分子细胞生物学作业

1、分子细胞生物学1 简述表达调控的基本概念和真核基因表达调控的特点（10分）。2 简述转录后水平的基因沉默现象、基因表达调控的新途径及其应用现状（10分）。3 请你简述细胞分化，干细胞发展现状，如何理解认识现状与应用关系（10分）？4 请叙述细胞周期内容与细胞周期调控实验的基本原理，请你设计一种有关细胞周期调控的实验（10分）。5 细胞信号理论与实践的应用现状，从你所理解的几种细胞信号通路，谈谈验证实验设计及其依据原理（10分）。6 由基因选择性表达结果与细胞分化关系，生物的表观遗传的关系（10分）。7 细胞凋亡及其信号转导关系说明细胞凋亡须具备必要的基本元件，请举一列叙述说明（10分）。8 如

2、何理解真核细胞基因表达调控的复杂性（10分）？9 根据你所从事的研究方向，探讨与分子细胞生物学的关系及应用（20分）1. 简述表达调控的基本概念和真核基因表达调控的特点（10分）。答：基因表达调控：指位于基因组内的基因如何被表达成为有功能的蛋白质(或RNA)，在什么组织中表达，什么时候表达，表达多少等等。在内、外环境因子作用下，基因表达在多层次受多种因子调控。基因表达调控的异常是造成突变和疾患的重要原因。真核基因表达调控的特点：（1）转录水平的调控。Britten和Davidson于1969年提出的真核生物单拷贝基因转录调控的模型BrittenDavidson模型。该模型认为在整合基因的5端连

3、接着一段具有高度专一性的DNA序列，称之为传感基因。在传感基因上有该基因编码的传感蛋白。外来信号分子和传感蛋白结合相互作用形成复合物。该复合物作用于和它相邻的综合基因组，亦称受体基因，而转录产生mRNA，后者翻译成激活蛋白。真核生物基因组中等重复DNA序列和单拷贝DNA序列的排布形式，说明该模型有其合理型。（2）染色质结构对转录调控的影响。真核基因的活跃转录是在常染色质进行的。转录发生之前，常染色质往往在特定区域被解旋或松弛，形成自由DNA，这种变化可能包括核小体结构的消除或改变，DNA本身局部结构的变化，如双螺旋的局部去超螺旋或松弛、DNA从右旋变为左旋，这些变化可导致结构基因暴露，RNA聚

4、合酶能够发生作用，促进了这些转录因子与启动区DNA的结合，导致基因转录，实验证明，这些活跃的DNA首先释放出两种非组蛋白，（这两种非组蛋白与染色质结合较松弛），非组蛋白是造成活跃表达基因对核酸酶高度敏感的因素之一。（3）转录后水平的调控。真核生物基因转录在细胞核内进行，而翻译则在细胞质中进行。在转录过程中真核基因有插入序列，结构基因被分割成不同的片段，因此转录后的基因调控是真核生物基因表达调控的一个重要方面，首要的是RNA的加工、成熟。各种基因转录产物RNA，无论rRNA、tRNA还是mRNA，必须经过转录后的加工才能成为有活性的分子。（4）翻译水平上的调控。蛋白质合成翻译阶段的基因调控有三个

5、方面： 蛋白质合成起始速率的调控； MRNA的识别； 激素等外界因素的影响。蛋白质合成起始反应中要涉及到核糖体、mRNA蛋白质合成起始因子可溶性蛋白及tRNA，这些结构和谐统一才能完成蛋白质的生物合成。2. 简述转录后水平的基因沉默现象、基因表达调控的新途径及其应用现状（10分）。答：转录后水平的基因沉默(Posttranscriptional Gene Silencing，PTGS)是指转基因在细胞核里能稳定转录，细胞质里却无相应的稳定态mRNA存在的现象。不同研究组给了这一神秘机制不同的名称：植物学家称之为共抑制(co-suppression)、菌类学家称之为静息作用(quelling)、

6、昆虫学家称之为RNA干预(RNA interference，RNAi)等。PTGS是1条在mRNA水平上使特定基因沉默的新的细胞途径。该途径可帮助生物体抵御病毒感染和基因损伤。PTGS被认为是一种古老的自我防御的进化机制。大量工作揭示了它是通过降解mRNA来阻止基因表达的。当细胞受到某种危险,如病毒侵袭或转座子的活化。这一机制就被宿主细胞内双链RNA或某些其它不正常核苷酸所启动。细胞指导RNA裂解酶(核糖核酸酶)特异地降解与诱因相关的RNA，而不影响其它基因。基因表达调控的新途径及其应用现状：基因沉默是一种非常有用的研究工具。PTGS比在基因编码区加入选择标记的基因敲除技术更优越。它可以用于生

7、物不同的发育阶段加以选择。而通常敲除1个基因可能在还未知道该基因功能时会杀死该胚胎。即使该胚胎能够成活，在发育早期阶段，不正常的导入会掩饰该基因在较晚时期的次级效应。利用PTGS，生物学家能关闭某种特定的生物基因，以此来推断该基因的功能。利用PTGS让生物胚胎发育的不同阶段的某些基因沉默，可揭示胚胎发育复杂性。在线虫中，利用RNAi调查细胞分裂宿主基因的功能。RNAi的触发较为简单，它可通过向成虫中注入双链RNA，把线虫浸泡在核苷酸中或用产生合适双链RNA的大肠杆菌工程菌来喂养线虫实现。Pittsburgh等用RNAi沉默了至少20个果蝇基因，包括frizzled2和wingless。Hann

8、on等期望在果蝇细胞培养中用RNAi来研究癌生物学。共抑制技术在植物中已经得到广泛应用。PTGS可作为一种植物抵御病毒感染的方式。原来,当病毒侵袭植物细胞时，细胞就会使病毒复制和传播所需的基因沉默。这种沉默可以由植物病毒在生命周期的某些阶段产生的双链RNA引发。Guy等利用共抑制技术试图揭示模式作物拟南芥单个基因的功能。采用烟草花叶病毒导入数以千计的不同遗传序列,研究者们有目的地让基因沉默来寻找期望的特性,如抗病或耐旱。除了作为实验室工具外，共抑制也被用于商业生产上。脊椎动物对RNA病毒和转座子的袭击有很强的防御能力。特别是它们拥有蛋白酶R在双链RNA出现时,能关闭细胞蛋白质合成的途径，有时驱

9、使细胞自杀。Wianny等指出可通过向老鼠早期胚胎或在8细胞或16细胞时期注入双链RNA而诱导RNAi阻止相应基因的表达。3. 请你简述细胞分化，干细胞发展现状，如何理解认识现状与应用关系（10分）？答：细胞分化：在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态结构和生理功能上发生稳定性的差异的过程称为细胞分化（cellular differentiation）。细胞分化是一种持久性的变化，细胞分化不仅发生在胚胎发育中，而是生物的一生都在进行着，以补充衰老和死亡、凋亡、损伤的细胞如：多能造血干细胞能分化为不同类型的血细胞过程。一般来说，已分化的细胞如果没有外界的影响将一直保持分化后的状态，

10、直到死亡为止。干细胞发展现状：干细胞是一类具有自我复制和分化能力的细胞，其发育受多种内在机制和微环境因素的影响，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。自20世纪60年代发现造血干细胞至今为止，造血干细胞是研究最多并最先用于治疗的干细胞，它使人们对于干细胞的特点有了进一步的了解。近年来随着生物细胞实验技术的发展，该领域取得了突破性进展，已广泛深入地开展了用来治疗多种疾病的“干细胞生物工程”。现状与应用关系：在组织修复中的应用，如果用健康的细胞替代变性后的细胞则可治愈由特异性细胞缺失或特异性细胞的功能缺失所引起的疾病。胚胎干细胞源性的神经元移植后可改善帕金森小鼠的功能状态。在新药的发现和筛选中的应用，干细

11、胞提供了新药的药理、药效、毒理及药代等细胞水平的研究手段和生物学模型，利用干细胞技术，无疑会加快新药发现、筛选和开发，大大减少了药物实验所需动物的数量。同时，干细胞还可以用来研究疾病的发生机制和发展过程，帮助寻找有效和持久的治疗方法和药物。在癌症治疗中的应用，成体干细胞与癌细胞有一定的相似性。两者均可自我增殖：成体干细胞以高度有序性进行增殖，而癌细胞以一种难以控制的速度在增殖。两者均可分化：成体干细胞可分化成正常、成熟的体细胞，而癌细胞则经常是异常性的分化。因此，我们可能应用干细胞生物学原则来治疗癌症。在临床移植学中的应用，不依赖人工器官或他人提供的器官，凭籍本人拥有的自然治愈能力让已经丧失机

12、能的器官再生，这是最理想的。成体干细胞在体外可诱导分化为多种类型的细胞、组织，而且又完全是自身的遗传背景，不受细胞来源和移植免疫排斥的限制，更易用于临床。4. 请叙述细胞周期内容与细胞周期调控实验的基本原理，请你设计一种有关细胞周期调控的实验（10分）。答：细胞周期内容及其原理：生命是从一代向下一代传递的连续过程，因此是一个不断更新、不断从头开始的过程。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂，结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将子细胞形成作为一次细胞分裂结束的标志，细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的过程。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并

13、均等地分配给两个子细胞。细胞是有机体的基本结构单位和功能单位，而细胞周期则是保证细胞进行生命活动的基本过程。细胞周期（cell cycle）分为：合成DNA的时期称为DNA合成期（S期），进行DNA拷贝分配和细胞分裂的时期称为有丝分裂期（M期），在M期结束后和S期开始前的一段间隙称为G1期，而在S期结束后和M期开始前的间隙则称为G2期。真核细胞内有一个调控机构，使细胞周期能有条不紊地依次进行。细胞周期的准确调控对生物的生存、繁殖、发育和遗传均是十分重要的，细胞周期各时相中有各自特异性的细胞周期蛋白控制细胞周期有序地进行。实验方法一：细胞计数法体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示

14、。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。（1）、消化细胞 ，将细胞 悬液接至内含盖玻片的培养皿中。（2）、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。（3）、取出盖片，按下列顺序操作：PBS漂洗3分钟甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟Giemsa液染色10分钟自来水冲洗。（4）、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。（5）、计算：分裂指数=分裂细胞 数/总细胞 数×100%实验方法二：BrdU渗入法细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。

15、从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。（1）、试剂配制BrdU配制：BrdU 10 mg加双蒸水10 ml ，4下避光保存。2

16、5;SSC配制：NaCl 1.75 g，柠檬酸三钠0.88 g，加水至100 ml，4保存。（2）、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10 g/ml。（3）、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1 g。（4）、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清漂浮细胞也要收集到离心管中。（5）、常规染色体制片。（6）、染色体玻片置56水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。（7）、弃去2×SSC液，流水冲洗。（8）、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。（9）、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。（10

17、）、计算：细胞周期（Tc）=48/（M1+2M2+3M3+4M4）/100（小时）5. 细胞信号理论与实践的应用现状，从你所理解的几种细胞信号通路，谈谈验证实验设计及其依据原理（10分）。答：细胞信号指细胞间相互传递信息的相关载体与形式，是抗原（信号分子）和细胞膜上的或者细胞膜内的受体结合的反应。生物细胞所接受的信号既可以使物理信号（光、热、电流），也可以是化学信号，但是在有机体间和细胞间的通讯中最广泛的信号是化学信号。细胞信号转导是指细胞通过胞膜或胞内受体感受信息分子的刺激，经细胞内信号转导系统转换，从而影响细胞生物学功能的过程。水溶性信息分子及前列腺素类（脂溶性）必须首先与胞膜受体结合，启

18、动细胞内信号转导的级联反应，将细胞外的信号跨膜转导至胞内；脂溶性信息分子可进入胞内，与胞浆或核内受体结合，通过改变靶基因的转录活性，诱发细胞特定的应答反应。应用现状：细胞信号传导系统的研究给基础和临床研究指明了方向，针对于细胞信号系统中的某一分子靶的药物的研究给痛苦的患者带来福音。给药物开发找到了极佳的药物标靶的数量，从而大大降低了总成本，同时，它还通过减少用于药物开发的时间来延长药物在专利期满前面市的时间，从而创造额外的利润。1986年上海第二医科大学瑞金医院上海血液研究所在国际上首次使用全反式维甲酸(ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)获得成功，就是一个很好的例证。通过细胞表面受体

19、介导的信号跨膜传递：包括（1）、离子通道偶联的受体介导的信号跨膜传递；（2）、G-蛋白偶联的受体介导的信号跨膜传递；（3）、细胞表面其它与酶偶联的受体。其中，以cAMP为第二信使的信号通路主要效应是通过活化的cAMP依赖的PKA，使下游靶蛋白磷酸化，从而影响细胞代谢和行为，这是细胞快速应答胞外信号的过程。此外，有细胞缓慢应答信号的过程，这就是cAMP信号通路，对细胞基因表达的影响，该信号涉及的反应链是：激素G蛋白偶联受体G蛋白腺苷酸环化酶cAMPcAMP依赖的蛋白激酶A基因调控蛋白基因转录。6. 由基因选择性表达结果与细胞分化关系，生物的表观遗传的关系（10分）。答：细胞分化是基因选择性表达的

20、结果，表现出来的性状就是表观遗传。由于细胞分化发生于生物体的整个生命进程中，所以基因的选择性表达在生命过程各阶段都在体现。不仅如此，基因的选择性表达在单细胞原核、真核生物生长发育中，甚至病毒的生命活动中都明显表现，这充分体现了基因的选择性表达的普遍性。（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代在形态结构和生理功能上发生稳定性的差异的过程，其实质是组织特异性基因在时间和空间上的差异表达。 （2）不同类型的细胞在发育过程中表达一套特异的基因，其中持家基因在所有细胞中均能表达，其产物是维持细胞基本生命活动所必需的。而组织特异性基因，在不同类型细胞中是特异性表达的，其产物赋予各种类

21、型细胞特异的形态结构特征与功能。所以细胞分化是奢侈基因的选择性表达的结果。表观遗传（epigenetics）是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。表观遗传学特点：1.可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂，能够在 细胞或个体世代间遗传。 2.可逆性的基因表达调节 3.没有DNA序列的改变或不能用DNA序列改变来解释。表观遗传学变化主要集中在三大方面：1.DNA甲基化修饰 2.组蛋白修饰 3.非编码RNA的调控作用 这三个方面各自影响特有的表观遗传学现象，而且它们 还相

22、互作用，共同决定复杂的生物学过程。所以，生物的表观遗传，本质是基因选择性表达特性的遗传。7. 细胞凋亡及其信号转导关系说明细胞凋亡须具备必要的基本元件，请举一列叙述说明（10分）。答：细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶类和信号转导途径调控的瀑布式激活过程的影响。研究工作基本在以下三个阶段进行：1、各种凋亡刺激信号，如

23、DNA损伤、病毒感染、生长因子缺乏、Fas/Apo_1配体、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体等的作用启动凋亡；2、由p53基因、Caspases蛋白酶、Fas相关死亡蛋白及TNFR_1相关死亡蛋白等介导的死亡信号转导；3、由Bcl_2蛋白家族、细胞色素C及Caspases蛋白酶三个效应器参与的调控执行阶段，最后导致由内源性核酸酶激活和细胞骨架重新组合所致的细胞结构的解体。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号凋亡调控分子间的相互作用蛋白水解酶的活化（Caspase）进入连续反应过程8. 如何理解真核细胞基因表达调控的复杂性（10分）？答：基因表达调控：从DNA到蛋白质的过程叫基因表达

24、(gene expression)，对这个过程的调节即为基因表达调控(regulation of gene expression or gene control)。真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分（如线粒体DNA等），这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组的中仅约10%的序列是编码蛋白质或rRNA、tRNA等的基因，其余约90%的序列功能至今还不清楚。原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因

25、绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，在转录后经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。基因表达调控主要表现在以下几个方面：转录水平上的调控；mRNA加工、成熟水平上的调控；翻译水平上的调控。首先是基因的表达，和原核生物不同，真核生物的DNA和组蛋白结合，常态下是被拧成的一种短粗的形态，就是染色质，这个时候RNA聚合酶是无法在DNA上正常工作的。通常，真核生物需要调节因子来调节基因的表达，通过解开组蛋白的封闭形态，使RNA聚合酶可以工作。而在原核生物中，由于没有组蛋白，DNA暴露在细胞质中，所以原核生物采用的是负的调控来调节基因的表达，也就是一些分子会阻止RNA聚合酶的工作，或者遮盖住启动子等方法。而原核生物需要快速复制和生长，其基因的内容也很少，所以一般的原核生物的大多数基因都处于表达状态，这也是很适应原核生物繁殖的手段。其次转录后水平的调控。真核生物基因转录在细胞核内进行，而翻译则在细胞质中进行。在转录过程中真核基因有插入序列，结构基因被分割成不同的片段，因此转录后的基因调控是真核生物基因表达调控的一个重要方面，首要的是RNA的加工、成熟。各种基因转录产物RNA，无论rRNA、tRNA还是mRNA，必须经过转录后的加工才能成为有活性的分子。再次