生物信息学论文

1、生物信息学论文学院：生命科学技术学院 专业：生物科学 班级：2013级 老师：高亚梅 学生：王秉政 学号：20134083038黑曲霉GH75及米曲霉GH76-5基因生物信息学分析王秉政（黑龙江八一农垦大学，生命科学技术学院，2013级生物科学专业，黑龙江省，大庆市）【摘要】目的：分析和预测黑曲霉GH75和米曲霉GH76-5基因及其编码蛋白质的结构和特征。方法：利用NCBI、CBS和ExPASy网站中的各种信息分析工具，并结合VectorNTIsuite8.0生物信息分析软件包，分析预测黑曲霉GH75和米曲霉GH76-5基因并预测该基因编码蛋白结构的特征和功能。结果：GH75基因全长174bp

2、,编码区具有57个氨基酸，在GenBank同源序列中，其与Aspergillus niger contig An04c0140, genomic contig基因氨基酸序列一致性达到100%，且有GH75保守域。GH75蛋白相对分子量预测为26257.2，理论等电点为4.69。预测GH75编码蛋白螺旋(H ) 、折叠(E )、无规则卷(L )的比例分别是11.07%、25.41%、63.52%，1个GTPase结构域。GH75蛋白为亲水蛋白，有跨膜区，有信号肽。GH76-5基因全长309bp,编码区具有102个氨基酸，在GenBank同源序列中，其与Aspergillus niger cont

3、ig An14c0130, genomic contig基因氨基酸序列一致性达到100%，且有GH76-5保守域。GH76-5蛋白相对分子量预测为46029.3，理论等电点为5.28。预测GH76-5编码蛋白螺旋(H ) 、折叠(E )、无规则卷(L )的比例分别是26.90%、20.71%、52.38%，2个GTPase结构域。GH76-5蛋白为疏水蛋白，无跨膜区，无信号肽。结论：成功预测GH75和GH76-5基因及其编码蛋白生化及其结构特征，为下一步对其进行克隆和表达奠定基础。【关键词】黑曲霉、米曲霉；糖基水解酶家族（GH75）；糖基水解酶家族（GH76-5）生物信息学 黑曲霉是一种重要工

4、业微生物,在酶制剂、异源蛋白、有机酸等领域应用广泛。2007年黑曲霉基因组的公布将黑曲霉的研究引入后基因组时代,各种组学数据如雨后春笋般涌现,人们对黑曲霉高效生产机制的理解上升到系统、分子层次;与此同时,黑曲霉遗传操作系统也不断成熟,为系统地研究和改造黑曲霉、将黑曲霉打造成通用细胞工厂奠定了基础。 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高

5、营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。1、 资料与方法1.1资料通过ExPASy 数据库的UniProtKB（或/uniprot）获得黑曲霉的GH75与米曲霉GH76-5基因序列。GH75基因编号为4990860.，NCBI的登录号为XM_001401782.1.，其他物种的GH75的氨基酸序列均来自Ge

6、nbank，登录号见图1。GH76-5基因编号为4987208.，NCBI的登录号为XM_001400940.2.，其他物种的GH76-5的氨基酸序列均来自Genbank，登录号见图2。1.2方法利用美国国家生物技术信息中心（NCBI,）的基本局部比对搜索工具（BLAST,/blast/），运用Blastx完成基因同源性分析。应用ORF finder（/gorf/orfig.cgi）寻找其开放读码框，并推导出可编码蛋白序列。利用保守结构域（www.ncbi.nlm

7、./Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析预测其保守域。通过瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASy，）所提供的蛋白组学和分析工具：Protparam程序分析GH75及GH76-5蛋白氨基酸组成、相对分子质量、等电点等基本理化性质；TMHMM程序预测GH75及GH76-5的跨膜区；Proscale程序分析GH75及GH76-5的蛋白性质；SignalP程序预测GH75及GH76-5蛋白的信号肽，GOR超链接分析GH75及GH76-5的二级结构，SWISS-MODEL通过二级结构比对和折叠，模拟蛋白质的空间构象。利用SMART（

8、http:/smart.embl-heidelberg.de/）分析预测其结构域。2、 结果2.1基因序列的分析BLASTx分析结果表明，GH75与多个物种的GH5基因同源，其中与Aspergillus niger contig An04c0140, genomic contig的同源性最高，一致性达100%，相似度达99%（图1）。ORF Finder获得其开放阅读框编码氨基酸序列，该基因全长174bp,编码区为2-174bp，编码57个氨基酸，无起始密码子，终止密码子TAA，不编码蛋白（图3）。CCD分析发现有GH75保守域。BLASTx分析结果表明，GH76-5与多个物种的GH6基因同源

9、，其中与Aspergillus niger contig An14c0130, genomic contig的同源性最高，一致性达100%，相似性达100%（图2）。ORF Finder获得其开放阅读框编码氨基酸序列，该基因全长309bp,编码区为1-308bp，编码102个氨基酸，无起始密码子，终止密码子TGA，不编码蛋白（图4）。CCD分析发现有GH76-5保守域。图1 BLASTx图2 BLASTx图4 ORF Finder图3 ORF Finder2.2编码蛋白的特征分析2.2.1蛋白质的基本参数GH75蛋白相对分子量预测为26257.2，理论等电点为4.69，脂肪系数为75.94。在

10、溶液中的不稳定系数是25.26，为稳定蛋白。当蛋氨酸在N端时，可预测其在哺乳动物网织红细胞（体外）中，半衰期均30小时，在酵母（体内）中，半衰期大于20小时，在大肠杆菌（体内）中，大于10小时。氨基酸的组合物（图5），原子组成（图6）。带负电荷的残基总数13，带正电荷的残基总数27。当蛋白浓度为1g/L，所有的半胱氨酸残基形成半胱氨酸时，吸光指数（ABS）为1.629，在水中280nm摩尔消光指数为42775；所有的半胱氨酸残基不形成半胱氨酸时，吸光指数（ABS）则为 1.615，在水溶液中280nm摩尔消光指数为42400。总的亲水性平均疏水性指数（grand average of hydr

11、opathieity）为-0.204，预测为亲水蛋白。GH76-5蛋白相对分子量预测为46029.3，理论等电点为5.28，脂肪系数为64.67。在溶液中的不稳定系数是27.19，为稳定蛋白。当蛋氨酸在N端时，可预测其在哺乳动物网织红细胞（体外）中，半衰期均30小时，在酵母（体内）中，半衰期大于20小时，在大肠杆菌（体内）中，大于10小时。氨基酸的组合物（图7），原子组成（图8）。带负电荷的残基总数33，带正电荷的残基总数42。当蛋白浓度为1g/L，所有的半胱氨酸残基形成半胱氨酸时，吸光指数（ABS）为 1.970，在水中280nm摩尔消光指数为90675；所有的半胱氨酸残基不形成半胱氨酸时，

12、吸光指数（ABS）则为1.962，在水溶液中280nm摩尔消光指数为90300。总的亲水性平均疏水性指数（grand average of hydropathieity）为-0.323，预测为亲水蛋白。图8 原子组成图7氨基酸组合物图6 原子组成图5 氨基酸组合物物 图32.2.2疏水性分析、跨膜区分析TMHMM预测GH75蛋白，提示有跨膜区，位于膜内（图9）。Proscale分析疏水性，结果也提示GH75为亲水蛋白（图10）。SignalP分析提示GH75有信号肽（图11）。TMHMM预测GH76-5蛋白，提示无跨膜区，位于膜外（图12）。Proscale分析疏水性，结果也提示GH75为疏水

13、蛋白（图13）。SignalP分析提示GH76-5无信号肽（图14）。图9TMHMM图12 TMHMM 图11 SignalP图10Proscale 图14 SignalP图13 Proscale 2.2.3 二三级结构与结构域SMART预测可能存在1个小GTPase结构域（图15），GOR预测GH75编码蛋白二级结构中螺旋（H）、折叠（E）、无规则卷（L）的比例分别为11.07%、25.41%、63.52%，以无规则卷为主（图16）。SWISS-MODEL模拟GH75三维结构，应用vector NTI suite 软件包D molecule viewer显示蛋白质三维结构（图17）。SMAR

14、T预测可能存在2个小GTPase结构域（图18），GOR预测GH76-5编码蛋白二级结构中螺旋（H）、折叠（E）、无规则卷（L）的比例分别为26.90%、20.71%、52.38%，以无规则卷为主（图19）。SWISS-MODEL模拟GH76-5三维结构，应用vector NTI suite 软件包D molecule viewer显示蛋白质三维结构（图20）。图15 SMART 图16 GOR 图17 D molecule viewer 图20 D molecule viewer图18 SMART图19 GOR三、讨论 GH75基因全长174bp,编码区具有57个氨基酸，在GenBank同源

15、序列中，其与Aspergillus niger contig An04c0140, genomic contig基因氨基酸序列一致性达到100%，且有GH75保守域。GH75蛋白相对分子量预测为26257.2，理论等电点为4.69。预测GH75编码蛋白螺旋(H ) 、折叠(E )、无规则卷(L )的比例分别是11.07%、25.41%、63.52%，1个GTPase结构域。GH75蛋白为亲水蛋白，有跨膜区，有信号肽。GH76-5基因全长309bp,编码区具有102个氨基酸，在GenBank同源序列中，其与Aspergillus niger contig An14c0130, genomic c

16、ontig基因氨基酸序列一致性达到100%，且有GH76-5保守域。GH76-5蛋白相对分子量预测为46029.3，理论等电点为5.28。预测GH76-5编码蛋白螺旋(H ) 、折叠(E )、无规则卷(L )的比例分别是26.90%、20.71%、52.38%，2个GTPase结构域。GH76-5蛋白为疏水蛋白，无跨膜区，无信号肽。结论：成功预测GH75和GH76-5基因及其编码蛋白生化及其结构特征，为下一步对其进行克隆和表达奠定基础。木质纤维素是地球上资源最丰富,对环境友好,潜力巨大的可再生资源,通过生物方法对纤维素进行降解转化是纤维素利用的一种绿色环保的方法。但在纤维素的生物转化过程中,纤

17、维素酶的使用占成本的比例较高,也是木质纤维素大规模利用的主要瓶颈之一,因此需要快速、高效地筛选纤维素酶特别是来自极端环境生物的纤维素酶,以寻求酶活高,热稳定性好,能适应极端pH环境的纤维素酶。纤维素酶是多组分酶,包括内切葡聚糖酶,外切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶,纤维素的水解是这三个组分协同作用的结果。其中内切葡聚糖酶作用于纤维素降解的第一步而尤为关键。内切葡聚糖酶最早发现于赐牛的消化液中,之后对来源于真菌和细菌的内切葡聚糖酶进行了深入的研究,且发现内切葡聚糖酶多数来源于细菌。内切葡聚糖酶(EC 3. 2.1.4)又称为接甲基纤维素酶、Q酶等,分子量大小在23-146 kDa之间。内切葡聚糖酶主要作

18、用于纤维素的非结晶区,随机水解卩-1,4-糖苷键,将长链的纤维素截短,对纤维素的整体降解起到了重要作用.所以利用基因工程的方法,通过内切葡聚糖酶与外切葡聚糖酶或葡聚糖苷酶的复配协同作用,可以有效地降解结晶纤维素在纤维素酶系中,内切葡聚糖酶作为首先作用于纤维素的第一个酶而尤为重要。内切葡聚糖酶作为纤维素酶的组分之一,也是典型的模块化酶。纤维素结合域(CBM)通过增加纤维素酶在底物表面的浓度,进而提高酶的活性。自发现纤维素酶以来,纤维素酶得到了广泛的认识和挖掘,也受到很多行业的关注。纤维素酶的用途非常广泛,在食品发酵、动物饲料、造纸业、洗涤工业、制药业和污染处理等各个领域均有应用。此外,内切葡聚糖

19、酶在增加果汁产量,啤酒过滤,石油幵采,洗漆剂工业,改善烘焙产品和动物词料的营养质量方面,扮演着十分重要的角色。根据纤维素酶的作用效果,其应用可以分为两类:一,降解植物细胞壁中的纤维素,释放细胞内的糖、蛋白质或其他功能性物质;二,水解纤维素产生葡萄糖。比较成功的例子是纤维素酶在洗潘剂工业中的应用,R本将碱性的纤维素酶加入洗涤剂中制成了高效洗洚粉剂,获得了巨大的经济效益。近几年来,在畜牧业中,纤维素酶作为被添加到饲料添加剂中以提高动物对饲料的利用率,纤维素酶对草料和青贮的预处理及在谷物脱壳等方面也得到了广泛应用,作用效果明显。而在生物质能的开发利用中,用纤维素酶降解转化是木质纤维素是一种绿色环保的方法,已得到了广泛的认可,但由于纤维素酶的使用成本较高,还有待新的研究发现。参考文献1郭艳梅； 郑平； 孙际宾.黑曲霉作为细胞工厂:知识准备与技术基础, 2010.10.0102赵龙飞，徐亚军.米曲霉的应用研究进展. 中国酿造, 2006(3