细胞生物学思路整理

1、绪论细胞生物学(cell biology)是研究和揭示细胞基本生命活动规律的学科，它从显微、亚显微及分子水平上研究细胞结构与功能，细胞增殖、分化、代谢、运动、衰老、死亡，以及细胞信号转导，细胞基因表达与调控，细胞起源与进化等重大生命过程它是现代生命科学中的重要基础前沿学科之一1. 三个层次 显微水平（Microscopic Structure）：即整体水平。指肉眼看不到而在普通光学显微镜下的可见范围。如：染色体、线粒体、细胞核、核仁等。亚显微水平(Submicroscopic Structure) ： 亦称超微结构(Ultrastructure)，指普通光镜看不到而在电镜或其它工具看到的分子以

2、上的结构。如：内质网膜、核膜、微管、微丝等。分子水平：细胞结构的分子组成，及其在生命活动中的作用。2.生命活动包括：生长、发育、繁殖、遗传、变异、衰老、死亡、代谢、调控、分化等。细胞生物学的主要研究内容 生物膜与细胞器；细胞信号转导；细胞骨架体系；细胞核、染色体及基因表达； 细胞增殖及其调控；细胞分化及干细胞； 细胞死亡；细胞衰老； 细胞工程；细胞的起源与进化1665年，英国的物理学家胡克用自己设计并制造的显微镜观察栎树软木塞切片时发现其中有许多小室， 状如蜂窝， 称为"cellar "，这是人类第一次发现细胞，不过，胡克发现的只是死的细胞壁(图1-1)。胡克的发现对细胞学

3、的建立和发展具有开创性的意义，其后，生物学家就用"cell"一词来描述生物体的基本结构。1674年，荷兰布商列文虎克(Anton van Leeuwenhoek)为了检查布的质量，亲自磨制透镜，装配了高倍显微镜(300倍左右)，并观察到了血细胞、池塘水滴中的原生动物、人类和哺乳类动物的精子，这是人类第一次观察到完整的活细胞。列文虎克把他的观察结果写信报告给了英国皇家学会，得到英国皇家学会的充分肯定，并很快成为世界知名人士。1838年， 德国植物学家施来登(Mathias Schleiden)提出: 尽管植物的不同组织在结构上有着很大的差异，但是植物是由细胞构成的，植物的胚是

4、由单个细胞产生的。 1839年， 德国动物学家施旺(Theodor Schwann)提出了细胞学说的两条最重要的基本原理地球上的生物都是由细胞构成的; 所有的生活细胞在结构上都是类似的。 1855年，德国医生和病理学家魏尔肖(Rudolf Virchow)补充了细胞学说的第三条原理: 所有的细胞都是来自于已有细胞的分裂，即细胞来自于细胞。细胞学说的创立大大推进了人类对生命自然界的认识， 有力地促进了生命科学的进步。恩格斯对细胞学说给予极高的评价，把它与进化论和能量守恒定律并列为19世纪的三大发明。因为细胞学说的提出解决了生命的共同起源， 即生命的同一性问题。现代完整的细胞学说的内容包括3点：

5、1.细胞是生物体的基本结构单位（单细胞生物，一个细胞就是一个个体）； 2.细胞是生物体最基本的代谢功能单位（动、植物的各种细胞具有共同的基本构造、基本特性，按共同规律发育，有共同的生命过程）； 3.细胞只能通过细胞分裂而来。1. 原生质理论的提出 原生质(protoplasm)(普金耶1840，冯·莫尔1846)；原生质理论(舒尔策1861)；原生质体(protoplast) (Hanstein 1880)2. 细胞分裂的研究 直接分裂；有丝分裂；减数分裂(18411886)3. 细胞器的发现 中心体(1883)；线粒体(1894)；高尔基体(1898)细胞学与细胞生物学发展简史 细

6、胞的发现； 细胞学说的建立； 细胞学的经典时期； 实验细胞学时期； 细胞生物学学科的形成与发展细胞的统一性与多样性第一节 细胞的基本特征一、细胞是生命活动的基本单位（一）细胞是构成有机体的基本单位 人体内的细胞大约分为200 多种不同的类型，成年人大约含有1014 个细胞，刚出生的婴儿约由2×1012 个细胞组成；人的大脑 是由1012 个细胞构成的复杂体系（二）细胞是代谢与功能的基本单位有机体一切代谢活动最终要靠各种细胞来完成（三）细胞是有机体生长与发育的基础有机体的生长与发育是依靠细胞的分裂、分化与凋亡来实现的（四）细胞是繁殖的基本单位，是遗传的桥梁l 单细胞生物的繁殖表现为细胞

7、一分为二l 多细胞生物依靠细胞分裂形成特殊形式的生殖细胞孢子或配子l 孢子萌发或配子结合为合子，是下一代生命的开始l 细胞核中的遗传信息指导下一代生命的构建（五）细胞是生命起源的归宿，是生物进化的起点 生命是经过漫长的化学进化，由非生命的物质形成的 含有遗传物质的原始细胞的形成，标志着生命的出现细胞是多层次、非线性与多层面的复杂结构体系 细胞是物质（结构）、能量与信息过程精巧结合的综合体 细胞是高度有序的，具有自组装能力的自组织体系二、细胞的基本共性 相似的化学组成 脂蛋白体系的生物膜 相同的遗传装置 一分为二的分裂方式第二节 原核细胞与古核细胞整个生物界最基本的类群包括3个域：原核生物、古核

8、生物和真核生物一、原核细胞 没有典型核结构 包括支原体、衣原体、立克次氏体、细菌、放线菌与蓝藻等 大部分原核细胞主要遗传物质仅为一个环状DNA 细胞内没有以膜为基础的各种细胞器，也没有细胞核膜 细胞体积一般很小，直径由0.2 至 10 m 不等（衣原体（Chlamydia）是一类能通过细菌滤器，在细胞内寄生，有独特发育周期的原核细胞性微生物。过去认为是病毒，现归属细菌范畴。衣原体广泛寄生于人类、鸟类及哺乳动物。能引起人类疾病的有沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热肺炎衣原体。立克次氏体（Rickettsia）为革兰氏阴性菌，是一类专性寄生于真核细胞内的G-原核生物。是介于细菌与病毒之间，而接近于细菌

9、的一类原核生物。一般呈球状或杆状,是专性细胞内寄生物，主要寄生于节肢动物，有的会通过蚤、虱、蜱、螨传入人体、如斑疹伤寒、战壕热。放线菌是一群革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% ) 的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。形态上与真菌相似的原核生物。抗生素的主要来源。）二、最小最简单的细胞支原体 最简单的原核细胞，直径为0.10.3 m 具有细胞质膜，但没有细胞壁 DNA均匀分布，没有核区，编码约482个基因 唯一的细胞器是核糖体 具感染性，可在培养基上培养 培养细胞很容易被支原体污染，污染源主

10、要是血清三、原核细胞的两个代表类群（一）细菌细胞 绝大多数细菌的直径大小在0.55.0 m 之间 绝大多数细菌有明显的核区或称类核（nucleoid），主要由一个环状DNA 分子盘绕而成 除了核糖体外，没有类似真核细胞的细胞器。 进化过程中最成功的生命形式是什么？细菌，数量最多，分布最广。甚至有人认为地球上的生物可能是有细菌的陨石带来的。 细菌的复制、转录和翻译同时进行G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合

11、物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。青霉素杀死细菌主要是抑制细菌胞壁内转肽酶等蛋白酶的活性，阳性菌含量高，敏感，阴性菌含量少，不敏感。（二）蓝藻蓝藻在生物进化早期，大量存在于海洋中，通过光合作用，改变了原始地球的大气，为生物进一步进化提供了条件。图2-7 蓝藻 A. 蓝细菌的细胞结构，类囊体组成同心环绕的囊膜，是光合作用光反应的场所。核区常常含有多个拷贝的环状DNA，所以蓝藻中的许多株 系是多倍体（polyploid）。细胞中有许多内含物，如脂滴、聚磷酸盐颗粒、羧酶体（光合作用固定CO2 的酶）、蓝藻素（天冬氨酸和精氨酸的多 聚体，储存N 元素）和气泡（由多列排成柱状的小气泡组成，外被蛋白质鞘，调

12、节细胞在水中的位置）等。B. 荧光显微镜下的丝状蓝藻鱼腥藻 （Anabaena ）红色显示细胞中叶绿素的自发荧光，蓝色显示被标记的细胞中的Ca2+。个体较大，具有固氮作用的异形胞呈蓝色，钙离子在异形胞 分化中起重要的调控作用。鱼腥藻属项圈藻的一类。四、古核细胞（古细菌） 古细菌又称为古核生物（archaeon），在各种环境中都有发现，极端环境中较多 古细菌形态多样，具有细胞壁，染色为G或G ；细胞大小在0.115 m 不等，分裂方式有二分分裂、 出芽等多种 古核生物细胞的形态结构与遗传结构装置和原核细胞相似，但有些分子进化特征更接近真核细胞第三节 真核细胞一、真核细胞的基本结构体系1. 以脂质

13、及蛋白质成分为基础的生物膜结构系统细胞器主要功能线粒体能量代谢内质网蛋白质和脂质合成，蛋白质修饰和折叠高尔基体蛋白质修饰和转运溶酶体清除垃圾和防御中心粒有丝分裂过氧化酶酶体清除有毒物质细胞核遗传信息储存和转录核糖体蛋白质合成叶绿体光合作用2. 以核酸与蛋白质为主要成分的遗传信息传递与表达系统3. 由特异蛋白质装配构成的细胞骨架系统植物细胞与动物细胞的比较 动物细胞 中心体 植物细胞 细胞壁 液泡 叶绿体第四节 非细胞形态的生命体病毒 病毒很小，结构极其简单。绝大部分病毒的大小只有20200 nm，可以通过细菌滤器。因此必须在电子显微镜下才能清楚地看到 不同种类的病毒遗传载体多样性：不仅有DNA

14、 病毒，还有RNA 病毒。这两种病 毒均有双链和单链之分。但每一种病毒粒子中只含有 DNA 或RNA，而非二者兼有 彻底的寄生性。必须要在细胞内才能 进行繁殖并表现出它们的基本生命活动 病毒是以复制和装配的方式进行增殖病毒的核酸类型 病毒的7 种核酸类型：双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA。单链RNA 病毒又分为侵染性RNA 病毒，即正链RNA 病毒；非侵染性RNA 病毒，即负链RNA 病毒。此外，还有病毒粒子中携带反转录酶的单链RNA 病毒和复制过程中涉及反转录的，部分双链DNA 病毒病毒结构示意图A. 腺病毒呈20 面体立体对称，由DNA 核心和衣壳组成B. 疱疹病毒的衣壳呈2

15、0 面体对称，衣壳外包被一层脂双层囊膜C. 烟草花叶病毒的衣壳蛋白与内部的基因组RNA 相结合，病毒呈螺旋对称病毒在细胞内增殖 病毒识别和侵入细胞 病毒核酸的复制、转录与蛋白质的合成 病毒的装配、成熟与释放第三种得到最多的证实细胞生物学研究办法一、光学显微镜 (light microscope) 从细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具 由3 部分组成： 光学放大系统（目镜与物镜） 照明系统（光源和聚光镜） 镜架及调节系统 放大的倒立虚像 经物镜形成倒立实像 经目镜进一步放大成虚像分辨率（resolution）：显微镜最重要的性能参数分辨率是指能区分开两个

16、质点间的最小距离普通光学显微镜最大分辨率0.2 µm像素（Pixel） 像素是组成数字图像或照片的最基本单元。像素点分布越密集，越能把物体的细节表现出来。 分辨率（resolution）。分辨率是和图像相关的一个重要概念，是指单位长度内包含的像素点的数量。它是衡量图像细节表现力的技术参数。分辨率通常是以像素数来计量的，它的单位通常为：像素/英寸（ppi）。（表示每英寸内有多少像素点）。通常情况下，图像的分辨率越高，所包含的像素就越多，图像就越清晰，印刷的质量也就越好。（一）普通复式光学显微镜样品制备（二）相差显微镜和微分干涉显微镜 相差显微镜是在普通光学显微镜的基

17、础上，添加 “环状光阑”和 “相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察 A. 当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加, 亮度增强； B. 当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低，亮度变暗。 微分干涉显微镜以平面偏振光为光源，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别 分辨率比普通光镜提高了一个数量级 录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程（三）荧光显微镜基本原理荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长) 光源和光学系统与普通光学显微镜不

18、同 核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头 滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成免疫荧光技术荧光素直接标记技术绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位（四）激光扫描共焦显微镜 以激光为光源 聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像 利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像 分辨率比普通荧光显微镜1.41.7 倍二、电子显微镜（一）透射电子显微镜 电子束作为光源 电磁透镜聚焦 镜筒高度真空 图像通过荧光屏或感光胶片记录1电子显微镜与光学显微镜的基本区别显微镜分辨本领光源

19、透镜真空成像原理LMTEM200nm0.1-0.2nm可见光（400-700nm） 电子束（0.01-0.9nm）玻璃透镜电磁透镜不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差 电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率 电子束照明系统 成像系统 真空系统 记录系统透射电镜制样技术超薄切片技术 应用超薄切片技术，几乎可以观察各种细胞的超微结构负染色技术 观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等 重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染） 分辨率可达1.5 nm 左右冷冻蚀刻技术 包

20、括冰冻断裂与蚀刻复型两步 观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感 样品不需固定包埋  （用快速低温冷冻法，在液氮或液氦中将样品迅速冷冻，然后在低温下进行断裂。这时冷冻样品往往从其结构相对“脆弱”的部位（即膜脂双分子层的疏水端）裂开，从而显示出镶嵌在膜脂中的蛋白质颗粒。经过一段时间冰的升华（又称蚀刻），进一步增强图像“浮雕”样的效果。再用铂等重金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸断裂面的电子反差。接着，用碳进行垂直喷镀，在断裂面上形成一层连续的碳膜。最后用消化液把生物样品消化掉，将复型膜（碳膜及其被碳膜包裹 的，含有图像信息的金属微粒膜）移到载网上，并在电镜（TEM）下

21、进行观察。）电镜三维重构与低温电镜技术 电镜三维重构技术 低温电镜技术 电子扫描断层成像技术扫描电镜技术 利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌 样品利用CO2 临界点干燥法处理 样品观察前喷镀一层金膜 一般扫描电镜的分辨本领仅为3 nm三、扫描隧道显微镜利用量子力学中的隧道效应；探测微观世界物质表面形貌主要特点： 具有原子尺度的高分辨本领 可以在真空、大气、液体等多种条件下工作 非破坏性测量第二节 细胞及其组分的分析方法一、用超离心技术分离细胞组分 是分离细胞器及各种大分子的基本手段。 转速1025kr/min的离心机称为高速离心机。

22、 转速>25kr/min，离心力>89Kg者称为超速离心机。 超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。差速离心Differential centrifugation：分离密度不同的细胞组分 利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开 特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。(分离密度不同的细胞组分) 沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。密度梯度离心：分离精细组分或生物大分子 通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉

23、降，形成不同的沉降带 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。 类型：速度沉降、等密度沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。二、细胞成分的细胞化学显示方法 显色剂与细胞组分中特殊基团的结合 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量福尔根反应 Feulgen stain 特异显示细胞内呈紫红色的DNA 的分布 原理：酸水

24、解可以去除RNA，仅保留 DNA，并除去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤，使 脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂 （Schiffs reagent）反应呈紫红色三、特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异蛋白的显示可通过抗原抗体特异结合的方法得以实现 若抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察 为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察（一）免疫荧光技术 直接间接免疫荧光技术（A） 间接免疫荧光技术（B）（二）免疫电镜技术 在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位 免疫胶体金技术受到越来越多的青睐四、细胞内特异核酸的定位与定性 原位

25、杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置光镜水平：同位素标记或荧光素标记的探针电镜水平：生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合 荧光原位杂交FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)五、定量细胞化学分析与细胞分选技术¿利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：紫外光显微分光光度测定法、可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪（Flow Cytometry）¿主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相

26、细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。 第三节 细胞培养与细胞工程动物细胞培养 原代培养 （primary culture）：培养来自动物机体的细胞群。将细胞转移到新的容器中培养称为传代或传代培养（passage）。 细胞系（cell line）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。亚二倍体，接触抑制丧失。 克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层； 克隆培养（clo

27、nal culture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞Henrietta Lacks C6胶质瘤细胞大鼠MCF7乳腺癌细胞人H1299肺癌细胞人MEF胚胎成纤维细胞小鼠HCT116肠癌细胞人SP20骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠 培养细胞的生长方式: 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长，见于各种实体瘤细胞。 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，见于各种造血系统肿瘤细胞。根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000

28、转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法 1 吸光培养瓶中的培养液 2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） 静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5

29、吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7 将后者放入培养箱中培养。植物细胞培养 单倍体细胞培养：用花药或花粉在人工培养基上进行培养，通过发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通 过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株 原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株细胞融合与单克隆抗体技术 细胞融合 灭活的病毒 化学物质（如PEG） 电融合 同核体（homokaryon） 异核体（heterokaryon） 合核体（synkaryon）单克隆抗体与多克隆抗体单克隆抗体，简称单抗，是仅由一种类型的细胞制造

30、出来的抗体，对应于多克隆抗体多株抗体由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。单克隆抗体由可以制造这种抗体的免疫细胞与癌细胞融合后的细胞产生的，这种融合细胞即具有瘤细胞不断分裂的能力，又具有免疫细胞能产生抗体的能力。融合后的杂交细胞（杂种瘤）可以产生大量相同的抗体。显微操作技术与动物的克隆 细胞拆合：胞质体，核体 物理法：机械法或短波光 化学法：细胞松弛素 显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等细胞及生物大分子的动态变化一、荧光漂白恢复技术fluorescence photobleaching recovery， FPR 亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光

31、蛋白等与蛋白或脂质耦联 高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭 由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复 测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率二、单分子技术与细胞生命活动的研究 指在单分子水平上对生物分子的行为(构象变化、相互作用、相互识别等）的实时动态检测以及在此基础上的操纵调控等三、酵母双杂交技术 在体内分析蛋白质蛋白质相互作用 利用转录激活因子的DNA 结合域(DB)和转录激活域(AD)结合在一起才具有完整转录激活功能的原理四、荧光共振能量转移技术(FRET)基本原理是：在一定波长的激发光照射下，只有携带发光基团D 的供体分子可被激发出波长为D的荧光，而同一激发光不能激发携带发光基团A的

32、受体分子发出波长为A 的荧光。 然而，当供体所发出的荧光光谱D与受体上的发光基团的吸收光谱A相互重叠，并且两个发光基团之间的距离小到一定程度时，就会发生不同程度的能量转移，即受体分子的发光基团吸收了供体所发出的荧光，结果受体分子放出了波长为A的荧光，这种现象称为FRET 现象。在体内，如果两个蛋白质分子的距离在10 nm 之内，就可能发生FRET 现象，由此认为这两个蛋白质存在着直接的相互作用。 检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用 如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光五、放射自显影技术利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr 或 AgCl)的感光

33、作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究两个主要步骤：即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素的显示 研究DNA 合成时通常用氚（3H）标记的3H-TdR 研究RNA 合成用3H-U 在研究含硫蛋白分子代谢时，用 35S 标记的蛋氨酸和半胱氨酸对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪的标记方法：持续标记、脉冲标记显微放射自显影电镜放射自显影第五节 模式生物与功能基因组的研究 模式生物通常个体较小，容易培养，操作简 单，生长繁殖快 由于基因在进化上的保守性以及遗传密码的通用性，从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息往往也适用于其他生物（一）大肠杆菌 原核细胞，培养方便

34、，生长快，基因结构简单，突变株的诱变，分离和鉴定容易，转基因技术成熟，进行基因定位简便易行（二）酵母 单细胞真核生物的代表：芽殖酵母和裂殖酵母，生长迅速并且易于遗传操作 常用于蛋白质相互作用、细胞周期、基因表达调控、膜泡运输、细胞分化和衰老等（三）线虫 (Caenorhabditis elegans) 遗传背景清楚、生命周期只有3天，成体只有959个细胞，通体透明，便于胚胎发育中细胞分裂、分化以及细胞的死亡的研究,RNAi,细胞凋亡（四）果蝇 (Drosophila melanogaster) 基因组序列已测定，与人类基因有很高的同源性，在遗传分析、染色体特性研究、胚胎发育的基因调控和细胞分化

35、机制的研究、神经退行性疾病和学习、认知等领域的研究发挥重要的作用（五）斑马鱼 (Danio rerio) 小型脊椎动物。许多基因与人类的基因存在对应关系 3 个月性成熟、产卵多、胚胎体外发育，利于研究胚胎发育过程中细胞行为（六）小鼠 (Mus musculus) 小型哺乳动物，遗传背景清楚，进化方面最接近人类，用于转基因小鼠、基因打靶、条件基因打靶、RNA 干涉以及疾病模型（七）拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 十字花科的植物， 广泛用于植物遗传学、发育生物学、细胞生物学和分子生物学的研究二、突变体制备技术RNA水平 RNA 干扰（RNAi）二、突变体制备技术DNA水平 基

36、因敲除(knock out) 三、蛋白质组学 (proteomics) 技术细胞质膜第一节 细胞质膜的结构模型与基本成分一、细胞质膜的结构模型1. 质膜由双层脂分子构成的推测用有机溶剂提取了人的红细胞质膜的脂类成分，将其铺展在水面，测出膜脂展开的面积二倍于细胞表面积，因而推测细胞膜由双层脂分子组成。2. “蛋白质脂质蛋白质” 三明治式结构模型3. 单位膜模型 1959 年，Robertson电镜超薄切片中的细胞质膜显示出暗亮暗三条带4. 流动镶嵌模型 1972年，Singer 和Nicolson 膜的流动性 膜蛋白分布的不对称性5. 脂筏模型 1988年，Simons 在甘油磷脂为主体的生物膜

37、上，胆固醇、鞘磷脂等富集区域形成相对有序的脂相，如同漂浮在脂双层上的“脂筏” 载着执行特定生物学功能膜蛋白6. 目前对生物膜结构的认识 磷脂分子在水相中具有自发封闭的性质 蛋白质分子以不同方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面 生物膜可看成是蛋白质在双层脂分子中的二维溶液 细胞生命活动中，生物膜处于不断的动态变化中二、膜脂 (membrane lipid)（一）成分 甘油磷脂主要在内质网合成甘油磷脂(glycerophosphatide)又可以根据极性头部集团的不同区分为磷脂酰胆碱（Phosphatidyl cholines, PC）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyl ethanolami

38、nes, PE）、磷脂酰丝氨酸（Phosphatidyl serines, PS）、磷脂酰肌醇（Phosphatidyl inositols,PI）、等。*具有一个极性头和两个非极性的尾*脂肪酸碳链为偶数*除饱和脂肪酸外常含1-2 个双键的不饱和脂脂分子极性头空间占位对脂双层曲度的影响PE 极性头较小，更多地分布在脂双层曲度较小的一侧 鞘脂主要在高尔基体合成鞘磷脂(sphingomyelin, SM)形成的脂双层厚度较甘油磷脂厚度大A. 卵磷脂(PC)B. 鞘磷脂(SM)C. 卵磷脂和胆固醇D. 鞘磷脂和胆固醇 固醇：胆固醇及其类似物主要在动物细胞的胞质和内质网合成含4 个闭环，亲水的头部为一

39、个羟基调节膜的流动性，增加膜的稳定性以及降低水溶性物质通透性脂筏基本结构成分，还是很多重要生物活性分子的前体化合物（二）膜脂的运动方式 沿膜平面的侧向运动 脂分子围绕轴心的自旋运动 脂分子尾部摆动 双层脂分子之间的翻转运动（三）脂质体 (liposome) 脂质体：根据磷脂分子可在水相中形成稳定脂双层膜的现象而制备的人工膜 用途：可嵌入不同的膜蛋白， 是研究膜脂与膜蛋白生物学性质以及转基因、药物靶向的好材料三、膜蛋白(membrane protein) 膜蛋白种类繁多 赋予生物膜重要的生物学功能（一）膜蛋白的三种基本类型 外在膜蛋白或外周膜蛋白(为水溶性蛋白质) 内在膜蛋白或整合膜蛋白 脂锚定

40、膜蛋白A：脂肪酸结合到膜蛋白 N 端的甘氨酸残基上B：烃链结合到膜蛋白 C 端的半胱氨酸残基上C：通过糖脂锚定在细胞质膜上（二）内在膜蛋白与膜脂结合的方式 内在膜蛋白为跨膜蛋白 可分为：胞质外结构域、跨膜结构域和胞质内结构域1. 膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子的疏水核心相互作用2. 跨膜结构域两端带正电荷的氨基酸残基或带负电的氨基酸残基通过Ca2+、Mg2+与带负电的磷脂极性头部相互作用3. 通过自身在胞质一侧的半胱氨酸残基共价结合到膜脂肪酸分子上内在膜蛋白跨膜结构域是与膜脂结合的主要部位1. 跨膜结构域形成 螺旋；2. 跨膜结构域主要由 折叠片组成；3. 某些 螺旋外侧非极性链与膜脂相互作用

41、，内侧极性链形成特异极性分子的跨膜通道。跨膜蛋白既有疏水区域(跨膜区)，也有亲水区域（膜表面区），其结构解析主要是应用低温电镜技术和X射线晶体衍射技术（三）去垢剂 一端亲水、一端疏水的两性小分子，是分离与研究膜蛋白的常用试剂 插入膜脂与膜脂或膜蛋白的跨膜结构域等疏水部位结合，形成可溶性的微粒 离子型去垢剂：如SDS，可破坏蛋白质中离子键和氢键等非共价键，甚至改变蛋白质亲水部分的构象 非离子去垢剂：如Triton X-100，对蛋白质作用比较温和，用于膜蛋白的分离与纯化四、膜糖 糖脂 糖蛋白细胞质膜上的膜糖都位于质膜外表面，内膜系统中的膜糖则面向细胞器腔面！第二节 细胞质膜的基本特征与功能一、膜

42、的流动性（一）膜脂的流动性膜的流动性是是所有的生物膜的基本特征，是细胞生长增殖等生命活动的必要条件膜的流动状态受细胞代谢过程的调节脂肪酸链越短、不饱和程度越高，流动性越大温度对膜脂的运动有明显影响胆固醇对膜的流动性起着双重调节作用（二）膜蛋白的流动性 荧光标记人-鼠细胞融合实验 成斑现象（patching）或成帽现象（capping） 膜蛋白流动性受多种因素限制：如紧密连接、细胞骨架的影响等（三）膜脂和膜蛋白运动速率的检测 荧光漂白恢复（FRAP）技术二、膜的不对称性 膜脂和膜蛋白在生物膜上呈不对称分布 糖蛋白和糖脂的糖基部分均位于细胞质膜的外侧 电镜冷冻蚀刻技术（一）细胞质膜各膜面的名称 质

43、膜的细胞外表面（extrocytoplasmic surface，ES） 质膜的原生质表面（ protoplasmic surface， PS） 细胞外小叶断裂面（extrocytoplasmic face，EF） 原生质小叶断裂面（protoplasmic face，PF）（二）膜脂的不对称性 膜脂的不对称性是指同一种膜脂分子在膜的脂双层中呈不均匀分布 糖脂分布表现出完全不对称性：非胞质侧（三）膜蛋白的不对称性 所有的膜蛋白在质膜上都呈不对称分布，每种膜蛋白分子在质膜上都具有明确的方向性 糖蛋白的糖残基均分布在生物膜的非胞质一侧三、细胞质膜相关的膜骨架（一）膜骨架 细胞质膜下与膜蛋白相连的由

44、纤维蛋白组成的网架结构，参与维持质膜形状并协助质膜完成多种生理功能 哺乳动物红细胞具有很好的弹性和强度（二）红细胞的生物学特性血影(ghost)（三）红细胞质膜蛋白及膜骨架 红细胞质膜的刚性与韧性主要由质膜蛋白与膜骨架复合体的相互作用来实现 红细胞双凹形椭圆结构的形成还需要其他的骨架纤维参与 除红细胞外，已发现在其他细胞中也存在与锚蛋白、血影蛋白及带4.1 蛋白类似的蛋白质，大多数细胞中也都存在膜骨架结构四、细胞质膜的基本功能 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境 选择性的物质运输 提供细胞识别位点，完成信息跨膜传导 为多种酶提供结合与反应位点 介导细胞与细胞、细胞与胞外基质间连接 参与形成细

45、胞表面特化结构物质的跨膜运输与信号传递脂双层疏水对绝大多数极性分子、离子以及细胞代谢产物的通透性极低，形成了细胞的渗透屏障膜转运蛋白可分为两类：载体蛋白（carrier protein，transporter） 多次跨膜；通过构象改变介导溶质分子跨膜转运 与底物（溶质）特异性结合；具有高度选择性；具有类似于酶与底物作用的饱和动力学特征；但对溶质不做任何共价修饰通道蛋白（channel protein） 3 种类型：离子通道、孔蛋白以及水孔蛋白 大多数通道蛋白都是离子通道（同时对离子的选择性取决于通道的直径、形状以及通道内带点和氨基酸的分布）特点 1.具有极高的转运速率 2.没有饱和值 3.并非

46、连续性开发而是门控的 转运底物时，通道蛋白形成选择性和门控性跨膜通道小分子物质的跨膜运输类型（一）简单扩散 (simple diffusion)1.一些脂溶性物质由膜的高浓度一侧向低浓度一侧移动的过程。 顺电化学梯度或浓度梯度 不需要细胞提供能量， 无需膜转运蛋白协助 脂双层对溶质的通透性大小主要取决于分子 大小和分子的极性等渗溶液中细胞一定能维持正常形态吗？在临床或生理实验使用的各种溶液中，与血浆渗透压相等的称为等渗溶液（如0.85%NaCI溶液），高于或低于血浆渗透压的则相应地称为高渗或低渗溶液。 未必，1.9%的尿素溶液，虽与血浆等渗，但红细胞置于其中立即发生溶血。这是因为尿素分子可自由

47、进入红细胞，导致红细胞内渗透压进而使水分子进入红 细胞内红细胞肿胀破裂而溶血。一般把能使悬浮于其中的红细胞保持正常形态和大小的盐溶液称为等张等渗溶液，如0.9%NaCl溶液。而1.9%的尿素溶 液只是等渗溶液而不是等张溶液。（二）被动运输 (passive transport) 顺着电化学梯度或浓度梯度 协助扩散 (facilitated diffusion) 膜转运蛋白协助 载体蛋白介导 转运的物质：葡萄糖、氨基酸等小分子亲水物质 通道蛋白介导 转运的物质:各种带电离子1. 葡萄糖转运蛋白（glucose transporter,GLUT） 12 次跨膜 螺旋 通过构象改变完成葡萄糖的协助扩

48、散 转运方向取决于葡萄糖浓度梯度2. 水孔蛋白：水分子的跨膜通道 (AQP)水孔蛋白由四个亚基组成四聚体，每个亚基都由六个跨膜a螺旋组成。每个亚基单独形成一个供水分子运动的中央孔。 水分子借助质膜上的水孔蛋白实现快速跨膜转运(肾小管对水的重吸收，唾液和眼泪的形成时，一般情况是通过简单运输缓慢穿过脂双层) 调节细胞渗透压以及生理与病理作用（三）主动运输(active transport) 载体蛋白所介导、逆着电化学梯度或浓度梯度进行跨膜转运的方式 3种类型 ATP 驱动泵（ATP直接供能）ATP 驱动泵通常又称为转运ATPase，分为4类：1.P型泵 2 个 催化亚基，具有ATP 结合位点；2

49、个 调节亚基 至少有一个 催化亚基发生磷酸化和去磷酸化反应，改变转运泵的构象，实现离子的跨膜转运 转运泵水解ATP 使自身形成磷酸化的中间体（一） Na+-K+ 泵（Na+-K+ ATPase）由2 个 和2 个 亚基组成四聚体在细胞内侧 亚基与Na+ 相结合促进ATP 水解， 亚基 上的一个天冬氨酸残基磷酸化引起 亚基构象发生变 化，将Na+ 泵出细胞，同时细胞外的K+ 与 亚基的另 一位点结合，使其去磷酸化， 亚基构象再度发生变化 将K+ 泵入细胞，完成整个循环。从整个转运过程可以 看出， 亚基的磷酸化发生在Na+ 结合后，而去磷酸化 则发生在K+ 结合后。Na+ 依赖性的磷酸化和K+ 依

50、赖性 的去磷酸化引起Na+-K+ 泵构象发生有序变化，每秒钟可 发生1 000 次左右。此外，每个循环消耗一个ATP 分子， 可以逆着电化学梯度泵出3 个Na+ 和泵入2 个K+主要生理功能A. 维持细胞膜电位细胞在静息状态时膜电位质膜内侧为负，外侧为正。每个循环泵出3个Na+并泵入2个K+B. 维持动物细胞渗透平衡没有此泵水分子将由于渗透压的缘故顺着自身浓度梯度通过水孔蛋白大量进入细胞引起细胞吸水膨胀。C. 吸收营养动物细胞对葡萄糖或氨基酸等有机物吸收的能量由蕴藏在Na+ 电化学梯度中的势能提供（植物细胞、真菌和细菌通常利用质膜上的H+-ATPase 形成的H+ 电化学梯度来吸收营养物乌苯苷

51、（ouabain）用作强心剂的原理？乌本苷抑制钠钾泵作用机制：乌本苷(ouabain),地高辛(digoxin)等强心剂能抑制心肌细胞Na+-K+泵的活性;从而提高钠钙交换器效率,使内流钙离子增多,加强心肌收缩,因而具有强心作用. （二） Ca2+ 泵及其他 P 型泵1.细胞质基质中低Ca2+ 浓度的维持主要得益于质膜或细胞器膜上的钙泵每消耗1 分子ATP 从细胞质基质泵出 2 个Ca2+2. P 型 H+ 泵植物细胞、真菌(包括酵母)和细菌细胞质膜上虽然没有Na+-K+ 泵， 但有P 型H+ 泵(H+-ATPase)P 型H+ 泵将 H+ 泵出细胞，建立和维持跨膜 H+ 电化学梯度2.V型质

52、子泵 V 型质子泵广泛存在于动物细胞的胞内体膜、溶酶体膜，破骨细胞和某些肾小管细胞的质膜，以及植物、酵母及其他真菌细胞的液泡膜上 （V 为vesicle） 转运 H+ 过程中不形成磷酸化的中间体 逆势，维持细胞质基质 pH 中性和细胞器内 pH 酸性3.F型质子泵 F 型质子泵存在于细菌质膜、线粒体内膜和叶绿体类 囊体膜上（F 为factor 的第一个字母） 转运 H+ 过程中不形成磷酸化的中间体 顺势，F 型质子泵常利用质子动力势合成ATP，又称作 H+-ATP合成酶4.ABC超家族 ABC 超家族也是一类ATP 驱动泵; 广泛分布于从细菌到人类各种生物中，是最大的一类转运蛋白(ATP-bi

53、nding cassette); 通过ATP 分子的结合与水解完成小分子物质的跨膜转运 4 个“核心”结构域 2 个跨膜结构域，分别含6 个跨膜 螺旋，形成底物运输通路决定底物特异性 2 个胞质侧ATP 结合域，有 ATPase 活性 ATP 分子结合诱导 2个ATP 结合域二聚化，引起转运蛋白构象改变，使底物结合部位暴露于质膜的另一侧由于有些ABC转运蛋白能够将抗生素或其他抗癌药物泵出细胞而赋予细胞抗药性multidrug-resistance，MDR 多药抗性转运蛋白cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR 囊性纤维化跨膜转运调节蛋白动物细胞与植物细胞的区别 协同转运或偶联转运（ATP间接提供能量）协同转运蛋白（contranspoter）或偶联转运蛋白（coupled transporter）介导各种离子和分子的跨膜运动。同向协同转运 偶联物的运输方向相同反向协同转运 偶联物的运输方向相反协同转运蛋白所利用的能量储存在其中一种溶质的电化学梯度中，协同转运是一种间接消耗能量的主动转运方式。 光驱动泵（light-driven pump）光驱动泵主要发现于细菌细胞，对溶质的主动运输与光能的输入相偶联离子跨膜转运与膜电位真核细胞通过胞吞作用和胞