中药化学总论四节课件

1、中药化学总论中药化学总论硕士研究生课程 溶解度差异 在两相溶剂中分配比差异 吸附性差异 分子大小差异 解离程度差异 第四节 分离纯化方法CCD(逆流分配法)DCCC(液滴逆流色谱)HSCCC(高速逆流色谱)重结晶沉淀法溶剂沉淀法酸碱沉淀法专属沉淀试剂盐析法分配比k萃取法 调pH萃取大小1. 重结晶一. 根据成分溶解度的差异 溶剂：溶剂： 温度: 时间: 浓度: 常用混合溶剂: 操作 促进结晶生成 2. 沉淀法溶剂沉淀法酸碱沉淀法专属沉淀试剂 其 它水提醇沉醇提水沉 Me CO-Et O沉淀碱溶酸沉 酸溶碱沉生物碱沉淀试剂铅盐沉淀试剂明胶沉淀试剂胆甾醇石灰乳盐 析 盐析法盐析法: : 定义：根据

2、有效成分的性质（在水中溶解度不是很大），向水提液中加入无机盐，使达到一定的浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低而沉淀析出，与水溶性较大的杂质分离的方法。 常用无机盐：NaCl、Na2SO4、（NH4）2SO4. e.g 黄藤 1%HAc 1%HAc提取液 NaCl、OH- 巴马丁 三七 水提液 MgSO4 沉淀（三七皂苷乙）二. 根据成分在两相溶剂中分配比的差异两相溶剂萃取法（液两相溶剂萃取法（液- -液萃取法）液萃取法） 定义：利用各种化合物在互不相溶的二相溶剂中“分配系数”的不同而分离的方法。各化合物在二相中分配系数差异越大，则分离效果愈好。 应用：一般从中药水提液中以有机溶剂萃取。

3、C6H6、Et2O、CHCl3苷元、低极性苷 EtOAc、n-BuOH皂苷、黄酮苷、多元酚 酸性成分调酸后 CHCl3、EtOAc、n-BuOH等萃取 再加OH- 水相、有机相反复处理。 碱性成分调碱后 CHCl3、EtOAc、n-BuOH等萃取 再加H+ 水相、有机相反复处理。 注意： a、萃取次数：35次，有时510次 b、萃取是否完全：以TLC、PC或试管反应检验 c、调酸碱萃取：注意始终保持PH不变，也可用缓冲溶液代替水液 d、反复调酸碱：常用盐酸，无氧化性 （与硫酸、硝酸比） 氨水，碱性温和，可与盐酸生成NH4Cl e、乳化的消除：放置（时时转动或搅动） 离心（20004000转/m

4、in） 加热或冷置 例 从某中药中分离到A、B、C三种生物碱类化合物，用不同pH缓冲纸层析，色谱图如下图所示。展开剂为氯仿，上行展开。试问： 三个化合物的碱性强弱顺序如何？ 三个化合物中是否有两性生物碱？ 请设计一个合理的工艺流程图将A、B、C三种生物碱的混合物分离。（1）CBA （2）有，C （3）+CHCl3，pH6.5 H2O 氯仿层（A、B）+H+ pH5.0 水层（B） 氯仿层（A） 水层（C） CCD(逆流分溶法)DCCC(液滴逆流色谱)内径约1.6mmHSCCC()两相溶剂反复剧烈混合和分层分配频率13次/秒溶剂系统是分离的关键：溶剂系统是分离的关键：弱极性 正己烷+水 MeOH

5、/EtOH/EtOAc 亲脂性化合物中等极性 氯仿+水 MeOH/EtOH/EtOAc 苷元、苷强极性 正丁醇+水 MeOH/EtOH/EtOAc 亲水性化合物 调pH溶剂体系 基本两相 调节剂 适用化合物三氟乙酸 Al2O3 硅胶硅胶 吸附层析吸附层析 聚酰胺聚酰胺 大孔树脂大孔树脂 活性碳活性碳 离子交换层析离子交换层析 凝胶层析凝胶层析 液液层析（分配柱层析）液液层析（分配柱层析）液相层析液相层析液固层析液固层析 色谱法分类 硅胶硅胶(SiO2XH2O) 柱层析柱层析: 100-160目1、硅胶、硅胶 / 氧化铝氧化铝水分水分 17%, 17%, 无吸附作用无吸附作用, ,105105可

6、除水，重现活性。可除水，重现活性。三. 根据成分的吸附性差异 Al2O3 100150目柱层析用 分类: 碱性氧化铝（pH 9）:生物碱,甾族成分 中性氧化铝（pH 7.5）:中性、碱性亲脂性成分 酸性氧化铝（pH 23) ：有机酸类成分 活度： 含水量（%） 0 3 6 10 15 活度（级） I II III IV VABABAB 上样量 样品-吸附剂 1：20 柱子高度与直径 15：1 20：1 装柱方法干法/ 湿法 均匀无气泡 上样方法干法/ 湿法 原始色带小洗脱剂极性由小到大依次洗脱Pet-EtOAcCH2Cl2-MeOH 实例， 粉防己中汉防己甲、乙素的分离 汉防己甲素 R = C

7、H3 汉防己乙素 R = HOCH3CH3OCH3ORCH3H3CONNOO 分类2.02 x 105 Pa 20.2 x10 x105 5 PaPa低压柱层析装置 原理：原理：同液-液萃取，支持剂表面吸附固定相。 支持剂：支持剂：硅胶、硅藻土、纤维素 操作：操作： 装柱：固定相与支持剂搅拌，滤去多余固定相； 放入流动相中饱和平衡； 流动相湿法装柱。 加样：湿法、干法； 加样量：支持剂-1：1001：1000 洗脱剂：用前与固定相饱和。分配柱层析分配柱层析 溶剂系统溶剂系统 海绵海绵20Kg20Kg95%EtOH提，回收提，回收C6H12 CHCl3 H2O(+)n-BuOH (35g)n-B

8、uOHFr1 Fr11 Fr18制备制备HPLCHPLC分离分离8.5 mg purpurone(+)YMC Gel ODS-A, 500/400YMC Gel ODS-A, 500/400目目10% 95%EtOH /H2O洗脱洗脱(+) 应用于上世纪70年代 分离原理 由苯乙烯、-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等为原料加入一定量致孔剂二乙烯苯聚合而成，球状颗粒，直径一般在0.31.25 mm之间。 吸附性：吸附性：颗粒的总表面积大,有极性基团； 分子筛：分子筛：有微观小球的网状孔穴结构，对分子量 不同的化合物有选择性。 分为非极性、弱极性和中极三类。2. 大孔树脂大孔树脂 影响吸附与解吸

9、附的因素 洗脱剂的影响：洗脱剂的影响：洗脱剂极性越小，洗脱能力越强。 蒸馏水 10%EtOH 95%EtOH 树脂结构：树脂结构：极性、空间结构(孔径、比表面积、孔容) 化合物的分子量 LD605型大孔树脂: 生物碱黄酮酚性成分无机物多糖多糖蛋白质蛋白质氨基酸氨基酸小极性小极性成分成分 树脂型号选择：树脂型号选择：饱和吸附量：吸附前溶液含量-吸附后溶液含量;吸附率：饱和吸附量/样品吸附前的总量；解吸率：解析液含量/饱和吸附量；比吸附量：上样液含量-过柱液含量-水洗液含量 树脂质量温度的影响：温度的影响：物理吸附,低温不利于吸附 pH值：值：酸碱性化合物 碱性成分在碱液中吸附，酸液中解吸, 酸性

10、成分在酸液中吸附，碱液中解吸。 0.02mol/L HCl MeOH洗脱率提高。 样品浓度：样品浓度： 原液浓度过低，时间增加, 效率降低; 原液浓度过高，则泄漏早,处理量小,树脂的再生周期短。 洗脱液的选择： 可选用不同浓度的MeOH、EtOH、Me2CO， 流速0.55ml/cm/min。 非极性大孔树脂 洗脱剂极性越小，洗脱能力越强。 中极性大孔树脂 用极性较大有机溶剂。预处理及再生预处理及再生 含有未聚合的单体、制孔剂、引发剂及其分解物、分散剂和防腐剂等脂溶性杂质,使用前应先预处理。预处理：预处理： 选用甲醇、乙醇或丙酮洗至加适量水至无白色浑浊现象,再用蒸馏水洗至无醇味即可。再生：再生

11、： 常用乙醇。80%含水醇、酮或0.11 mol/L NaOH (or HCl)含水醇、酮进行洗涤,用水洗至中性。 特点：特点： 吸附容量大、选择性好、易于解吸附、机械强度高、再生处理简单、吸附速度快以及不污染环境等优点。 应用应用 ： 皂苷、环稀醚萜苷等水溶性化合物富集。 人参总皂苷：人参总皂苷： D101型大孔吸附树脂，以50%乙醇洗脱, 洗脱率 90% 纯度 - 60.1% 1 BV/hpH 5 70%乙醇洗脱 (质量分数71.53%,收率86.02%)3、聚酰胺树脂、聚酰胺树脂 吸附原理：吸附原理： 含水系统：反向柱层析 非水溶剂系统：正向柱层析酚类，酸类，醌类酚类，酸类，醌类双重层析

12、性能：双重层析性能： 氢键 + 极性吸附 既有酰胺基，又有非极性脂肪链 如 黄酮苷(A)、相应的黄酮苷元(B) 含水溶剂洗脱（含水醇）： A B（水中氢键牢固，且对苷溶解性大） 非水溶剂洗脱（如CHCl3-MeOH）： B A （极性吸附原理） 预处理：预处理： 1. 装柱前先过筛; 2. 90%-95%乙醇装柱, 洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣; 3. 5%NaOH水溶液洗至无色； 4. 蒸馏水洗; 5. 10%醋酸水溶液洗脱; 6. 蒸馏水洗脱至pH中性，备用。 再生再生 1. 5%NaOH水溶液(浸泡)洗至色极淡为止; 2.用蒸馏水洗脱至pH8-9; 3. 10%醋酸水溶液洗脱; 4.

13、蒸馏水洗脱至pH中性. 常用再生剂常用再生剂: 3%NH4OH、 5%NaOH、 10%醋酸 使用方法： 1)装柱：装柱： 聚酰胺混悬于水中，湿法装柱； 非极性溶剂系统低级性的溶剂装柱; 2)上样：上样：上样量:1.5-2.5g /100ml树脂， 浓度20%-30% 水溶性提取物直接上样； 水溶性不好样品，干法上样。 加样：20 30% 样品水液 样品：聚酰胺 = 1：40 60 a、除杂，样品量可大大增加 b、样品不溶于水，可用少量醇溶后，拌入少量聚酰胺粉，挥去溶剂，悬浮于洗脱剂中上样 3) 洗脱：洗脱： 水 递增乙醇浓度 氯仿 氯仿-甲醇 递增甲醇浓度 稀氨水或稀甲酰胺溶液洗脱 影响因素

14、影响因素 样品浓度： 低浓度样品有利吸附温度温度流速流速流速小有利吸附影响不大洗脱剂：洗脱剂： 应用：青钱柳黄酮部位（81.34%）40%乙醇粗提物（11. 40%）室温，上样量，pH 8样品浓度 8 mg/mL流速 2.0 mL/min40%乙醇洗脱 原理原理: 非极性吸附 化合物极性越大，吸附越弱。 水中吸附强，有机溶剂中吸附弱。 规格规格 粉未-吸附力、吸附量大，但流速慢； 颗粒-吸附力弱，流速快。4 4、活性炭、活性炭用水装柱，醇梯度洗脱。用水装柱，醇梯度洗脱。 吸附规律吸附规律 无机盐 氨基酸 单糖 二糖 - 皂苷 黄酮 - 色素 极性基团数量：酸性、中性、碱性氨基酸分开； 芳香族化

15、合物 脂肪族化合物 大分子化合物 小分子化合物 装柱装柱 水湿法装柱 装柱前用蒸馏水泡1h，搅拌去气泡。 应用应用 产品精制脱色：产品精制脱色： 糖、苷类等亲水性成分 样品溶解 加活性炭至无色 抽滤 水溶性成分分离：水溶性成分分离：单糖、低聚糖、氨基酸等 柱分离 中药粗粉中药粗粉 pet脱脂，CaCO3, 50%EtOH提，静置 滤液滤液 回收浓缩，EtOH温浸 沉淀沉淀 浸出液浸出液 （无机盐、蛋白质）（无机盐、蛋白质） 活性碳脱色 糖混合物（单糖、低聚糖）糖混合物（单糖、低聚糖） 糖混合物糖混合物 活性炭柱，洗脱活性炭柱，洗脱 H2O 10%EtOH 15%EtOH 3040%EtOH （

16、二糖）（二糖） （三糖）（三糖） （低聚糖）（低聚糖）盐盐 氨基酸氨基酸 单糖单糖 离子交换剂离子交换剂离子交换树脂离子交换树脂 化合物解离程度离子交换纤维素离子交换纤维素离子交换凝胶离子交换凝胶水溶性大分子（多糖、蛋白质）离子交换、分子筛有机酸、生物碱、两性化合物四. 根据成分解离程度差异离子交换色谱离子交换色谱 结构 骨架：骨架： 苯乙烯系(0)、丙烯酸系(1)、酚醛系(2) 环氧系(3)、乙烯吡啶系(4)、脲醛系(5) 氯乙烯系(6)七类732型(强酸1X7)（1）离子交换树脂）离子交换树脂阳离子交换树脂：阳离子交换树脂： 磺酸基(-SO3H)（强酸性） 羧酸 (-COOH) (弱酸性）

17、阴离子交换树脂：阴离子交换树脂： 季铵基(强碱性) 伯胺基、仲胺基、叔胺基（弱碱性） 种类种类 交换容量：交换容量：可交换基团-毫克当量/g（树脂） 732型（树脂1X7）4.5m Eq / g 1g树脂交换（丙氨酸）89 x 4.5mg交联度：交联度： 交联剂-二乙烯苯，网孔大小用交联度表示. 性能性能 适用适用 肽肽, ,蛋白质蛋白质 氨基酸氨基酸, ,二肽二肽 小分子酸小分子酸/ /碱碱低低 RSO3-H+ + Na+ RSO3-Na+ + H+ 氢型(游离型) 钠型(盐型) RN+(CH3)3OH- + Cl- RN+(CH3)3 Cl- + OH- 羟基型(游离型) 氯型(盐型)预处

18、理预处理 膨胀膨胀: : 盐型 氢型 重复一次重复一次 盐型 氢型阳离子交换树脂阳离子交换树脂RSO3-Na+钠型RSO3-H+氢型R-N+(CH3)3OH-羟基型R-N+(CH3)3Cl-氯型水洗中性 2-3倍量5%HCl 2-3倍量5%NaOH 重复 各一次 同处理至氢型水洗无Na+阴离子交换树脂阴离子交换树脂 2-3倍量5%NaOH 2-3倍量3%HCl 重复 各一次 同处理至氢型水洗中性 操作方法 上样量上样量: : 阳离子树脂,1/2交换量; 阴离子树脂,1/3交换量. 膨膨 胀胀: : 蒸馏水中浸12天; 装装 柱柱: : 柱中注入1/4高度的水，逐渐加入树脂； 反反 洗洗: :自

19、柱下部进水，从顶部出水反洗树脂， 除去树脂床中细碎颗粒及悬浮杂质； 交交 换换: : 酸/碱/盐洗脱; 树脂酸化/碱化,有机溶剂提取水提取液水提取液上清液上清液 样品相对密度样品相对密度 1.1; 1.2; 1.3pH 1; 3; 5BV 1; 1.2; 1.5树脂树脂- -苦参碱苦参碱总生物碱总生物碱醇沉至醇沉至70%70%醇液醇液 应用应用 ：部位分离纯化水混合液水混合液NaNa2 2COCO3 3洗洗NHNH4 4ClCl洗洗水洗水洗阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂 糖-OH上引入离子基团 阳离子树脂 CM-cellulose（羧甲基纤维素） CM-sepha

20、dex（羧甲基葡聚糖凝胶） 阴离子树脂 DEAE-cellulose(二乙氨基乙基纤维素） DEAE-sephadex (二乙氨基乙基葡聚糖凝胶）（2）离子交换纤维素）离子交换纤维素/离子交换凝胶离子交换凝胶 适用：适用： 多糖（中性、酸性） pH6洗脱液：洗脱液：酸性多糖吸附，中性多糖流出； 浓度不同硼砂洗脱液：浓度不同硼砂洗脱液：中性多糖 离子强度不同的离子强度不同的PH缓冲液：缓冲液：酸性多糖 商陆粗多糖商陆粗多糖DEAE-纤维素柱色谱纤维素柱色谱水水 0.05mol/L NaOAc 0.1mol/L NaOAc 0.5mol/L NaOAcPEP-1PEP-II 原理 分子筛1、凝胶过

21、滤色谱、凝胶过滤色谱五. 根据分子大小差异 种类与性质葡聚糖凝胶:Sephadex G, 水中分离 Sephadex LH-20. 水及极性溶剂中使用聚丙烯酰胺凝胶: 丙烯酰胺聚合, 性质与应用与前者相仿,对芳香核/杂环化合物有吸附作用.琼脂糖凝胶:以共价键交联,稳定性差,无吸附性质,应用于分子量几万几千万蛋白质分离.疏水性凝胶疏水性凝胶: 聚甲基丙烯酸酯凝胶,聚苯乙稀凝胶等,应用于不溶于水的有机物分离,有机溶剂浸泡洗脱. 网孔与交联剂网孔与交联剂 商品型号按交联剂大小分类，以吸水量表示。Sephadex G-25： 吸水量 x 10Sephadex LH-20: 水及极性溶剂中使用Sephadex LH20 特点特点： 1、价钱高，可大规模制备； 2、结合凝胶过滤、分配色谱及吸附性层析，能分离结构非常相近的化合物； 3、载样量可高，300mg样品/ml凝胶。 原理：原理： 凝胶过滤凝胶过滤- -反相分配：反相分配：用反相溶剂，大分子、极性大化合物先洗脱； 凝胶过滤：用凝胶过滤：用正相溶剂，大分子化合物先洗脱； Sephadex LH20 样品处理与洗脱溶剂样品处理与洗脱溶剂反相溶剂系统：反相溶剂系统：甲醇/水系统 样品：用最少体积流动相溶解，过滤，湿法上样； 冲柱：