相遇，性菌毛与F 细胞表面发生吸附细胞表面发生吸附而形成接合管；而形成接合管；

12、 F+细胞内，细胞内，F因子的一条因子的一条DNA单链在特定的位点上发生断裂；单链在特定的位点上发生断裂； 断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通过模板的滚动，一方面把解开的单链以通过模板的滚动，一方面把解开的单链以5为先导通过性菌毛为先导通过性菌毛推入推入F 细胞中，另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重细胞中，另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重新合成一条互补的环状单链，以取代传递到新合成一条互补的环状单链，以取代传递到F 细胞中的那条单细胞中的那条单链。这种链。这种DNA复制机制称为滚环模型（复制机制称为滚

13、环模型（rolling circle model）；）； 在在F 细胞中，以外来的供体细胞中，以外来的供体DNA线状单链为模板合成一条互线状单链为模板合成一条互补单链，并随之恢复成环状双链补单链，并随之恢复成环状双链F因子。因子。 至此，原来的至此，原来的F 菌株变成了菌株变成了F+ 菌株。原来的供体仍为菌株。原来的供体仍为F+ 菌株。菌株。编辑ppt21（二）转导（二）转导（transduction）通过通过病毒病毒（defective phage）的媒介，把供体细胞的媒介，把供体细胞的小片段的小片段DNADNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获

14、得前者部分遗传性状的现象，称为者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导转导。获得新遗。获得新遗传性状的受体细胞，就称传性状的受体细胞，就称转导子转导子（transductant）。）。编辑ppt22由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的一个细胞的DNADNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中 能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体转导噬菌体。编辑ppt23细菌转导的二种类型：细菌转导的二种类型：

15、普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导流产普遍转导流产普遍转导完全普遍转导完全普遍转导编辑ppt241.1.普遍转导普遍转导（generalized transduction） 通过极少数通过极少数完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体对对供体菌供体菌任何小任何小片段片段DNADNA进行进行“误包误包”，而将其遗传性状传递给，而将其遗传性状传递给受体受体菌菌的现象，称为的现象，称为普遍转导普遍转导。一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。编辑ppt25（1 1）完全普遍转导完全普遍转导 简称简称普遍转导普遍转导或或完全转导完全转导（complete transducti

16、on）。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNADNA片段的受体菌，外源片段的受体菌，外源DNADNA在其内进行在其内进行交换、整合和复交换、整合和复制制，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作普遍转普遍转导子导子，这种现象就称普遍转导。，这种现象就称普遍转导。编辑ppt26Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）鼠伤寒沙门氏菌）的野生菌株的野生菌株Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）鼠伤寒沙门氏菌）的营养缺陷型突变株的营养缺陷型突变株P22P22嗜菌体嗜菌体供体菌供体菌受体

17、菌受体菌编辑ppt27转导模型供体菌供体菌受体菌受体菌转导媒介转导媒介噬菌体噬菌体误包误包转导颗粒转导颗粒普遍转导子普遍转导子双双交交换换同源配对同源配对1010-6-61010-8-8编辑ppt28编辑ppt29过程：过程：（1）P22在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（体成熟与包装之际，极少数（10 6 10 8）噬菌体的衣壳将与）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA片段误包入其中，形片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身成了一个完全不含噬菌体自身DNA

18、的缺陷噬菌体。的缺陷噬菌体。（2）供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，）供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内。片段导入受体细胞内。（3）在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺）在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同

19、源区段配对，在通过片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。性状稳定的转导子。编辑ppt30S.typhimurium的的P22P22噬菌体噬菌体、E.coli的的P1P1噬菌体噬菌体、Bacillus subtilis的的PBS1PBS1和和SP10SP10等噬菌体等噬菌体都能进行都能进行完全普遍转导完全普遍转导。供体菌供体菌转导媒介转导媒介噬菌体噬菌体受体菌受体菌编辑ppt31（2 2）流产普遍转导流产普遍转导 简称简称流产转导流产转导（abortive t

20、ransduction）。经转。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNADNA片段的受体菌，外片段的受体菌，外源源DNADNA在其内既在其内既不进行交换、整合和复制不进行交换、整合和复制，也不迅速消，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。流产转导。编辑ppt32受体菌受体菌外源外源DNADNA细胞分裂细胞分裂外源基因经转录、转译而外源基因经转录、转译而形成的少量酶形成的少量酶获得外源获得外源DNADNA获得少量酶获得少量酶不不断断稀稀释释编辑ppt33特点：在选择培养基平板上形成微小菌落特点：在

21、选择培养基平板上形成微小菌落DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。编辑ppt34普遍性转导的三种后果：普遍性转导的三种后果：进入受体的外源进入受体的外源DNA通过通过与细胞染色体的重组交换与细胞染色体的重组交换而形成稳定的而形成稳定的转导子转导子。流产转导流产转导（abortive transduction）转导转导DNA不能进行重组和复制，但其不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小

22、菌落特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源外源DNA被降解，转导失败。被降解，转导失败。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。编辑ppt352.2.局限转导局限转导（specialized transduction， restricted transduction） 指通过指通过部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把把供体菌供体菌的少的少数数特定基因特定基因携带到携带到受体菌受体菌中，并与后者的基因组整中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。合、重

23、组，形成转导子的现象。 最初于最初于19541954年在年在E. coliK12中发现。中发现。编辑ppt36特点：特点： 只只局限于传递供体菌核染色体上的局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因个别特定基因，一般为噬菌体整合位点两侧的基因；一般为噬菌体整合位点两侧的基因； 该特定基因由该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体携带；携带； 缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率（程中，发生低频率（1010-5-5）“误切误切”（不正常切离，（不正常切离，abnormal excesion）或由于双重溶源菌的或由于

24、双重溶源菌的裂解裂解而形成；而形成； 局限转导噬菌体的产生要通过局限转导噬菌体的产生要通过UVUV等因素对溶源菌的等因素对溶源菌的诱导诱导并引起裂解后才产生。并引起裂解后才产生。编辑ppt37局局限限转转导导低频转导低频转导高频转导高频转导根据转导子出现频率的高低分类根据转导子出现频率的高低分类编辑ppt38温和噬菌体感染温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬偶尔发生的不正常切割而连在噬菌

25、体菌体DNA上上部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中编辑ppt39缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNADNA分子一样进行分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒转导颗粒。但没有正常噬菌体的但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，感染受体细胞后，通过，通过DNADNA整合进宿主染色体而形成稳定的整合进宿主染色体而形成稳定的转导子转导子。E. coli的的嗜菌体嗜菌体和和8080嗜菌体嗜菌体具有局限转导

26、的能力。具有局限转导的能力。编辑ppt40比较项目比较项目普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导转导的基因转导的基因供体染色体或染色供体染色体或染色体外的任何基因体外的任何基因供体染色体上与原噬菌体紧供体染色体上与原噬菌体紧密连锁的少数几个个别基因密连锁的少数几个个别基因噬菌体寄生噬菌体寄生的位置的位置不结合在寄主染色不结合在寄主染色体特定位置上体特定位置上结合在寄主染色体特定位置结合在寄主染色体特定位置上上获得转导噬获得转导噬菌体的方法菌体的方法通过敏感菌的裂解通过敏感菌的裂解或容源菌的诱导或容源菌的诱导紫外线诱导容源菌紫外线诱导容源菌转导子的区转导子的区别别一般稳定，非溶原一般稳定，非溶

27、原性（不表现出任何性（不表现出任何噬菌体的性状，包噬菌体的性状，包括免疫性）括免疫性）一般不稳定，呈缺陷溶原性一般不稳定，呈缺陷溶原性（对同源噬菌体具有免疫性，（对同源噬菌体具有免疫性，但不表现出其它噬菌体的性但不表现出其它噬菌体的性状）状）普遍性转导和局限性转导的比较普遍性转导和局限性转导的比较编辑ppt41受体菌受体菌（recipient cell，receptor）直接吸收直接吸收供体菌供体菌（donor cell）的的DNA片段而获得后者部分片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。遗传性状的现象，称为转化或转化作用。通过转化方式而形成的杂种后代，称通过转化方式而形成的杂种

28、后代，称转化子转化子（transformant）。（三）转化（三）转化（transformation） 1.1. 定义定义编辑ppt42原核生物原核生物Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）、肺炎链球菌）、Haemophilus（嗜血杆菌属）、嗜血杆菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、芽孢杆菌属）、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、根瘤菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）、葡萄球菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、假单胞菌属）、Xanthomonas（黄单胞菌属）等。黄单胞菌属）等。2.2.

29、转化微生物的种类转化微生物的种类编辑ppt43真核微生物真核微生物Saccharomy cescerevisiae（酿酒酵母）、酿酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脉孢菌）、粗糙脉孢菌）、Aspergillusniger（黑曲霉）等。黑曲霉）等。编辑ppt44 受体细胞要处于感受态受体细胞要处于感受态.感受态感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态片段并实现其转化的一种生理状态供体供体DNA片段片段（转化因子）转化因子）大小适宜，分子量一般大小适宜，分子量一般为为1 107 D 左右左右 菌株间的亲缘关

30、系密切菌株间的亲缘关系密切3 3、转化发生的条件、转化发生的条件编辑ppt45感受态感受态（competence）感受态感受态是指受体细胞最易接受外源是指受体细胞最易接受外源DNADNA片段片段并能实现转化的一种生理状态。并能实现转化的一种生理状态。研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。 感受态细胞感受态细胞（competent cell）具有摄取外源具有摄取外源DNADNA能力的细胞。能力的细胞。编辑ppt46自然感受态自然感受态是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态

31、人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNADNA的能力，的能力，或人为地将或人为地将DNADNA导入细胞内。导入细胞内。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）编辑ppt47 感受态感受态感受态受遗传控制，但也存在个体差异。感受态受遗传控制，但也存在个体差异。 感受态出现的时间不同；感受态出现的时间不同； 出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期受态出现在不同生长时期 Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）的

32、感受态出（肺炎链球菌）的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期，现在生长曲线中的指数期的中期， Bacillus（芽胞杆菌属）的一些种则往往出现在指数期）的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。末及稳定期的初期。编辑ppt48 感受态感受态 感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同态的细胞因菌种而不同. Bacillus subtilis不超过不超过1015% Streptococcus pneumonia和和Haemophilus influenzae（流（流感嗜血杆菌）达到感嗜血杆菌）达到100% 感受态由细

33、胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：cAMP、Ca2+等最明显。如用等最明显。如用CaCl2 处理处理E. coli可以诱发其可以诱发其产生感受态。产生感受态。 转化转化DNA的最低浓度：在群体中含有的最低浓度：在群体中含有15%感受态细胞时，感受态细胞时，0.1 gDNA/ml细胞悬液即可有效发生转化细胞悬液即可有效发生转化编辑ppt49调节感受态的一类特异蛋白称调节感受态的一类特异蛋白称感受态因子感受态因子。膜相关膜相关DNADNA结合蛋白结合蛋白（membrane-associated DNA binding protein）细胞

34、壁细胞壁自溶素自溶素（autolysin）几个核酸酶几个核酸酶编辑ppt50转化因子转化因子（transforming principle） 转化因子转化因子的本质是离体的的本质是离体的DNADNA片段。一般只有片段。一般只有1515kbkb左右。左右。在不同的微生物中，转化因子的形式不同。在不同的微生物中，转化因子的形式不同。良好的转化因子有良好的转化因子有dsDNAdsDNA（最宜于细胞表面结合）、最宜于细胞表面结合）、ssDNAssDNA和和质粒质粒DNADNA，通常不能与核染色体组发生重组。通常不能与核染色体组发生重组。编辑ppt51转化的频率通常为转化的频率通常为0.10.11.01

35、.0，最高为，最高为2020。能发生转化的最低能发生转化的最低DNADNA浓度极低，为化学方法无法浓度极低，为化学方法无法测出的测出的1 110105 5 gmL（即即1 110101111gmL ）。）。编辑ppt52自然遗传转化自然遗传转化（natural genetic transformation）人工转化人工转化（artificial transformation） 4 4、转化的类型、转化的类型根据感受态建立的方式，可以分为：编辑ppt535.5. 转化过程转化过程（1）自然遗传转化（简称自然转化）自然遗传转化（简称自然转化） 1928年，年，Griffith发现肺炎链球菌（发现肺

36、炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象，的转化现象，转化过程研究得较深入的就转化过程研究得较深入的就是这种是这种G G细菌。细菌。编辑ppt54目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行自然转化，需要二方面必要的条件：进行自然转化，需要二方面必要的条件：建立了感受态的受体细胞建立了感受态的受体细胞外源游离外源游离DNA分子分子编辑ppt55转化的过程 以以S. Pneumonia strr（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段：致可分为六阶段：吸附：吸附：双链双链DNA

37、片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。胞壁的赤道区）结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。在吸附过程的前阶段，如外界加入在吸附过程的前阶段，如外界加入DNA酶，就会减少转化子的酶，就会减少转化子的产生。稍后，产生。稍后，DNA酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞；胞；切割：切割：在吸附位点上的在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子被核酸内切酶分解，形成平均分子量为量为45106的的DNA片段；片段；入胞入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另

38、一种核酸酶切除，另双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5105的的DNA片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；编辑ppt56转化的过程重组：重组：来自供体菌的单链来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切

39、除，并被外来的单链切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，于是形成了一交换、整合和取代，于是形成了一个杂合个杂合DNA区段（区段（heterozygous region）。在这一过程中，有）。在这一过程中，有核酸酶、核酸酶、DNA聚合酶和聚合酶和DNA连接酶的参与；连接酶的参与；复制：复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；转化子形成：转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这

40、就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。编辑ppt57枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）编辑ppt58strR，存在抗链霉素的基因标记存在抗链霉素的基因标记strS，有链霉素敏感型基因标记有链霉素敏感型基因标记编辑ppt59自然转化过程的特点：自然转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；对核酸酶敏感；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）供体菌和受体菌之间的亲源关系；供体菌和受体菌之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低

41、得多；通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；b）不需要活的不需要活的DNA给体细胞；给体细胞；编辑ppt60提高质粒的自然转化效率的二种方法：提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高；活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌重组获救重组获救。编辑ppt61（2）人工转化）人工转化用用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用

42、的人工转化手段。处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源于一种可以摄取外源DNA的的“人工感受态人工感受态”。质粒的转化效率高；质粒的转化效率高；编辑ppt62可转化的形状可转化的形状荚膜多糖的合成荚膜多糖的合成专一性酶的合成专一性酶的合成专一性蛋白质的合成专一性蛋白质的合成抗药性抗药性编辑ppt63（四（四）原生质体融合原生质体融合（protoplast fusion）通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子的过程，称为状的稳定的重组子的过程，称为原生质体融合原生质体融合。由此法获得的重组子，成为由此法获得的重组子，成为融合子融合子（fusant）。）。编辑ppt64 适用范围：适用范围：各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种各