医学生物学设计性探索实验

1、第一页，共26页。第二页，共26页。什么是生物大分子？什么是生物大分子？ 生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的有机分子。常见的生物大分子包括包括核酸、蛋白质和多糖等。 生物大分子的特点在于其表现出的各种生物活性和在生物新陈代谢中的作用。生物大分子是构成生命的基础物质。第三页，共26页。整个过程可分为五个步骤 材料的选择 细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离） 提取 分离纯化（包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等） 鉴定（SDS一聚丙烯酞胺凝脉电泳法）第四页，共26页。 一 生物大分子生物大分子材料材料 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 材料的来源是动物

2、、植物和微生物及其代谢产物。 选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。 植物要先去壳、除脂。 第五页，共26页。二二 细胞的破碎细胞的破碎 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。第六页，共26页。 细胞破碎的常用方法 (1)机械法：研磨，组织捣碎器。 (2)物理法： 反复冻融法

3、，超声波 处理法， 压榨法， 冷热交替法 (3)化学与生物化学方法：自溶法， 溶胀法， 酶解法 ， 有机溶剂处理法第七页，共26页。细胞器的分离细胞器的分离 制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离。 细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。细胞器的分离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理盐水。因它容易使亚细胞颗粒发生聚集作用结成块状，沉淀分离效果不理想，现一般改用蔗糖、Ficoll（一种蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚

4、乙二醇等高分子溶液。第八页，共26页。三三 生物大分子的提取生物大分子的提取 可分为水溶液提取和有机溶剂提取可分为水溶液提取和有机溶剂提取 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。 极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂； 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； 温度升高，溶解度加大； 远离等电点的pH值，溶解度增加。 第九页，共26页。水溶液提取水溶液提取 大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。 盐浓度，PH值，温度对生物大分子的提取也有

5、一定影响。 此外提取酶时加入底物或辅酶，改变酶分子表面电荷分布，也能促进提取效果。第十页，共26页。有机溶剂提取 一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。 胰岛素既能溶于稀酸、稀碱又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以6070%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏，同时也达到大量除去杂蛋白的目的。第十一页，共26页。四四 生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化 由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手

6、段是相同的。 第十二页，共26页。分离纯化方法分离纯化方法 1、根据蛋白质溶解度不同的分离方法 2、根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 3、根据蛋白质带电性质进行分离 4、根据配体特异性的分离方法亲和层析法第十三页，共26页。1根据蛋白质溶解度不同的分离方法第十四页，共26页。2根据蛋白质分子大小的差别分离 （)透析与超滤透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分子分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同相对分子质量的蛋白质。 （)凝胶过滤法也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一

7、。柱中最常用的填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶第十五页，共26页。3、根据蛋白质带电性质进行分离 电泳法； 不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。 离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变或离子强度的办法将吸附的蛋白质洗脱下来第十六页，共26页。 4亲和层析的分离原理亲和层析的分离原理 简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行

8、分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。第十七页，共26页。 由于混合物中各组分所带电荷性质、数量及分子量由于混合物中各组分所带电荷性质、数量及分子量不同，因此不同，因此, , 在同一电场的作用下，各组分泳动的方在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度各异，导致在一定时间内，各组分移动距离向和速度各异，导致在一定时间内，各组分移动距离的不同，从而使各组分得以被分离。的不同，从而使各组分得以被分离。五五 产物的鉴定产物的鉴定最后，对分离最后，对分离产物进行浓缩，干燥和保存产物进行浓缩，干燥和保存第十八页，共26页。二 肝酶的分离、提

9、取、纯化与鉴定 从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶（该酶由三种不同的亚基组成，为结合酶，pI=6.2）的技术路线。并说明实验步骤原理。第十九页，共26页。3.蛋白的纯化蛋白的纯化2酶蛋白的粗提酶蛋白的粗提1 1脱脂肝粉制备脱脂肝粉制备 实验步骤实验步骤 4.凝胶电泳鉴定纯度凝胶电泳鉴定纯度第二十页，共26页。1 1脱脂肝粉制备脱脂肝粉制备 将新鲜动物肝脏切成碎块、搅碎、充分匀浆，然后加入丙酮后离心，收集沉淀，干燥。然后将肝粉颗粒研磨、过筛、收集细粉，加入三氯甲烷充分搅拌，抽滤，重复两次，收集滤饼、干燥。 第二十一页，共26页。2酶蛋白的粗提酶蛋白的粗提 将肝粉用氨水溶液恒温抽提两次，合

10、并滤液。将所得水溶液用乙酸溶液酸化、离心，收集上清液。然后调PH至中性，用硫酸铵初次盐析、离心、收集上清，再次盐析、收集沉淀，得酯酶粗品。第二十二页，共26页。 许多蛋白质在其等电点（pI）处净电荷为零，溶解度最低，可以沉淀出来。故选用适当的缓冲液，调节pH，可将目的物以沉淀状态分离，再重新溶于适当的缓冲液，以供进一步纯化。3 蛋白质的纯化等电点沉淀技术第二十三页，共26页。4.凝胶电泳鉴定纯度凝胶电泳鉴定纯度 SDS(SDS(十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠: :阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂）能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远超过其本身原有的电白质带负电荷的量远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋