第4章_液相色谱分析

1、第四章第四章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析2第四章第四章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析第一节第一节 概述概述第二节第二节 HPLC仪器仪器第三节第三节 高效液相色谱法的类型及分离原理高效液相色谱法的类型及分离原理第四节第四节 色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择第五节第五节 高效毛细管电泳简介高效毛细管电泳简介第六节第六节 纸层析和薄层层析纸层析和薄层层析3 教学目标及要求教学目标及要求 1、掌握高效液相色谱法的特点及适用范围，与掌握高效液相色谱法的特点及适用范围，与GC及经典及经典LC的异同。的异同。 2、掌握高效液相色谱仪的主要部件及基本流程。掌握高效液相色谱仪的主要部件及基本流程

2、。 3、理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围。、理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围。 4、理解各种分离方式的原理及选择原则。、理解各种分离方式的原理及选择原则。 5、了解、了解高效毛细管电泳基本原理、仪器高效毛细管电泳基本原理、仪器及特点。及特点。6、了解、了解纸层析和薄层层析分离过程、操作技术及特点。纸层析和薄层层析分离过程、操作技术及特点。4第一节第一节 概述概述 高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）是一种以是一种以液体为流动相液体为流动相的的快速分快速分离分析色谱技术离分析色谱技术，采用，采用细微粒固定相细微粒固定相、高压输液泵高压输液泵和和高灵敏高灵敏度检测器度检

3、测器，具有，具有高压、高速、高效、高灵敏度高压、高速、高效、高灵敏度的特点，对于的特点，对于那些那些沸点高沸点高，热稳定性差热稳定性差，相对分子质量大相对分子质量大的的有机化合物有机化合物如如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物、蛋白质、氨基酸、烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物、蛋白质、氨基酸、核酸等均可进行分离分析。核酸等均可进行分离分析。 按照固定相不同分为按照固定相不同分为：液液分配色谱；吸附色谱（液固：液液分配色谱；吸附色谱（液固色谱）；离子交换色谱；尺寸排阻色谱（凝胶渗透色谱）；色谱）；离子交换色谱；尺寸排阻色谱（凝胶渗透色谱）；离子色谱、平板色谱（薄层色谱）等。离子色谱、平板色谱（

4、薄层色谱）等。51. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高 压 ：高 压 ： HPlC供 液 压 力 和 进 样 压 力 都 很 高 （供 液 压 力 和 进 样 压 力 都 很 高 （ 150350X105Pa）。高压是的一个。高压是的一个突出特点突出特点。高速：高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。需时数小时。高效：高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻填充物颗粒极细且规则，

5、固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。分离。高灵敏度：高灵敏度：检测器灵敏度极高：检测器灵敏度极高：UV10-9g, 荧光检测荧光检测器器10-11g。62. HPLC与与GC的比较的比较分析对象及范围：分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定有机化合分析只限于气体和低沸点的稳定有机化合物（占总数的物（占总数的20%）；HPLC可分析高沸点、高分子量的稳定或可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定有机化合物（占不稳定有机化合物（占80%）。流动相的选择：流动相的选择：GC采用的流动相为几种采用的流动相

6、为几种“惰性惰性”气体，气体，只起运只起运载作用，对组分作用小载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体采用的流动相为液体或各种液体的混合（供选择的机会多）。它的混合（供选择的机会多）。它除了起运载作用外，还可与组分除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：操作温度：GC需高温；需高温；HPLC通常在室温下进行。通常在室温下进行。73. 应用应用极性增加极性增加不溶于水不溶于水溶于水溶于水非极性非极性

7、离子离子非离子极性非离子极性吸附吸附反向分配反向分配分配分配正向分配正向分配离子交换离子交换尺寸排阻尺寸排阻凝胶渗透凝胶渗透凝胶过滤凝胶过滤分分子子量量8第二节第二节 HPLC仪器仪器9HPLC仪器包括：仪器包括：高压输液装置高压输液装置 进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统 此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。梯梯度淋洗度淋洗101. 高压输液系统高压输液系统1）贮液器）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金合金)，其，其孔径约孔径约2 m，可防止颗粒物进入泵内。，可防止颗粒物进入泵内。2

8、）脱气）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。3）高压泵）高压泵：要求要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。输液泵种类：恒压型和恒流型。114）梯度淋洗装置）梯度淋洗装置：作用是在分离过程中，按一定的程序连续：作用是在分离过程中，按一定的程序连续改变流动相中多种不同性质溶剂的配比，以改变流动相的极改变流动相中多种不同性质溶剂的配比，以改变流动相的极性

9、、离子强度或酸度等，从而提高试样的分离效率，缩短分性、离子强度或酸度等，从而提高试样的分离效率，缩短分析时间，使色谱峰形得到改善，提高测定的灵敏度和定量的析时间，使色谱峰形得到改善，提高测定的灵敏度和定量的准确度。准确度。122. 进样系统进样系统1）隔膜注射进样隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但积小。但进样量小且重现性差进样量小且重现性差。2）高压进样阀高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此样品管控制，因此进样准确，重复性好进样准确，重复性好。装入样品装入样品出口出口进样

10、进样采样环采样环泵入溶剂泵入溶剂进色谱柱进色谱柱133. 色谱柱色谱柱1）要求要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为能小。柱长多为1530cm，内径为，内径为45mm；2）柱的填充柱的填充：主要采用匀浆法。：主要采用匀浆法。填充方法：填充方法： 填充时，将制作好的匀浆液，用流动相充满色谱柱及其填充时，将制作好的匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快（防凝聚、沉降或结速将其注入色谱柱内。要求填充速度快

11、（防凝聚、沉降或结块）、且无空气进入（影响填充均匀性）。块）、且无空气进入（影响填充均匀性）。144. 检测器检测器1）紫外检测器）紫外检测器 依据被分析组分对特定紫外光的选择性吸收。依据被分析组分对特定紫外光的选择性吸收。 最小检测量最小检测量10-9gmL-1，对流量和温度的波动不，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。敏感，可用于梯度洗脱。15光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器16波长波长可的松可的松氟美松氟美松皮质酮皮质酮快速扫描快速扫描光电二极管阵列（光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱）检测所获得的三维色谱-光谱图光谱图17原理原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相

12、和样品：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者溶剂相，利用二者对光的折射率不同对光的折射率不同。 为为通用型检测器通用型检测器，灵敏度为，灵敏度为10-7g/mL。但对温。但对温度变化敏感，且度变化敏感，且不适于梯度淋洗不适于梯度淋洗。光源光源调零调零光学零光学零参比参比样品样品平面镜平面镜透镜透镜光电转换光电转换记录仪记录仪放大器放大器遮光板遮光板2）示差折光检测器）示差折光检测器183）荧光检测器）荧光检测器 根据某些物质受激后能产生一定强度荧光的性质根据某些物质受激后能产生一定强度荧光的性质，可制，可制成灵敏度极高的荧光检测器。它是一种成灵敏度极高的荧光检测器。它是一种选

13、择性很强的检测器选择性很强的检测器，其灵敏度比其灵敏度比UV检测器高检测器高23个数量级。个数量级。 适合于稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色适合于稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等荧光物质的测定。素、蛋白质等荧光物质的测定。 4）电导检测器）电导检测器 主要用于离子色谱的检测。主要用于离子色谱的检测。 原理原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。19第三节第三节 高效液相色谱法的类型及分离原理高效液相色谱法的类型及分离原理 一、一、吸

14、附色谱（液固吸附色谱）吸附色谱（液固吸附色谱） 二、分配色谱二、分配色谱 三、离子交换色谱三、离子交换色谱 四、体积排阻色谱四、体积排阻色谱高高效效液液相相色色谱谱法法的的分分类类20一、一、吸附色谱（液固吸附色谱）吸附色谱（液固吸附色谱）吸附色谱吸附色谱是基于各组分在固体吸附剂表面上具有是基于各组分在固体吸附剂表面上具有不不同吸附能力同吸附能力而进行分离。而进行分离。l以固体吸附剂为固定相，如极性的硅胶、氧化铝、以固体吸附剂为固定相，如极性的硅胶、氧化铝、分子筛和非极性的活性炭等（较常使用分子筛和非极性的活性炭等（较常使用硅胶硅胶）。流动）。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。相可以是

15、各种不同极性的一元或多元溶剂。l宜于宜于分离极性不同或含极性基团相同但数目不同的分离极性不同或含极性基团相同但数目不同的试样，也适于分离异构体试样，也适于分离异构体，但不宜于分离同系物。，但不宜于分离同系物。 21二、分配色谱（液液分配色谱）二、分配色谱（液液分配色谱） 原理原理 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系数不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中，随着。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。待测物的迁移速率不同

16、，从而实现分离的过程。222. 流动相流动相 根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为液色谱分为正相分配色谱正相分配色谱和和反相分配色谱。反相分配色谱。正相分配色谱正相分配色谱： 流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离适于极性组分分离。反相分配色谱反相分配色谱： 流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离适于非极性组分分离。233. 固定相固定相 原则上，用于原则上，用于GC的固定相也可用于的固定相也可用于HPLC作固作固定

17、相。但定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：种，按极性由高到低为： , -氧二丙腈氧二丙腈（ODPN)、聚乙二醇聚乙二醇（PEM）、角鲨烷、角鲨烷（SQ）。 早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相相, 现多为现多为化学键合固定相化学键合固定相（通过化学反应将有机通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。）。24正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高

18、极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性：待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系25三、离子交换色谱三、离子交换色谱 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定结合，测定各类阴、阳离子的分离各类阴、阳离子的分离分析方法。分析方法。它它既适于无机离子，也适于有机物分离既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、，如蛋白质、氨基酸、核酸等。氨基酸、核酸等。1. 原理原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力：利用不同待测离子对固定

19、相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。（或离子交换能力）的差别来实现分离的。OHXNRRXOHNR-R:阴离子交换HMSORMHSO-R:阳离子交换33-3-3262. 固定相固定相 按离子交换剂类型分四种：按离子交换剂类型分四种： 类型类型 官官能能团团 强强阳阳离离子子交换交换剂剂 -SO3- 阳阳离离子子交换交换剂剂 弱弱阳阳离离子子交换交换剂剂 -CO2- 强强阴阴离离子子交换交换剂剂 -NR3+ 阴阴离离子子交换交换剂剂 弱弱阴阴离离子子交换交换剂剂 -NH2+ 27微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性

20、核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆离子交换剂硅胶层涂覆按固定相按固定相制作方法制作方法可分为：可分为：283. 流动相流动相 离子交换色谱流动相为离子交换色谱流动相为无机酸或无机碱的无机酸或无机碱的盐盐类缓冲溶液（有一定类缓冲溶液（有一定pH和离子强度），通过改变和离子强度），通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。进而影响样品待测物的分离。29离子色谱（离子色谱（IC） 以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象以无机、特别是

21、无机阴离子混合物为主要分析对象。30离子色谱的原理离子色谱的原理: 采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；在分离柱后，用另外一支抑制柱来消除淋洗液的高本在分离柱后，用另外一支抑制柱来消除淋洗液的高本底电流底电流;采用电导检测器检测流出组分。快速分离分析微量无采用电导检测器检测流出组分。快速分离分析微量无机离子混合物机离子混合物;各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。31例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下

22、列反为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：应：R+OH + HCl(流动相流动相)R+Cl- + H2O R+OH + MCl(待测物待测物) R+Cl + M+OH- 可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。测离子转化为具有更大淌度的碱。离子色谱的原理离子色谱的原理: 32离子色谱的特点：离子色谱的特点：分析速度快：可在数分钟内完成一个试样的分析；分析速度快：可在数分钟内完成一个试样的分析；分离能力高：在适宜的条件下，可使常见的各种阴分离能力高：在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；离子混合物分离； 分

23、离混合阴离子（分离混合阴离子（NO3、NO2、SO42、PO43等）惟一快速、灵敏、准确的最有效分析方法等）惟一快速、灵敏、准确的最有效分析方法 。缺点：缺点：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。宽，降低分离度。33四四 、尺寸排阻色谱法、尺寸排阻色谱法 又称凝胶（渗透）色谱，主要又称凝胶（渗透）色谱，主要用于大分子的分子用于大分子的分子分离分离。它是。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的分离的。1、分离原理、分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似

24、于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小（分子量最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小（分子量大小）先后从柱中流出。大小）先后从柱中流出。342. 固定相固定相3. 流动相的要求流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似（润：能溶解样品且与凝胶相似（润湿凝胶）、粘度小（增加扩散速度）。湿凝胶）、粘度小（增加扩散速度）。 类型类

25、型 材料材料 型号型号 特点特点 流动相流动相 葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶 Sephadax 水水 软性凝胶软性凝胶 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶胀溶胀,小分小分子分离子分离 有机溶剂有机溶剂 聚苯乙烯聚苯乙烯 Styragel 有机溶剂有机溶剂 半刚性凝胶半刚性凝胶 聚乙酸酯聚乙酸酯 Emgel(OR) 溶胀溶胀较小较小流速较小流速较小 有机溶剂有机溶剂 玻璃珠玻璃珠 CPG-10 有机溶剂和水有机溶剂和水 刚性凝胶刚性凝胶 多孔硅胶多孔硅胶 Porasil 刚性大、刚性大、高高流速分离流速分离 有机溶剂和水有机溶剂和水 35第四节第四节 色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择 一般可

26、根据试样相对分子质量范围、溶解度及一般可根据试样相对分子质量范围、溶解度及分子结构等进行分离方法的初步选择分子结构等进行分离方法的初步选择。一、根据相对分子质量选择一、根据相对分子质量选择二、根据溶解性选择二、根据溶解性选择三、根据分子结构选择三、根据分子结构选择36分子量分子量 水溶水溶性性 方方 法法 流动相流动相 可溶可溶 排阻色谱排阻色谱 水水 2000 不溶不溶 排阻色谱排阻色谱 水水 分配色谱分配色谱(同系物同系物) 各种各种 吸附色谱吸附色谱(异构物异构物) 各种各种 不溶不溶 排阻色谱排阻色谱(分子大小分子大小) 各种各种 反相液液色谱反相液液色谱 各种各种 可溶但不解离可溶但

27、不解离 排阻色谱排阻色谱 水水 阳离子交换色谱阳离子交换色谱(碱碱) 缓冲液缓冲液 可溶且不解离可溶且不解离 阴离子交换色谱阴离子交换色谱(酸酸) 缓冲液缓冲液 3时时, 形成双电层，在高电场形成双电层，在高电场的作用下，双电层中的水合阳离子引起毛细管中的溶液整体的作用下，双电层中的水合阳离子引起毛细管中的溶液整体向负极移动，速度向负极移动，速度电渗流电渗流413、分离过程：、分离过程：424 4、分离类型、分离类型 毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZE）：最普遍、最基本的一种分：最普遍、最基本的一种分离模式。离模式。43毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGE）：）：将聚丙烯酰胺在毛细管柱内

28、交联生成凝胶。其具有多孔性，类将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。等。44 毛细管胶束电动力学色谱（毛细管胶束电动力学色谱（MECC）：）： 用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。 45二、仪器装置二、仪器装置46 电压：电压：030KV。 分离柱不涂敷任何固定液；分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导

29、荧光检测器（紫外或激光诱导荧光检测器（10-1910-21 mol/L）47三、主要特点和应用三、主要特点和应用高分辨率高分辨率：理论：理论n高达数百万块，甚至数千万块；高达数百万块，甚至数千万块；高灵敏度高灵敏度：可检测出低至：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质；浓度的物质；高分析速度高分析速度：可在：可在3分钟内分离分钟内分离30种阴离子；种阴离子；1.7分分钟分离钟分离19种阳离子；种阳离子；4分钟可分离分钟可分离10种蛋白质；种蛋白质；试样用量少试样用量少：仅需几：仅需几nL（10-9 L）的试样；）的试样；仪器仪器简单简单，操作，操作成本低成本低：分析一个试样仅需几毫升：分析一个试样仅需几毫升流动液。流动液。48不足之处：不足之处： 进样不够方便。应用范围相对较窄。进样不够方便。应用范围相对较窄。 分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但分析阴离子时，由阴极进