基因表达和功能的研究

1、基因通过表达发挥功能： tRNA 表达第一步转录 DNARNA rRNA mRNA mRNA DNA？转录物转录物分析分析11.1 克隆基因转录物的研究克隆基因转录物的研究 1. 电镜技术可观察到内含子；电镜技术可观察到内含子； 1. 电镜技术可观察到内含子电镜技术可观察到内含子2. 核酸酶处理可精确定位核酸酶处理可精确定位转录起始终止位点及内含子转录起始终止位点及内含子2. 核酸酶处理可精确定位核酸酶处理可精确定位转录起始终止位点及内含子转录起始终止位点及内含子3. 引物延伸反应能识别引物延伸反应能识别RNA的的5末端末端4.4.NorthernNorthern杂交杂交检测基因表达情况检测基

2、因表达情况 5.RT-PCR5.RT-PCR检测基因表达情况检测基因表达情况（原理、操作流程）（原理、操作流程）6.6.cDNAcDNA末端快速扩增末端快速扩增可定位转录端点可定位转录端点7.RNA7.RNA测序检测基因表达测序检测基因表达 我们一般通过测定我们一般通过测定RTRT一一PCRPCR的产物的序列来的产物的序列来达到达到RNARNA测序的目的。人们曾经发明过接对测序的目的。人们曾经发明过接对RNARNA分子测序的方法，但是这些方法往往效率很低分子测序的方法，但是这些方法往往效率很低，而且关键的是在测序之前必须纯化，而且关键的是在测序之前必须纯化RNARNA分子。分子。得到病毒基因组

3、得到病毒基因组RNARNA的纯化样品是可能的，但对的纯化样品是可能的，但对于从众多细胞于从众多细胞RNARNA，例如线粒体，例如线粒体RNARNA、核糖体、核糖体RNARNA，等中纯化单一的，等中纯化单一的mRNAmRNA分子则非常困难。然而分子则非常困难。然而，如果，如果RTRT一一PCRPCR中的引物设计正确，只有专一的中的引物设计正确，只有专一的目的目的mRNAmRNA被复制，那么对被复制，那么对RTRT一一PCRPCR产物的测序分产物的测序分析就能够提供析就能够提供mRNAmRNA的序列了。的序列了。 11.2 11.2 基因表达调控的研究基因表达调控的研究 11.2.1.11.2.1

4、.识别识别DNADNA分子的蛋白结合区分子的蛋白结合区11.2.1.111.2.1.1凝胶阻滞实验技术确定调控序列凝胶阻滞实验技术确定调控序列gel retardation（凝胶阻滞）：根据结合了蛋白质的DNA在凝胶电泳中行进较慢的特点，来检出它们的技术。P306 11.2.1.2 DNA足迹法确定调控序列的分子区域足迹法确定调控序列的分子区域 Footprinting（足迹法）：使用DNase I 降解DNA，通过检测被保护的磷酸二酯键，来鉴定蛋白质结合在DNA上的位点。P30511.2.1.2 DNA足迹法确定足迹法确定调控序列的分子区域调控序列的分子区域 11.2.1.3 修饰干扰实验确

5、定调控序列的碱基修饰干扰实验确定调控序列的碱基Mdification interference assay（修饰干扰实验）：通过化学修饰识别与DNA结合蛋白相结合的核苷酸。P30811.2.2.11.2.2.通过缺失分析来识别控制序列功能通过缺失分析来识别控制序列功能 Deletion analysis（缺失分析）：通过删除某个基因的上游区域来阻碍该基因的表达，进而推导出该基因调控序列的一种分析方法。P30411.2.2.11.2.2.通过缺失分析来识别控制序列功能通过缺失分析来识别控制序列功能 报告基因报告基因11.2.2.11.2.2.通过缺失分析来识别控制序列功能通过缺失分析来识别控制序

6、列功能缺失分析缺失分析 克隆基因定点突变克隆基因定点突变蛋白质结构功能改变蛋白质结构功能改变 如何分离克隆基因编码的蛋白？如何分离克隆基因编码的蛋白？11.3 鉴定和研究克隆基因翻译产物的方法鉴定和研究克隆基因翻译产物的方法11.3.1.HRT11.3.1.HRT和和HARTHART能够识别克隆基因的翻译产物能够识别克隆基因的翻译产物hybrid-release translation（HRT）( (杂交释放翻译杂交释放翻译) )hybrid-arrest translation（HART）（）（杂交俘获翻译）杂交俘获翻译） 一种识别由克隆基因编码的翻译产物的方法。一种识别由克隆基因编码的翻译

7、产物的方法。 mRNA mRNA 无细胞翻译系统无细胞翻译系统 蛋白蛋白11.3.1.HRT11.3.1.HRT和和HARTHART能够识别能够识别克隆基因的翻译产物克隆基因的翻译产物无细胞翻译无细胞翻译11.3.1.HRT11.3.1.HRT和和HARTHART能够识别能够识别克隆基因的翻译产物克隆基因的翻译产物杂交释放翻译杂交释放翻译11.3.1.HRT11.3.1.HRT和和HARTHART能够识别能够识别克隆基因的翻译产物克隆基因的翻译产物杂交俘获杂交俘获翻译翻译 尽管HRT或HART能够识别出克隆基因的翻译产物，但却不能告诉我们关于蛋白质本身的一些信息。而这些信息对研究蛋白质结构和其

8、活性状态密切相关。11.3.2.11.3.2.通过体外突变研究蛋白质通过体外突变研究蛋白质1.1.利用核酸酶引入突变技术利用核酸酶引入突变技术产生新的产生新的结构域结构域(螺旋螺旋)或使或使现存结构现存结构失去稳定失去稳定性性11.3.2.11.3.2.通过体外突变研究蛋白质通过体外突变研究蛋白质1.1.利用核酸酶引入突变技术利用核酸酶引入突变技术2.用寡核苷酸在克隆基因上导入点突变用寡核苷酸在克隆基因上导入点突变2.用寡核苷酸在克隆基因上导入点突变用寡核苷酸在克隆基因上导入点突变3.人工基因合成法引入点突变人工基因合成法引入点突变4.应用应用PCR技术构建定点突变技术构建定点突变11.3.3.11.3.3.蛋白与蛋白之间的相互作用的研究蛋白与蛋白之间的相互作用的研究噬菌体展示噬菌体展示11.3.3.11.3.3.蛋白与蛋白之间的相互作用的研究蛋白与蛋白之间的相互作用的研究噬菌体展示噬菌体展示酵母双杂交系统酵母双杂交系统酵母双杂交系统酵母双杂交系统 在酵母双杂交系统中，存在一对相互作用并且决定基因是否表达的转录因子：DNA结合域(DBD)和转录激活域(AD)。若这两种因子转到同一细胞中，由于没有相关蛋白诱导，靶因子仍无