蛋白质组学WB

1、基础医学院生物化学与分子生物学教研室基础医学院生物化学与分子生物学教研室易发平易发平硕士生学位课程：蛋白质组学硕士生学位课程：蛋白质组学-5候选蛋白质的验证候选蛋白质的验证蛋白质蛋白质酶解酶解肽的混合物肽的混合物PMF搜索引擎Search engine 数据库数据库搜索结果搜索结果验证验证蛋白质组研究路线蛋白质组研究路线RNAi实验流程实验流程免疫荧光法免疫荧光法授课内容授课内容4流式细胞术流式细胞术免疫印迹法免疫印迹法免疫组化法免疫组化法1231候选蛋白质的验证候选蛋白质的验证一一1蛋白质与生物大分子蛋白质与生物大分子的相互作用的相互作用二二下一讲下一讲免疫印迹法免疫印迹法blotting

2、实验技术实验技术 印迹法印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，年，英国英国 Edwin Mellor Southern建立了将建立了将DNA转移到转移到硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用膜）上，并利用DNARNA杂交检测特杂交检测特定的定的DNA片段的方法，称为片段的方法，称为Southern印迹法印迹法。免疫印迹法免疫印迹法Southern Blotting Northern blottingWestern BlottingEaste

3、rn BlottingSouthwestern blottingfar-western blotting2D电泳分离蛋白质，然后转膜，特异的探针去检测电泳分离蛋白质，然后转膜，特异的探针去检测 SDS-PAGE分离蛋白分离蛋白,转膜转膜,尿素去除尿素去除SDS,蛋白复性蛋白复性,特定特定DNA探针检测。探针检测。与目标蛋白结合的非抗体蛋白质检测与目标蛋白结合的非抗体蛋白质检测检测对象是检测对象是DNA检测对象是检测对象是RNA检测对象是特定蛋白质检测对象是特定蛋白质检测蛋白质翻译后修饰检测蛋白质翻译后修饰 检测检测DNA和蛋白质相互作用和蛋白质相互作用 检测蛋白质之间的相互作用检测蛋白质之间的

4、相互作用碱基互补配对碱基互补配对 对对象象已已知知确确定定对象对象未知未知免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 基本原理基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。抗原抗体之间特异的免疫反应。抗原抗体之间特异的免疫反应。 免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 一般流程一般流程l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色蛋白样品的制备蛋白样品的制备S

5、DS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳免疫印迹法免疫印迹法成功的要素成功的要素科学的对照科学的对照免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 流程详解流程详解l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳（1）免疫印迹法免疫印迹法之之 蛋白样品的制备蛋白样品的制备Western Blotting 实验技术实验技术通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白1.1.水溶液提取法水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶针对

6、水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。盐析。盐析沉淀出的蛋白质一般保持着天然构象。常用的中性盐是硫酸铵。沉淀出的蛋白质一般保持着天然构象。常用的中性盐是硫酸铵。 细胞裂解液：细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2g/mL Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin ， pH8.0 免疫印迹法免疫印迹法蛋白样品的制备蛋白样品的制备2

7、.低温有机溶剂提取法低温有机溶剂提取法蛋白质处在一定量的有机溶剂中，分子间极性基团蛋白质处在一定量的有机溶剂中，分子间极性基团的静电引力增强，水化作用降低，蛋白质聚集而沉的静电引力增强，水化作用降低，蛋白质聚集而沉淀。对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机淀。对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。该法沉淀蛋溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。该法沉淀蛋白质的选择性较高，不需脱盐。白质的选择性较高，不需脱盐。免疫印迹法免疫印迹法蛋白样品的制备蛋白样品的制备3.水溶性多聚物沉淀法水溶性多聚物沉淀法 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（）、葡聚糖（DEX）等溶于

8、水中，）等溶于水中，蛋白质的极性基团与多聚物分子中的氧或氢氧根结合，蛋白质的极性基团与多聚物分子中的氧或氢氧根结合，形成二者的复合体，从溶液中沉淀析出。改变多聚物形成二者的复合体，从溶液中沉淀析出。改变多聚物的浓度可分段沉淀出不同的蛋白质。的浓度可分段沉淀出不同的蛋白质。4. 通过层析或电洗脱法、色谱等制备目的蛋白通过层析或电洗脱法、色谱等制备目的蛋白2-DE 分离蛋白分离蛋白免疫印迹法免疫印迹法蛋白样品的制备蛋白样品的制备病病 毒毒细细胞胞叶叶绿绿体体细胞膜细胞膜protein2-DE鉴定鉴定验证验证免疫印迹法免疫印迹法目的蛋白质的量较多目的蛋白质的量较多，至少占总蛋白量的至少占总蛋白量的1

9、%，常为，常为5%-9%，使纯化易于进行。，使纯化易于进行。可利用融合蛋白质的特性进行纯化。可利用融合蛋白质的特性进行纯化。利用标示物利用标示物（tag）的特性，用亲合层析柱，可快速分离纯化融）的特性，用亲合层析柱，可快速分离纯化融合蛋白质，最后切除合蛋白质，最后切除tag即可。很多表达载体已带有即可。很多表达载体已带有tag的的DNA序列。序列。重组蛋白的特点重组蛋白的特点免疫印迹法免疫印迹法包含体的形成。包含体的形成。主要出现在大肠杆菌等原核生物中，溶解度很主要出现在大肠杆菌等原核生物中，溶解度很小的蛋白都进入包含体中，包含体中的蛋白质主要是外来性的小的蛋白都进入包含体中，包含体中的蛋白质

10、主要是外来性的重组蛋白。离心的方法先收集包含体，再从中分离蛋白。重组蛋白。离心的方法先收集包含体，再从中分离蛋白。分泌蛋白质的生成。分泌蛋白质的生成。目的蛋白前加入信号肽序列，可使真核细目的蛋白前加入信号肽序列，可使真核细胞内表达的蛋白分泌到培养基中，因其中的蛋白质种类较少而胞内表达的蛋白分泌到培养基中，因其中的蛋白质种类较少而使目的蛋白的分离纯化得以简化。大肠杆菌等有细胞壁的细胞使目的蛋白的分离纯化得以简化。大肠杆菌等有细胞壁的细胞可分泌至周质中，收集细胞后，改变渗透压，同时加入少量溶可分泌至周质中，收集细胞后，改变渗透压，同时加入少量溶菌酶破坏细胞壁，提取周质后，纯化目的蛋白。菌酶破坏细胞

11、壁，提取周质后，纯化目的蛋白。重组蛋白的特点重组蛋白的特点免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 蛋白样品的定量蛋白样品的定量生物化学所学的方法都可以。凯氏定氮法、生物化学所学的方法都可以。凯氏定氮法、双缩脲法、福林双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法。酚法和紫外吸收法。免疫印迹法免疫印迹法蛋白样品的定量蛋白样品的定量紫外吸收法紫外吸收法：蛋白质在：蛋白质在280nm左右有吸收高峰（因色氨酸和左右有吸收高峰（因色氨酸和酪氨酸的吸收），不同的蛋白，其中色氨酸和酪氨酸的含量酪氨酸的吸收），不同的蛋白，其中色氨酸和酪氨酸的含量各异，因此各异，因此A280值不同。值不同

12、。Bradford法法 （适合小分子多肽）（适合小分子多肽） 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量上样量)免疫印迹法免疫印迹法蛋白样品的定量蛋白样品的定量凯氏定氮法：凯氏定氮法：蛋白质中氮在浓硫酸作用下生成铵盐，与浓蛋白质中氮在浓硫酸作用下生成铵盐

13、，与浓NaOH作用，产生氨气，吸收于标准硼酸溶液中，用标准酸作用，产生氨气，吸收于标准硼酸溶液中，用标准酸直接滴定，测出含氮量，按蛋白质恒定的含氮量（直接滴定，测出含氮量，按蛋白质恒定的含氮量（16%），），换算出蛋白的含量。换算出蛋白的含量。福林福林-酚法酚法（Lowry法）：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸残基与半胱氨酸残基与Cu2+结合，生成复合物，进而还原酚试剂结合，生成复合物，进而还原酚试剂的磷钼酸，生成蓝色化合物，用比色法测定。的磷钼酸，生成蓝色化合物，用比色法测定。免疫印迹法免疫印迹法蛋白样品的定量蛋白样品的定量BCA法法 （适合微量、含少量化学物质的

14、样品）（适合微量、含少量化学物质的样品）1 灵敏度高，检测浓度下限达到灵敏度高，检测浓度下限达到25g/ml，最小检测蛋白量，最小检测蛋白量达到达到0.5g，待测样品体积为，待测样品体积为1-20l 。 2 不受绝大部分样品中去污剂等化学物质的影响，如：不受绝大部分样品中去污剂等化学物质的影响，如：SDS，Triton X-100，Tween 。 3 在在20-2000g/ml浓度范围内有良好的线性关系。浓度范围内有良好的线性关系。 4 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法。检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法。 5 会受螯合剂和较高浓度还原剂的影响：如会受螯合剂和较高浓度

15、还原剂的影响：如EDTA、DTT、巯、巯基乙醇。基乙醇。其他商品化的试剂盒也可测蛋白含量。其他商品化的试剂盒也可测蛋白含量。免疫印迹法免疫印迹法蛋白样品的定量蛋白样品的定量试剂：考马斯亮蓝工作液，试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将将10mg/ml蛋白溶液稀释至蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）。）管号管号012345678ddH2O905055606570758085蛋白标蛋白标准液准液04035302

16、52015105HCl101010101010101010免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 流程详解流程详解l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS-PAGE（2）之之 SDS-PAGEWestern Blotting 实验技术实验技术免疫印迹法免疫印迹法SDS-PAGE 原理原理蛋白质进行蛋白质进行PAGE时，其迁移率取决于所带的净电荷时，其迁移率取决于所带的净电荷量以及分子的大小、形状等因素。如在胶中加入量以及分子的大小、形状等因素。如在胶中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白分

17、子中的二硫键还原。和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白分子中的二硫键还原。 SDS使蛋白的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分使蛋白的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质子上，形成蛋白质-SDS复合物。大量的复合物。大量的SDS结合后，结合后，各种蛋白都带上相同的负电荷，大大超过了蛋白原有各种蛋白都带上相同的负电荷，大大超过了蛋白原有的电荷量，因而原有的电荷差别可忽略。所以，的电荷量，因而原有的电荷差别可忽略。所以，蛋白蛋白质的迁移率主要取决于它的分子质量质的迁移率主要取决于它的分子质量。免疫印迹法免疫印迹法SDS-PAGE 凝胶成份凝胶成份丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺（亚甲

18、双丙烯酰胺（Bis） 聚合而成的分子筛，孔径大小由二者的总浓度及聚合而成的分子筛，孔径大小由二者的总浓度及Bis的浓度决定。的浓度决定。Bis一定的情况下，总浓度越高，孔一定的情况下，总浓度越高，孔径越小。径越小。免疫印迹法免疫印迹法SDS-PAGE 凝胶成份凝胶成份TEMED过硫酸铵（过硫酸铵（APS）(时间时间) TEMED 及及APS激发网状结构的形成。分子氧阻止链的延激发网状结构的形成。分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。所以凝胶液需排气，在水或水饱合异丁长，防碍聚合作用。所以凝胶液需排气，在水或水饱合异丁醇隔绝空气的条件下反应。醇隔绝空气的条件下反应。SDS配胶的配胶的Tris缓冲液缓

19、冲液Tris-甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液免疫印迹法免疫印迹法凝胶浓度（）凝胶浓度（）线性分离范围（线性分离范围（KD)KD)151512-4312-43101016-6816-687.57.536-9436-945.05.057-21257-212凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围免疫印迹法免疫印迹法浓缩胶浓缩蛋白质的原理浓缩胶浓缩蛋白质的原理 在不连续在不连续SDS-PAGE时时,采用了两种缓冲液浓度、采用了两种缓冲液浓度、pH值和值和凝胶孔径，上层胶为凝胶孔径，上层胶为浓缩胶浓缩胶（大孔径大孔径），下层胶为），下层胶为分离胶分离胶（分子筛）（分子筛）。 浓缩胶中的缓冲对为浓

20、缩胶中的缓冲对为Tris-HCl，电泳，电泳Buffer的缓冲对为的缓冲对为Tris-甘氨酸。电泳时，胶中的甘氨酸。电泳时，胶中的Cl-移动最快，移动最快， 电泳缓冲液中电泳缓冲液中的甘氨酸（的甘氨酸（pI为为6.0）在浓缩胶）在浓缩胶pH6.8时解离度很小，故移动时解离度很小，故移动最慢。而最慢。而SDS-Protein 在无分子筛效应的大孔径浓缩胶中移在无分子筛效应的大孔径浓缩胶中移动速度居第二。即动速度居第二。即泳动速度为泳动速度为Cl- 蛋白蛋白甘氨酸离子。甘氨酸离子。免疫印迹法免疫印迹法浓缩胶浓缩蛋白质的原理浓缩胶浓缩蛋白质的原理 随着电泳的进行，随着电泳的进行， Cl-与后面的蛋白

21、带与后面的蛋白带之间形成电之间形成电势梯度，同样的势梯度，同样的蛋白与甘氨酸离子蛋白与甘氨酸离子之间也会之间也会形成电势梯形成电势梯度度。高电势使蛋白质和甘氨酸离子的移动速度加快，形高电势使蛋白质和甘氨酸离子的移动速度加快，形成一个迅速移动界面。成一个迅速移动界面。由于蛋白质的有效泳动度居第二，由于蛋白质的有效泳动度居第二，使使蛋白质蛋白质聚集在这个移动界面附近，聚集在这个移动界面附近，被浓缩成一狭窄的被浓缩成一狭窄的中间层。中间层。所以，加样后，通过此浓缩过程，都能形成一所以，加样后，通过此浓缩过程，都能形成一狭窄的区带。狭窄的区带。免疫印迹法免疫印迹法电泳时通常推荐在电泳时通常推荐在上层胶

22、时使用低电压恒压电泳上层胶时使用低电压恒压电泳,而在而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据或者可以根据预染蛋白质分子量标准预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。SDS-PAGE 电压设置电压设置免疫印迹法免疫印迹法*预染蛋白质分子量标准预染蛋白质分子量标准包含了从包含了从19kD到到117kD共共6种纯化的预染蓝色蛋白质，种纯化的预染蓝色蛋白质，可以直接使用

23、，无需煮沸。每次上样可以直接使用，无需煮沸。每次上样5-10微升，就可以在微升，就可以在电泳时、电泳后或转电泳时、电泳后或转膜后观察到非常清楚的蛋白条带。膜后观察到非常清楚的蛋白条带。SDS-PAGE 预染标准蛋白预染标准蛋白免疫印迹法免疫印迹法1）电压。）电压。小的电压会使胶的分子筛效应得到充小的电压会使胶的分子筛效应得到充 分发挥，电压越小，条带越漂亮。分发挥，电压越小，条带越漂亮。SDS-PAGE 注意事项注意事项免疫印迹法免疫印迹法SDS-PAGE 注意事项注意事项SDS-PAGE结果结果免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 流程详解流程详解l转膜

24、转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳（3）Western Blotting 实验技术实验技术 之之 转膜转膜免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 转膜方法转膜方法半干法半干法按：用缓冲液湿润滤纸按：用缓冲液湿润滤纸3张、膜、凝胶、缓冲液湿张、膜、凝胶、缓冲液湿润滤纸润滤纸3张顺序放置，电转张顺序放置，电转1030min。但高分子。但高分子量的蛋白转移效率较低。量的蛋白转移效率较低。免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之

25、转膜方法转膜方法湿法湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转的缓冲液中，电转45min或过夜。或过夜。具体条件需考虑蛋白分子大小及样品中蛋白实际含量高低。具体条件需考虑蛋白分子大小及样品中蛋白实际含量高低。免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 转膜后检测转膜后检测丽春红丽春红S染色染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次，脱色。素滤膜，换水几次，脱色。印度墨汁染色印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记只用于放射性标记抗体

26、或放射性标记A蛋白探针的蛋白探针的Western印迹过程。印迹过程。免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 流程详解流程详解l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳（4）免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 封闭封闭- Why?抗体抗体蛋白蛋白膜膜显色信号显色信号免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 封闭封闭目的：目的：防止抗体与膜的非特异性结合。防止抗体与膜的非特异性结合。脱脂奶

27、粉（脱脂奶粉（5）BSAWestern Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）膜封闭液（生物试剂公司提供）封闭液选择封闭液选择在进行抗体杂交之前，需要采用在进行抗体杂交之前，需要采用异源性蛋白质先对转异源性蛋白质先对转印膜进行封闭印膜进行封闭，防止免疫试剂的非特异性吸附，从而，防止免疫试剂的非特异性吸附，从而降低背景，增加灵敏度，提高信噪比。常用封闭物有降低背景，增加灵敏度，提高信噪比。常用封闭物有脱脂奶粉和脱脂奶粉和BSA（稀释于不同的缓冲液中），但不（稀释于不同的缓冲液中），但不同的抗原同的抗原-抗体反应，封闭条件均不相同。抗体反应，封闭条件均不相同。牛奶封闭液可能含有能与抗山羊类抗体交叉

28、反应的牛奶封闭液可能含有能与抗山羊类抗体交叉反应的IgG, 由此产生非特异性背景。建议使用由此产生非特异性背景。建议使用casein（牛（牛奶中的酪蛋白）或奶中的酪蛋白）或BSA做封闭。做封闭。免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 流程详解流程详解l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳（5）免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 一抗杂交一抗杂交n把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑

29、料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入的量加入加入一抗加入一抗溶液溶液与滤膜温育。与滤膜温育。37一小时，一小时，4 过夜。过夜。n洗去未结合的一抗：洗去未结合的一抗：回收一抗溶液回收一抗溶液，用，用PBS漂洗漂洗液滤膜液滤膜3次，每次次，每次10min。回收一抗溶液回收一抗溶液 ？n在在Western或免疫荧光染色等操作后，请注意回收稀释或免疫荧光染色等操作后，请注意回收稀释的抗体。的抗体。回收的抗体回收的抗体在进行在进行Western或免疫荧光染色时或免疫荧光染色时至至少可以重复使用少可以重复使用10次。次。稀释后的抗体，包括已经使用过的稀释后的抗体，包括

30、已经使用过的稀释抗体，稀释抗体，4保存。保存。n回收后重复使用的抗体，使用方法同新鲜稀释的抗体。回收后重复使用的抗体，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10000g离心离心1-3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废抗体出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。弃该抗体。一抗杂交一抗杂交-一抗选择一抗选择n免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位

31、），有些表位是线性的，而有的属于构象型；（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你性会消失。如果你所用的抗体识别的是所用的抗体识别的是蛋白上连续的几蛋白上连续的几个氨基酸，也就是个氨基酸，也就是线性表位线性表位，那么这种抗体，那么这种抗体可同时用于可同时用于免疫组化和免疫组化和Western，而，而如果抗体识别构象形表位，则如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化只能用于免疫组化

32、。一般抗体说明书上都有注明此种抗。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。体识别的氨基酸区间。 单抗：识别单个抗原表位，所以特异性高单抗：识别单个抗原表位，所以特异性高。但如果。但如果所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果，这所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之一。也是单抗的缺点之一。 多抗：多抗：虽然存在交叉反应的问题，但由于虽然存在交叉反应的问题，但由于识别多个识别多个抗原表位抗原表位，所以即使有少数几个抗原表位被破坏，所以即使有少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结果，这是多抗的优点之一。仍然不会影响实验结果，这是多抗的优点之一。一抗杂交一抗杂交-

33、一抗选择一抗选择免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 流程详解流程详解l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳（6）免疫印迹法免疫印迹法加入用封闭液配制的二抗加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，摇床上缓慢摇动， 37一小时，一小时，4 过夜。过夜。n洗去未结合的二抗洗去未结合的二抗：倒掉二抗溶液，用：倒掉二抗溶液，用PBS漂漂洗液滤膜洗液滤膜3次，每次次，每次10min。Western Blotting 实验技术实验技术之之 二抗杂交二抗杂交免疫印迹

34、法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 二抗杂交二抗杂交二抗算不算多余？一抗不能显色吗？二抗算不算多余？一抗不能显色吗？一抗是特异性的，常用单抗。一抗是特异性的，常用单抗。二抗要求广谱抗体，最好能够一对多。二抗要求广谱抗体，最好能够一对多。 一抗如果是鼠抗人的抗体，二抗应该是另一种动一抗如果是鼠抗人的抗体，二抗应该是另一种动物抗鼠的抗体，而且物抗鼠的抗体，而且一抗和二抗的动物种属原则一抗和二抗的动物种属原则上不应该相同上不应该相同。一般来说，。一般来说，一抗多用兔抗和鼠抗，一抗多用兔抗和鼠抗，而二抗多用羊抗。而二抗多用羊抗。 免疫印迹法免疫印迹法Western Bl

35、otting 实验技术实验技术之之 流程详解流程详解l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳（7）免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 底物显色底物显色 辣根过氧化物酶法（辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法化学发光显色法(HRP)免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 底物显色底物显色在同一张膜上检测目的蛋白和内对照（在同一张膜上检测目的蛋白和内对照（-actin，GAPDH

36、 ），应先上目的蛋白的一抗、二抗，），应先上目的蛋白的一抗、二抗，显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，显色、压片、洗片。一抗、二抗，显色、压片、洗片。 Western Blotting 实验技术实验技术之之 底物显色底物显色DAB、 ECL法都能达到纳克的要求。法都能达到纳克的要求。ECL是一种是一种增强显色法增强显色法，灵敏度要高，但显色麻烦，发表文，灵敏度要高，但显色麻烦，发表文章常用。章常用。DAB（3,3二氨基联苯胺）和二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的反应产生棕色的不溶终产物不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有。这种棕色

37、沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。疫组化染色应用特别理想。常用显色法的原理常用显色法的原理Western Blotting 实验技术实验技术之之 底物显色底物显色Ecl 显色原理显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。酶的底物。在在Ecl底物中，含有底物中，含有H2O2和鲁米诺，在

38、和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。注意：荧光在一段时间后会越来越弱。注意：荧光在一段时间后会越来越弱。常用显色法的原理常用显色法的原理免疫印迹法免疫印迹法-成功例子成功例子A.RT-PCR; B. Western blotC.Col I mRNA 数据分析数据分析 D. Col I蛋白数据分析蛋白数据分析免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 Western blotting 可以特异性检测某个蛋白质分可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量和半定量分析，但是不能定位。子，进行定量和半定量分析，但是

39、不能定位。定量定量Western Blotting技术需要具备两个必要条技术需要具备两个必要条件。其一：信号必须稳定，保证不同时间点检测件。其一：信号必须稳定，保证不同时间点检测都可以得到相同的结果；其二：信号的强弱必须都可以得到相同的结果；其二：信号的强弱必须与目标蛋白深度成比例关系。与目标蛋白深度成比例关系。免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术利用红外激光器产生的激光激发红外荧光染料利用红外激光器产生的激光激发红外荧光染料，产，产生的发射光由高灵敏度光电二极管检测荧光信号强生的发射光由高灵敏度光电二极管检测荧光信号强度。荧光信号一经激发出来就是稳定的，不随

40、时间度。荧光信号一经激发出来就是稳定的，不随时间变化；荧光强弱与目标蛋白浓度成比例关系（浓度变化；荧光强弱与目标蛋白浓度成比例关系（浓度越高，结合的染料越多，荧光信号越强），越高，结合的染料越多，荧光信号越强），根据荧根据荧光强弱就可以对蛋白进行精确的定量分析。光强弱就可以对蛋白进行精确的定量分析。之之 免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术Western blot 的半定量的半定量将图片扫描保存为电脑文将图片扫描保存为电脑文件，件，用分析软件用分析软件（如：（如：GIS1000）将图片上每个特将图片上每个特异条带灰度值数字化异条带灰度值数字化。目的蛋白的灰度值

41、除以内参。目的蛋白的灰度值除以内参GAPDH/Actin的灰度值以校正误差，所得结果代的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。表某样品的目的蛋白相对含量。之之 免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting 实验技术实验技术之之 免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，有时会免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，有时会有假阳性。有假阳性。免疫组化定量分析（半定量）：用对免疫组化产物免疫组化定量分析（半定量）：用对免疫组化产物染色，同时用苏木对细胞核进行复染。镜下观察样品，细染色，同时用苏木对细胞核进行复染。镜下观察样品，细胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性

42、的地方会呈现胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性的地方会呈现棕黄色）。棕黄色）。根据细胞着色深度及阳性细胞数根据细胞着色深度及阳性细胞数分别记分为分别记分为03 分分,着色深度以多数细胞呈色程度为准。常用着色深度以多数细胞呈色程度为准。常用软件进软件进行处理行处理，如，如image pro plus 5.0（IPP5）。）。 免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting常见问题分析常见问题分析Western Blotting 常见问题分析常见问题分析不恰当的样品制备会导致实验失败不恰当的样品制备会导致实验失败新手采用含新手采用含TritonX-100或或NP-40的缓冲液裂解组织或细

43、胞，的缓冲液裂解组织或细胞，结果无蛋白条带。因为步骤太多，新手无法保证每一步操作结果无蛋白条带。因为步骤太多，新手无法保证每一步操作都正确。都正确。SDS-PAGE上样样品中蛋白实际含量较低。上样样品中蛋白实际含量较低。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析SDS-PAGE 不完美不完美u 胶不平？胶不平？u 凝胶漏液？凝胶漏液？ 胶板洗刷干净胶板洗刷干净 加入加入APSAPS和和TEMEDTEMED的量要合适的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶温度合适，受热不均匀导

44、致胶聚合不均匀聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐Western Blotting 常见问题分析常见问题分析u 条带比正常的窄？条带比正常的窄？u “微笑微笑”或或“倒微倒微笑笑”条带？条带？4 4，5 5，6 6，7 7 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，胶板底部有气

45、泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适置是否合适SDS-PAGE 不完美不完美Western Blotting 常见问题分析常见问题分析SDS-PAGE 不完美不完美条带条带1、2、3、9的形状，属电泳条件比较合适的区带，的形状，属电泳条件比较合适的区带，其余都是电泳条件不太理想所致。其余都是电泳条件不太理想所致。影响区带形状因素：凝胶的孔径，样品的盐浓度，蛋白影响区带形状因素：凝胶的孔径，样品的盐浓度，蛋白质的量（如质的量（如8，量太多，带向下垂），电泳过程中产生，量太多，带向下垂），电泳过程中产生的热，点样的位置（如在胶的左、右端的样品，因电压

46、的热，点样的位置（如在胶的左、右端的样品，因电压关系常出现歪斜），浓缩胶点样槽的底部不平也造成区关系常出现歪斜），浓缩胶点样槽的底部不平也造成区带的歪斜。带的歪斜。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析SDS-PAGE 不完美不完美条带呈笑脸状条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。拖尾：样品溶解不好。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带呈皱眉状，条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者

47、两边聚合不完全。挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析转膜及抗体检测转膜及抗体检测u 凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？u 条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？u 单个或多个白点？单个或多个白点？u 转膜缓冲液过热？转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡液中浸泡5-10min5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治三明治”结构不紧凑导致。可在结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块

48、之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温压太高。转膜过程注意降温Western Blotting 常见问题分析常见问题分析一抗浓度影响结果一抗浓度影响结果一抗浓度太高，导致没有特异带。可能与抗体一抗浓度太高，导致没有特异带。可能与抗体-抗原结合抗原结合的所谓空间位阻现象有关，也可能是高浓度抗体导致的的所谓空间位阻现象有关，也可能是高浓度抗体导致的高背景会洇灭特异信号。高背景会洇灭特异信号。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析背景太高背景太高proteinprotein背景太高背景太高背景较浅背景较浅对比度要好。对比

49、度要好。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析背景太高背景太高膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染封闭不充分封闭不充分抗体与封闭剂出现交抗体与封闭剂出现交叉反应叉反应抗体浓度过高抗体浓度过高 原原因因对对策策转膜前用转膜前用100%100%甲醇将膜完甲醇将膜完全浸湿全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度Western Blotting 常见问题分析常见问题分析背景太

50、高背景太高从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。对于一些背景较高的抗体，可以在对于一些背景较高的抗体，可以在4 封闭过夜。封闭过夜。 如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。洗涤次数。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析DAB法显色中常出现的问题及对策法显色中常出现的问题及对策(1)膜干燥之后，区带颜色变浅，甚至看不见了。膜干燥之后，区带颜色变浅，甚至看不见了。 原因原因：这是该区带的蛋白量很少

51、所致，属正常变化。：这是该区带的蛋白量很少所致，属正常变化。 对策对策：如果为了照像，可将膜浸湿，增强信号，但为：如果为了照像，可将膜浸湿，增强信号，但为 了根本解决问题，还需增加点样量。了根本解决问题，还需增加点样量。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析DAB法显色中常出现的问题及对策法显色中常出现的问题及对策(2)膜一放入显色液中，显色液就变色，膜的背景也很深。膜一放入显色液中，显色液就变色，膜的背景也很深。 原因原因：二抗反应后，膜洗得不干净，还有过量的过氧化：二抗反应后，膜洗得不干净，还有过量的过氧化物酶或碱性磷酸酶存在；显色液的温度过高；显色液或物酶或碱性磷酸酶

52、存在；显色液的温度过高；显色液或基质的浓度过高。基质的浓度过高。 对策对策：立即倒掉显色液，膜用漂洗液充分洗净之后，重：立即倒掉显色液，膜用漂洗液充分洗净之后，重新显色。但是如果背景颜色已太深，清晰的图谱已难得到；新显色。但是如果背景颜色已太深，清晰的图谱已难得到；将显色液温度降低之后，再显色；将显色液中各成分的将显色液温度降低之后，再显色；将显色液中各成分的浓度降低，重新配制。浓度降低，重新配制。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析显色中常出现的问题及对策显色中常出现的问题及对策(3)显色液没有被污染，但是区带显色迅速，颜色变黑，显色液没有被污染，但是区带显色迅速，颜色

53、变黑， 显色液也变色。显色液也变色。 原因：原因：不是异常结果，而是区带的蛋白质含量高。不是异常结果，而是区带的蛋白质含量高。 对策：对策：将显色液稀释，使反应速度减慢，但最好是将将显色液稀释，使反应速度减慢，但最好是将 蛋白质点样量减少。蛋白质点样量减少。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析显色中常出现的问题及对策显色中常出现的问题及对策(4)显色时间已足够长，但仍不见区带出现，显色液也澄显色时间已足够长，但仍不见区带出现，显色液也澄 清不变色。清不变色。 原因：原因：过氧化物酶或碱性磷酸酶都不存在或已失活过氧化物酶或碱性磷酸酶都不存在或已失活 显色液有问题。显色液有问

54、题。 对策：对策：检查二抗是否有错，膜充分洗净后，用新配检查二抗是否有错，膜充分洗净后，用新配 制抗体反应；制抗体反应； 重新配制显色液。重新配制显色液。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析显色中常出现的问题及对策显色中常出现的问题及对策(5)显色时间已足够长，显色液已变色，但仍不见区带出现。显色时间已足够长，显色液已变色，但仍不见区带出现。 原因原因：一抗所对应的抗原蛋白质不存在，或量很少；：一抗所对应的抗原蛋白质不存在，或量很少； 一抗和二抗都失活，或二抗不能与一抗反应。一抗和二抗都失活，或二抗不能与一抗反应。 对策：对策：增大电泳时的蛋白质点样量；增大电泳时的蛋白质

55、点样量； 分别确定一抗、二抗活性的有无。如结合反应正分别确定一抗、二抗活性的有无。如结合反应正 常，最后测定抗体的效价。常，最后测定抗体的效价。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析不同公司的试剂结果迥然不同公司的试剂结果迥然ECL发光。背景高掩发光。背景高掩盖目的条带。失败。盖目的条带。失败。同一张膜用同一张膜用TBS-T冲洗，再改用另外冲洗，再改用另外公司的公司的ECL发光，发光，曝光后成功。曝光后成功。Western Blotting 常见问题分析常见问题分析杂带多的原因杂带多的原因1. 一抗如是多克隆抗体，可以试着降低一抗的浓度；如一一抗如是多克隆抗体，可以试着降低

56、一抗的浓度；如一 抗是单抗，可适当降低二抗的浓度抗是单抗，可适当降低二抗的浓度2. 最重要的是确保封闭的充分，封闭最好时间长点，至少最重要的是确保封闭的充分，封闭最好时间长点，至少2 小时室温封闭，时间允许可小时室温封闭，时间允许可4度过夜封闭度过夜封闭3. 洗膜一定要充分。如是洗膜一定要充分。如是DAB 显色时间不要过长，一般显色时间不要过长，一般2 分钟足够。分钟足够。 4. 细胞传代次数过多，促使其蛋白表达模式的分化。细胞传代次数过多，促使其蛋白表达模式的分化。5. 蛋白样品降解或存在二聚体。蛋白样品降解或存在二聚体。免疫印迹法免疫印迹法膜上蛋白质的膜上蛋白质的其他用途其他用途氨基酸序列

57、分析氨基酸序列分析作为抗原免疫动物制备抗体作为抗原免疫动物制备抗体免疫荧光法免疫荧光法授课内容授课内容4流式细胞术流式细胞术免疫印迹法免疫印迹法 免疫组化法免疫组化法1231候选蛋白质的验证候选蛋白质的验证一一1免疫组化法免疫组化法免疫组化是利用免疫组化是利用抗原与抗体抗原与抗体特异性结合的原理，特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、荧光素、酶、金属离子、同位素金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质多肽和蛋白质)，对其进行，对其进行定位、定性及定量定位、定性及定量的的研究，称为免疫组织化学。研究

58、，称为免疫组织化学。 免疫组化法免疫组化法之之 原理及定义原理及定义免疫组化法免疫组化法免疫组化法免疫组化法之之 抗体抗体单克隆抗体单克隆抗体是一个是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。隆所产生的抗体混合物。 免疫组化法免疫组化法免疫组化法免疫组化法之之 标本来源标本来源主要为主要为组织标本组织标本和和细胞标本细

59、胞标本两大类，前者包括石蜡两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；是免疫组化中首照观察；还能长期存档，供回顾性研究；是免疫组化中首选的组织标本制作方法。选的组织标本制作方法。 免疫组化法免疫组化法免疫组化法免疫组化法之之 标本制作

60、标本制作U2Os细胞系细胞系APE1免疫组化染色免疫组化染色-细胞爬片法细胞爬片法石蜡切片机石蜡切片机 冰冻切片机冰冻切片机 免疫组化法免疫组化法免疫组化法免疫组化法之之 主要步骤主要步骤洗载玻片洗载玻片 包埋组织包埋组织 切片切片 脱蜡脱蜡 抗原修复抗原修复 血清封闭血清封闭 加一抗加一抗 加二抗加二抗 加显色剂加显色剂 复染复染 脱水脱水 封片封片 免疫组化法免疫组化法免疫组化法免疫组化法之之 抗原修复抗原修复 ？ 石蜡切片标本均用石蜡切片标本均用甲醛固定甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发