碱裂解法提取质粒

1、.1 碱裂解法提取质粒DNA.2 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及操作。一、实验目的一、实验目的.3质粒(Plasmid) ：质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。二、实验原理二、实验原理.4.5质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，具有以下特点： 易于鉴定；易于鉴定； 在受体细胞中可以独立复制；在受体细胞中可以独立复制；

2、易于筛选；易于筛选； 易于导入受体细胞。易于导入受体细胞。 .6二、实验原理二、实验原理高碱高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放细菌的细胞壁破裂，内容物释放染色体染色体DNADNA断裂成不同长度的线性双链断裂成不同长度的线性双链DNADNA；线性双链线性双链DNADNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。片段中的氢键断裂，双链解离变性。质粒质粒DNADNA不发生断裂，保持双链闭合环状；不发生断裂，保持双链闭合环状；双链双链DNADNA并不完全分离。并不完全分离。高酸高酸中和中和至中至中性性变性的染色体变性的染色体DNADNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶

3、性沉淀物成网络状大分子不溶性沉淀物质粒质粒DNADNA又恢复天然构型，溶解在上清液中又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化纯化RNARNA酶消化除去酶消化除去RNARNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质，并用酚抽提法除去残留的蛋白质.7 SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中

4、，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可 将 质 粒 D N A 从 细 菌 中 提 取 出 来 。.8三、主要试剂及作用三、主要试剂及作用溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成组成 (保护、缓冲保护、缓冲)葡萄糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的减少抽提过程中的 机械剪机械剪切作用切作用,防止破坏质粒防止破坏质粒 (保护作用保护作用)EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止防止DNA酶对质酶对质粒分子的降解作用（保护作用）粒分子的降解作用（保护作用）Tris-HCl 使

5、溶菌液维持溶菌作用的最适使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）范围（缓冲作用）8.9 溶液溶液II：由：由SDS（十二烷基硫酸钠）与（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成组成(裂解、变性裂解、变性)SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）解细胞和蛋白质变性作用）NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性分子变性（DNA变性作用）变性作用）9.10溶液溶液III：HAc和和 KAc组成的高盐溶液组成的高盐溶液 (复性，分离复性，分离) HAc溶液溶液能中和溶液能中和溶液的

6、碱性，使染色体的碱性，使染色体DNA 变性而变性而发生缠绕，并使质粒发生缠绕，并使质粒DNA复性。复性。KAc会与会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质也会与蛋白质-SDS复合物缠复合物缠绕成大分子而与小分子质粒绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。分离。.11四、试剂配制四、试剂配制 溶液溶液：50mM葡萄糖，葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。 1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄

7、糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min ，贮存于4。 溶液溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 3. 溶液溶液：醋酸钾（：醋酸钾（KAc）缓冲液，）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存备用。.124. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in

8、2高压湿热灭菌20min，4保存备用。 5. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 6. 乙醇（无水乙醇、70%乙醇） 7. 5TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na22H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4保存备用。 8. RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20。 .13实实验验步步骤骤加加1.5ml1.5ml培养物于培养物于EPEP管，管，12000g12000g30S30S 除去上清，加入冰的除去上清，

9、加入冰的200 200 l l 溶液溶液I I，剧烈振荡，剧烈振荡EPEP管，室温管，室温3min3min 加入加入300300l l 溶液溶液IIII，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴3min3min 加入加入400400l l 冰冰溶液溶液IIIIII，温和振荡，温和振荡10s10s，冰浴，冰浴5min5min，12000g12000g5min5min转移上清到新转移上清到新EPEP管，加入等体积管，加入等体积酚酚/ /氯仿氯仿(1:1)(1:1)，温和振荡，冰浴，温和振荡，冰浴3min3min，12000g12000g5min5min 上层水相转移到新上层水相转移到新EPEP管管，加入，加入2 2倍体积倍体积无水乙醇无水乙醇，颠倒混匀，颠倒混匀，-20 -20 冰箱中放置冰箱中放置15min15min，12000g12000g 10min10min 弃上清，沉淀中