第四章 高效液相色谱

1、一、一、 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速、高速、高效、高灵敏度。高速、高速、高效、高灵敏度。HPLC一个突出的特点，供液压力和进样压力可达一个突出的特点，供液压力和进样压力可达高速：高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。析需时数小时。高效：高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的

2、力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。分离。高灵敏度：高灵敏度：检测器灵敏度极高：检测器灵敏度极高：UV10-9g, 荧光检测器荧光检测器10-11g。4-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素理理nLH/2221 2()5.54()16()RRRtttnYY理effeffnLH/ 221 25.54()16()RReffttnYYRMtkt2)1(kknneff理/HAB uC u（填充柱）（毛细管柱）或uCuBH/dpA2dpAgmDDB22gRDBtB，MTDTDgg或使用细粒的固定相并填充均匀可减小使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效

3、。，提高柱效。减小减小B值，提高柱效的措施：使用分子量较大的载气，值，提高柱效的措施：使用分子量较大的载气，增加载气流速，降低温度，增大柱压。增加载气流速，降低温度，增大柱压。gpDdkk222)1 (01. 02223 (1)fldkkD IgCCC采用粒度小的填充物和相对分采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做子质量小的气体（如氢气）做载气，可使载气，可使Cg减小，提高柱效。减小，提高柱效。 一般采用表面积较大的载一般采用表面积较大的载体来降低液膜厚度。应控体来降低液膜厚度。应控制适宜的柱温。制适宜的柱温。CuuBAH 气相色谱速率方程和液相色谱速率方程的形式基本一致，主气相

4、色谱速率方程和液相色谱速率方程的形式基本一致，主要要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计,影响柱效的主要因素影响柱效的主要因素是传质阻力项。是传质阻力项。(2) 纵向扩散项纵向扩散项Hb可忽略可忽略uDCHmbb同于气相色谱同于气相色谱分子在液相中分子在液相中的扩散系数比的扩散系数比在气相中小在气相中小45数量级。数量级。(3) 传质阻力项传质阻力项 CuuDdCHsfss2ksfsCdD：与 有关的系数；：固定液的厚度；：试样分子在固定液内的扩散系数。uDdCHmpmm2kmpmCdD：与 有关的系数；：固定相粒度；：试样分子在流动相中的扩散系数。smC

5、：为常数使用细粒的固定相，粒度规则，并填充均匀，固定相孔径使用细粒的固定相，粒度规则，并填充均匀，固定相孔径大，可减小大，可减小Hm，提高柱效。，提高柱效。2smpsmmC dHuD2222sfmpsmpdmpsmmBHACuuC dC dC dC DduuDDD问题：气相色谱与液相色谱的问题：气相色谱与液相色谱的H-u曲线有何不同，曲线有何不同，是什么原因造成的？是什么原因造成的？4. 影响高效液相色谱扩展的其它因素影响高效液相色谱扩展的其它因素一、分配色谱一、分配色谱 原理：原理： 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同

6、的分配系数。具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。现分离的过程。2. 流动相流动相: HPLC分析中，为防止固定相的流失，分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。 正相分配色谱正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小的先：流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离。流出，适于极性组分分离。1. 反相分

7、配色谱反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大的先：流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离。流出，适于非极性组分分离。固定相极性小固定相极性小 如硅胶如硅胶-C18，硅胶硅胶-苯基；苯基； 流动相极性大流动相极性大 甲醇甲醇-水、乙腈水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲液。水、水和无机盐的缓冲液。 反相键合色谱法反相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于多环芳烃多用于多环芳烃(PAHs)等低极性化合物分离；改变流等低极性化合物分离；改变流动相配比，动相配比，也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离解的化合物，如有机解的化合物，如有机有机酸、有

8、机酸、有有机机碱和酚碱和酚类类。 固定相极性固定相极性大大 硅胶硅胶-OH(或双或双-OH)，硅胶硅胶-CN 流动相极性流动相极性小小 烃类烃类+适量极性溶剂适量极性溶剂(CHCl3，CH3OH，CH3CN) 正正相键合色谱法相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于极性或中等极性化合物的分离。多用于极性或中等极性化合物的分离。还可用于分离还可用于分离异构体、异构体、极性不同的化合物以及不同类型的化合物。极性不同的化合物以及不同类型的化合物。 正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k增加。增加。 在在HPLC分析中，有时要在流动相中加入适量的盐分析

9、中，有时要在流动相中加入适量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐碳酸铵、四烷基铵盐)或酸，为什么？或酸，为什么？ 答：都是为了防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表答：都是为了防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在面的残留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。柱内分离。反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。3. 固定相固定相 常用的固定液只有几种，按极性由高到低为：常用的固定液只有几种，按极性由高到低为： , -氧二丙腈氧二丙腈(ODPN)、

10、聚乙二醇、聚乙二醇(PEM)、三甲撑二醇、三甲撑二醇(TMG)、十八烷、十八烷(C18)、角鲨烷角鲨烷(SQ)。 1）机械涂渍固定相：）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型多孔型(0.5-1.5%涂布量涂布量)或全多孔型载体或全多孔型载体(5-10%涂布量涂布量)上形成的上形成的液液色谱固定相。液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离 稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。 为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的为减少固定液的流失，通常在柱前加一根

11、很短的前置柱前置柱，该，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。柱之前，预先被固定液饱和。2）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。 这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决

12、定哪种机理起主要作用。而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。对多数键合相来说，以分配机理为主。 通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。此只适于以不含水或醇的流动相。Si-R(或或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使用水溶液作流动相时，其便。使用水溶液作流

13、动相时，其pH应在应在4-8之间。之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。范围内对水稳定。HClSiROSiiClSROHSi)(RSiClSiOHSi)(ROSiOHROHSi)(33RMgClRLiSOClSOCl22 硅硅烷烷化化方方法法三三先先氯氯化化方方法法二二硅硅酯酯化化方方法法一一或或三、离子交换色谱三、离子交换色谱 既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。核酸等。1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能原理：利用不同待测离子对固定相

14、的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应： 对阳离子对阳离子，滞留顺序为：，滞留顺序为： Fe3+, Ba2+, Pb2+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, UO22+, Tl+, Ag+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+, H+, Li+ 对阴离子对阴离子，滞留顺序为：，滞留顺序为：柠檬酸根柠檬酸根, SO42-, C2O4, I-, HSO4-

15、, NO3-, CrO42-, Br-, SCN-, Cl-, HCOO-, CH3COO-, OH-, F- ClXNRRXClNR-R:HMSORMHSO-R:33-3-3阴离子交换阴离子交换阳离子交换阳离子交换2. 固定相固定相 按离子交换剂类型分四种：按离子交换剂类型分四种： 按固定相制作方法可分为：按固定相制作方法可分为： 多孔型离子交换树脂多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；包括薄膜型）离子交换树脂； 离子交换键合型。离子交换键合型。 类型类型 官官能能团团 强强阳阳离离子子交换交换剂剂 -SO3- 阳阳离离

16、子子交换交换剂剂 弱弱阳阳离离子子交换交换剂剂 -CO2- 强强阴阴离离子子交换交换剂剂 -NR3+ 阴阴离离子子交换交换剂剂 弱弱阴阴离离子子交换交换剂剂 -NH2+ 1）多孔型：多孔型： 聚苯乙烯聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多大孔型。交换基团多交换容量大，稳交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。度慢。2）表面多孔型：）表面多孔型： 薄膜型薄膜型=惰性核惰性核+树脂薄层树脂薄层(1-2 m) 多孔型多孔型=惰性核惰性核+硅胶微球硅胶微球+树脂薄层。树脂薄层。 克服了多孔型离子交换树脂的不足，但

17、克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。交换容量低，柱子易超负荷。3）离子交换键合相：利用化学反应将离）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。高柱效的柱子。微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆离子交换剂硅胶层涂覆3. 流动相流动相 离子交换色谱流动

18、相为盐类缓冲溶液离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定有一定pH和离子强度。和离子强度。pH值：值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度离子强度I：对保留值的影响比对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对总浓度控制。增加

19、外加阴或阳离子将增加它们对R+或或R-的竞争能的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子配离子L：当大量当大量L、组分、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：随流动相进入柱后，发生配位剂交换：R

20、M-L+X RM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类。该法用于分离各种氨基酸或碱类。四、离子色谱四、离子色谱 离子色谱离子色谱(IC) 分离原理与离子交换色谱原理一样，分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出只是流出的各种离子用电导检测器检测。的各种离子用电导检测器检测。 存在的问题：存在的问题：由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。 抑制型离子色谱：抑制型离子色谱：在离子交换柱之后，再串结一根在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱抑制柱。该柱装填

21、与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。五、离子对色谱法（五、离子对色谱法（IPC） 分离强极性有机酸和有机碱。分离强极性有机酸和有机碱。 1. 原理：将与待测物离子原理：将与待测物离子A电荷相反的离子电荷相反的离子B（称为对离（称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子子或反离子）加入到流动相中，使待测离子A与对

22、离子与对离子B形成形成离子对离子对AB，该，该AB离子对离子对的性质与的性质与A离子离子或或B离子离子的性质不同，的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。即间接改变了待测离子的保留特性。 例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子相中加入与待测离子A-有相反电荷的离子有相反电荷的离子B+： 有有机机相相水水相相水水相相BABA六、尺寸排阻色谱法六、尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱又称凝胶尺寸排阻色谱又称凝胶(渗透渗透)色谱，主要用于大分子的分离。色谱，主要用于大分子的分离。1. 分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它

23、类似于分子筛，但孔分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小(分子量大小分子量大小)先后从先后从柱中流出。柱中流出。2. 固定相固定相3. 流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶润湿凝胶)、粘度小、粘度小(增加增

24、加扩散速度扩散速度)。 类型类型 材料材料 型号型号 特点特点 流动相流动相 葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶 Sephadax 水水 软性凝胶软性凝胶 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶胀溶胀,小分小分子分离子分离 有机溶剂有机溶剂 聚苯乙烯聚苯乙烯 Styragel 有机溶剂有机溶剂 半刚性凝胶半刚性凝胶 聚乙酸酯聚乙酸酯 Emgel(OR) 溶胀溶胀较小较小流速较小流速较小 有机溶剂有机溶剂 玻璃珠玻璃珠 CPG-10 有机溶剂和水有机溶剂和水 刚性凝胶刚性凝胶 多孔硅胶多孔硅胶 Porasil 刚性大、刚性大、高高流速分离流速分离 有机溶剂和水有机溶剂和水 七、亲合色谱七、亲合色谱 主要用

25、于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。选择性分离及纯化的方法。分离原理：分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称为间隔臂），然后再连接上配基，如酶、抗原或联氨（称为间隔臂），然后再连接上配基，如酶、抗原或激素。激素。 当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲合力特性的生物大分子与配基相互作用基时，其中具有亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相而被保留，无此

26、作用的则被洗出；随后，改变流动相pH或或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。特点：特点：选择性过滤、纯化效果好。选择性过滤、纯化效果好。1.1.液液- -液分配、液分配、化学键合化学键合及离子对分离色谱的固定相及离子对分离色谱的固定相微孔型微孔型 大孔型大孔型薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆离子交换剂硅胶层涂覆 2.2.液液- -固吸附分离固定相固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型

27、；结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：粒度：510 m； 3.3.离子交换色谱分离固定相离子交换色谱分离固定相结构类别：结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相树脂类别：树脂类别：（1）阳离子交换树脂）阳离子交换树脂 (强酸性、弱酸性强酸性、弱酸性)（2）阴离子交换树脂）阴离子交换树脂 (强碱性、弱碱性强碱性、弱碱性) 4. 4. 空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1）软性凝胶）软性凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半）半刚性刚性凝胶凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非

28、极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）刚性刚性凝胶凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。 1. 1. 流动相特性流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）流动相的极性小于固定相的极性，为正相色谱法，）流动相的极性小于固定相的极性，为正相色谱法，极性柱也称正相柱。极性柱也称正相柱。 （3）流动相的极性大于固定液的极性，为反相色谱法，）流动相的极性大于固

29、定液的极性，为反相色谱法，非极性柱也称为反相柱。非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 2.流动相类别流动相类别按流动相组成分：按流动相组成分：单组分和多组分；单组分和多组分；按极性分：按极性分：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；按使用方式分：按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：常用溶剂：甲醇、乙腈、水、乙酸乙酯、四氯化碳、己烷等甲醇、乙腈、水、乙酸乙酯、四氯化碳、己烷等 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，

30、以改进分离或调整出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。3. 3. 流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序： 水水(最大最大) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧二氧六环六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿

31、氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)4. 4. 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题 （1）尽量使用）尽量使用高纯度试剂高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度试样在流动相中应有适宜的溶解度，

32、防止产生沉淀并，防止产生沉淀并在柱中沉积。在柱中沉积。 （4）溶剂的黏度小些为好。溶剂的黏度小些为好。 （5）流动相同时还应满足检测器的要求流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。器时，流动相不应有紫外吸收。 HPLC仪器包括：仪器包括： 高压输液装置高压输液装置; 进样系统进样系统; 分离系统分离系统; 检测系统检测系统; 此外还配有梯度淋此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处洗、自动进样和数据处理装置。理装置。 其工作过程如图所示。其工作过程如图所示。自学提纲1. 高压输液系统高压输液系统1）贮液器：）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器

33、的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金合金)，其孔很约，其孔很约2 m，可防，可防止颗粒物进入泵内。止颗粒物进入泵内。2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。3）高压泵：）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。输液泵种类：恒压型和恒流型。 恒压泵恒压泵(类似于风箱类似于风箱)可迅

34、速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。物）变化而变化，现已较少使用。 恒流型恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复见下图。每分钟往复25100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，

35、此时可连接一脉次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器动阻尼器)。马达马达往复式拉动往复式拉动密封密封溶剂溶剂球阀球阀脉动阻脉动阻尼器尼器到色谱柱到色谱柱机械往复柱塞泵示意图机械往复柱塞泵示意图4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。泵，调节各自的流量

36、，在高压下混合。2. 进样系统进样系统 与与GC相比，相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。死体积。进样装置包括两种。1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。积小。但进样量小且重现性差。2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由）高压

37、进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。动 画3. 色谱柱色谱柱1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为柱长多为1030cm，内径为，内径为45mm(尺寸排阻色谱柱常大于尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱，制备色谱柱内径更大内径更大)；2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：平衡密度法：非平衡密度法：非平衡

38、密度法： 填充方法：填充方法： 填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快充速度快(防凝聚、沉降或结块防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入、且无空气进入(影响填充均匀性影响填充均匀性)。常用分离柱常用分离柱4. 检测器检测器 液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。射、示差折光和安培检测器等。1）紫外检测器）紫外检测器

39、 其检测原理和其检测原理和UV-Vis方法一样。只是方法一样。只是此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为其光程为2-10mm, 体积约为体积约为110 L。 HPLC分析中，约有分析中，约有80%的物质可以在的物质可以在254 nm或或280nm处产生紫外吸收。因此该处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。类检测器应用很广。 在选择测量波长时注意：溶剂必须能在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。溶剂的最低使用波长。石英窗石英窗接色谱柱接色谱柱UV光电倍增管光电倍增管废

40、液废液波长波长可的松可的松氟美松氟美松皮质酮皮质酮快速扫描快速扫描光电二极管阵列（光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱）检测所获得的三维色谱-光谱图光谱图2）荧光检测器）荧光检测器 许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高检测器高23个数量级。个数量级。3）示差折光检测器）示差折光检测器原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二溶剂相，利用二者对光的折射率

41、不同，其中一束（通常是通过样品者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。记录，该信号代表样品的浓度。 为通用型检测器，灵敏度为为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。不适于梯度淋洗。4）安培检测器）安培检测器(ampere detector) 由恒电位仪和一薄层反应池由恒电位仪和一薄层反应池（体积为（体积为15 L）组成。）组成。 该检测器是利用待测物流入该检测器是利用

42、待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。度成正比。 采用安培检测器时，流动相采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物检测器只能检测具有电活性的物质。质。接参比电极接参比电极和对电极和对电极接色谱柱接色谱柱Teflon塑料块塑料块1 cm工作电极工作电极(Pt, Au, 碳糊碳糊)5）电导检测器）电导检测器 电导检测器主要用

43、于离子色谱的检测。电导检测器主要用于离子色谱的检测。 其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH7时，该检测器不够灵敏。时，该检测器不够灵敏。 其它检测器还包括：其它检测器还包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector(光散射光散射

44、)、极谱等。、极谱等。一、相对分子质量一、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在对于相对分子质量较低（一般在200以下）、挥发性以下）、挥发性比较好、加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进比较好、加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在行分析。相对分子质量在200 2000的化合物，可用液固的化合物，可用液固吸附、液吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则，则4-8 HPLC的应用的应用 1. 1. 环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶固定相：薄壳型硅胶(37 50

45、 m) 流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径) 检测器：示差折光检测器检测器：示差折光检测器 可对水果、蔬菜中的农可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。药残留量进行分析。2. 2. 稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质。稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水100%甲醇线性梯度淋洗，甲醇线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫

46、外检测器4-9 制备型液相色谱仪制备型液相色谱仪 preparative liquid chromatography 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 半制备柱半制备柱(内径内径8mm，长度，长度1530cm)，一次制备量，一次制备量.1mg。1.1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提

47、高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低降低10%为宜。为宜。2. 液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰使用制备柱，超载提高效率；）可获得良好分离，主峰使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分；）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。分成为主成分（富集）后，再次分离制备。 3. 制备型液相色谱仪制备型液相色谱仪 制备型液相色谱仪：结构与分析型一样，但制备型液相色谱仪：结构与分析型一样，

48、但泵流量大、进泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱：内径制备柱：内径2050mm，柱长，柱长50cm。 一、高效毛细管电泳基本原理一、高效毛细管电泳基本原理 电泳：电泳：电解质溶液中的带电离子在电场力的作用下，以电解质溶液中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为为电泳电泳。 毛细管电泳毛细管电泳：以：以高压高压电场为驱动力，以电场为驱动力，以毛细管毛细管为分离通为分离通道，依据试样中各组分之间道，依据试样中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现

49、淌度和分配行为上的差异而实现分离分离、分析物质的一类液相技术，是经典电泳和现代微柱分、分析物质的一类液相技术，是经典电泳和现代微柱分离的结合。离的结合。4-10 高效毛细管电泳高效毛细管电泳2.高效毛细管电泳技术上的重要突破高效毛细管电泳技术上的重要突破高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了一是采用了0.05mm内径的毛细管内径的毛细管,； 二是采用了高达数千伏的电压。二是采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。效应，使电

50、场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，加， 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。米，特殊柱子可以达到数百万。 所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。），温度影响大。 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。3.电泳现象与电渗流现象电泳现象与电渗流现象电渗流电渗流：石英：

51、石英毛细管在pH3时, 内壁带负电荷与接触的缓冲溶液形成双电层，在高电场的作用下，双电层中的水合阳离子层引起溶液在毛细管内整体向负极方向流动而形成电电渗流。速度V V电渗流电渗流。4. 分离过程分离过程电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。 带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度= =电泳和电渗流两种速度的矢量和。电泳和电渗流两种速度的矢量和。 正离子：正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离

52、子：阴离子：两种效应的运动方向相反，两种效应的运动方向相反，V V电渗流电渗流 V V电泳电泳时时, ,阴离子阴离子在负极最后流出在负极最后流出, ,在这种情况下在这种情况下, ,不但可以按类分离不但可以按类分离, ,除中性粒子除中性粒子外外, ,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。5.分离类型分离类型(1) 毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZE） 最普遍、最基本的一种分离模式。最普遍、最基本的一种分离模式。(2) 毛细管毛细管凝胶凝胶电泳（电泳（CGE） 将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，将聚丙烯酰胺在

53、毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。等。 在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且由于电泳流和电渗流的方向相反，且V V电渗流电渗流V V电泳电泳 ，则带负电，则带负电的胶束以较慢的速

54、度向负极方向移动，中性试样分子在胶束的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。的较牢，流出时间长。用来分离中性物质，扩展了高效毛细用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。管电泳的应用范围。(3) 毛细管毛细管胶束胶束电动色谱（电动色谱（MECC）(4) 毛细管等电聚焦（毛细管等电聚焦（CIEF）(5) 毛细管等速电泳（毛细管等速电泳（CITP） (6) 毛细管电渗色谱（毛细管电渗色谱（CEC）二、主要特点和应用二、主要特点和应用高分辨率：高分辨率：理论

55、理论n n高达数百万块，甚至数千万块；高达数百万块，甚至数千万块；高灵敏度：高灵敏度：可检测出低至可检测出低至1010-21-21 mol/Lmol/L浓度的物质；浓度的物质；高分析速度：高分析速度：可在可在3 3分钟内分离分钟内分离3030种阴离子；种阴离子；1.71.7分钟分离分钟分离1919 种阳离子；种阳离子；4 4分钟可分离分钟可分离1010种蛋白质；种蛋白质；试样用量少试样用量少：仅需几：仅需几nLnL（1010-9-9 L L）的试样；）的试样；操作成本低：操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。分析一个试样仅需几毫升流动液。不足之处：不足之处：进样不够方便。应用范围相对较窄。

56、进样不够方便。应用范围相对较窄。分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。三、仪器设置三、仪器设置一、纸层析和薄层层析分离过程一、纸层析和薄层层析分离过程 纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。将试样点在色将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流

57、动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。时，带动试样向上运动。纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用二、操作技术二、操作技术1. 层析纸和层析板层析纸和层析板 特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200250目）均目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。

58、干燥后即可使用）。干燥后即可使用。2. 展开剂展开剂由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离氨基酸由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。3. 点样点样用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于样点的直径一般应小于5mm5mm。 4.显色、检测显色、检测 有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有

59、喷洒显色剂、碘蒸气熏或组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。氨水熏等。三、特点及应用三、特点及应用1 1、平板色谱、平板色谱简单、方便简单、方便、及操作、及操作费用低费用低；2 2、可以在一块层析板上、可以在一块层析板上同时展开同时展开多个试样及将多条滤纸同多个试样及将多条滤纸同时展开；时展开；3 3、采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般、采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离改善分离效果效果； 4 4、试样一般、试样一般不需要经过预处理不需要经过预

60、处理即可分离。即可分离。缺点缺点： 分离效率较低分离效率较低，不适用挥发性试样分离不适用挥发性试样分离。定性定量不定性定量不便便。应用应用：平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物：平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作为高效液相色谱的一种预试方法。为高效液相色谱的一种预试方法。 1、在、在LC中，提高色谱柱的柱效率最有效的途径是中，提高色谱柱的柱效率最有效的途径是_ A.