生物工程复习资料

1、生物工程概论生物工程：也叫生物技术，是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。先进的工程技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程发酵工程部分第一节 发酵工程概况（绪论）第二节 微生物发酵过程第三节 液体深层发酵第四节 固体发酵第五节 典型实例（啤酒的发酵、青霉素发酵）第一节 绪 论一、基本概念（一）发酵工程的定义是利用微生物某种功能，通过现代工程技术手段，生产有用物质并直接将微生物应用于工业生产的一种生物技术。又称微生物工程Ø 讨论各单元操作中的工艺和设备

2、的一门科学。Ø 微生物学、生物化学、和化学工程学的基本原理有机结合起来的科学。 微生物(microorganism)：形体微小具有单细胞或简单的多细胞结构，或没有专一细胞结构的一群最低等生物。 特点：体形微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物。微生物的种类三型九大类Ø 真核细胞型微生物细胞核分化程度高，有核膜和核仁，细胞器完整。如酵母菌、霉菌。Ø 原核细胞型微生物细胞核的分化较低，仅有原始核，无核膜、核仁。细胞器很不完善。DNA和RNA同时存在。这类微生物众多，有细菌、放线菌、支原体、衣原体

3、、立克次体、螺旋体。Ø 非细胞型微生物是最小的一类微生物。无典型的细胞结构，只能在活细胞内生长繁殖。核酸类型为DNA或RNA。病毒属之。在自然界分布的特征 种类多 10万多种，目前人类认识的不足10%，开发利用不足1%； 分布广 空气，土壤，水及极端环境中； 繁殖快 世代时间短，几十分钟至一百多分钟。对发酵工业有重要的意义； 代谢强 吸收多，转化快，效率高，消耗自重几百至上千倍食物； 易变异 单细胞或结构简单易受到外界影响，有好有坏。（可以利用此特征将产量提高或增强菌体的抗药性）微生物与人类的关系绝大多数微生物对人类和动、植物是有益的，而且有些是必需的。1.在自然界中元素的循环2.在

4、工业方面的作用3.在农业方面的作用4.在医药方面的作用只有少数的微生物对人类和动、植物是有害的。（二）发酵的概念 传统概念：指酵母作用于果汁或发芽谷物，进行酒精发酵时产生CO2的现象。 生物学概念：发酵是指微生物在无氧条件下分解代谢有机物质释放能量的过程。（生化） 工业生物学家概念：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程 现代概念：培养生物细胞（含动植物和微生物）来制取产物的所有过程（三）发酵工业的概念发酵工业（Fermentation Industry）是利用微生物生命活动产生的酶，对无机或有机原料进行酶加工而获得各种发酵产品的工业。其主体是利用微生物进行生

5、物化学反应的工业。二、发酵工业分类、条件及特点主体是利用微生物进行生物化学反应的工业分类： 食品发酵工业（food fermentation industry） 非食品发酵工业（non-food fermentation industry）我国，通常把由复杂成分构成的，并有较高风味要求的发酵食品，如啤酒、白酒、酱、醋、腐乳、腌菜等副食调味品的生产过程称为酿造工业（brewing industry） 把经过纯种培养，提炼精制获得的成分单纯、无风味要求的酒精、抗生素、柠檬酸、谷氨酸、酶制剂、单细胞蛋白等的生产叫做发酵工业（fermentation industry）发酵过程应具备的条件从发酵和发酵

6、工业的定义可知，要实现发酵过程并得到发酵产品必须具备以下条件：l 具有某种适宜的微生物l 要保证控制微生物进行代谢的各种条件（培养基组成、温度、溶氧浓度、酸碱度等）l 要有进行微生物发酵的设备l 要有将菌株或代谢产物提取，精制成产品的方法和设备三、发酵工业的发展历史（History of applied microbiology）（四次转折）1.（Ancient times）天然发酵阶段 food preservation (vinegar, cheese) flavour (bread, soy sauce) brewing (beer, wine) 特点：Ø 多数产品为嫌气性发酵

7、Ø 非纯种培养Ø 单凭经验传授技术，使产品质量不稳定 （不了解微生物与发酵的关系）2、近代发酵工程时期纯培养技术1665 英国物理学家 Robert Hooke（罗伯特·胡克）细胞壁1680 荷兰列文·虎克(Antonie vanLeeuwenhoek) 活细胞 人类认识到微生物的存在1850-1880 法国科学家Louis Pasteur 揭示了发酵的秘密，确定了微生物与发酵的关系否定“微生物的自生说”，发明了一种有效的灭菌法-巴斯德灭菌法 (a)无菌营养液通向空气，则出现微生物。巴斯德认为是空气中微生物进入烧瓶，而反对者认为是空气中生命力进入烧瓶；(

8、b)烧瓶被加热和密封后，无生命出现。巴斯德认为是热杀死了微生物，而反对者认为是热破坏了生命力，且生命的产生需空气；(c)烧瓶开口，通入的空气被加热，无生命出现。巴斯德认为是热杀死了空气中微生物，而反对者认为生命力被破坏；(d)雁颈使空气自由进入烧瓶，但微生物被截留，无生命出现。巴斯德观点被证实。 19世纪70-80年代，微生物纯种培养技术取得了很大的进步1872年 Brefeld（布雷菲尔德）进行了霉菌纯种分离和培养1878年 Lister（李斯特）纯培养乳酸菌并测定了菌数1881年 德国Robert Koch（科赫）发明用明胶斜面分离和坚 定菌种的纯培养技术，并发现了多种致病菌，还提 出科赫

9、条件，证明了特定的微生物引起特定的疾病Koch postulate1. 在患病的动物体内总能发现特定微生物，而健康的动物体内则没有2. 在动物体外可以纯培养此微生物3. 将该培养物接种到易感动物体内会引起同样的疾病4. 从试验动物及实验室培养物种重新分离得到的微生物应该是同种微生物1887年 Petri （皮特里）改用玻璃平皿取代试管进行分离培 养单菌落，Petri皿（皮式培养皿）（一直使用）上述研究成果使发酵技术的最基本手段微生物的分离和纯种培养方法建立起来。 使发酵技术由天然发酵阶段转向纯培养发酵（ 第一次转折）此阶段特点：产品的生产过程较为简单，对生产要求不高，规模不大产品： 乳酸、酒精

10、、面包酵母、丙酮酸、柠檬酸、淀粉酶、 蛋白酶3、近代发酵工程时期深层培养技术Ø 出现于20世纪40年代，以抗生素的生产为标志Ø 青霉素的发现与大量需求 表面培养法(surface culture) 效价40U/mL，纯度20%，收率30%Ø 二战期间，青霉素发酵生产成功青霉素发酵生产的成功，给发酵工业带来两大功绩：Ø 开拓了以青霉素为先锋的庞大抗生素发酵工业Ø 建立深层培养法（submerged fermentation），把通气搅拌技术引入发酵工业。它使得需氧菌的发酵生产从此走上了大规模工业化生产途径。通气搅拌液体深层发酵技术是现代发酵工业最

11、主要的生产方式深层培养技术的意义 机械搅拌通气发酵Ø 40-50年代，链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素等相继问世，使这一时期成为抗生素工业的黄金时代Ø 促进了其他发酵产品的出现，如氨基酸发酵工业Ø 好氧发酵，初级、次级代谢产物机械搅拌通气发酵技术的建立是第二次转折4、近代发酵工程时期代谢控制发酵技术Ø定义：以动态生物化学和微生物遗传学为基础，将微生物进行人工诱变，得到适合于生产某种产品的突变株，再在人工控制的条件下培养，即能选择性地大量生产人们所需要的物质。Ø 1956 日本人Kinoshita（木下祝郎） 谷氨酸发酵Ø 已有2

12、2种氨基酸用发酵法生产，其中18种直接发酵，4种酶法转化Ø 已用于氨基酸、核苷酸、有机酸以及一部分抗生素的发酵Ø 代谢控制发酵技术的建立是第三次转折5、近代发酵工程时期连续化、自动化发酵技术Ø 学科交叉之间的应用：数学、动力学、化学工程原理、电子计算机技术、自动化控制Ø 新设备层出不穷 -大大提高生产效率6、近代发酵工程时期开拓发酵原料时期Ø 1960-1970期间，为解决粮食危机，出现了以正烷烃为原料生产单细胞蛋白即石油蛋白的研究和生产Ø 石油代粮发酵Ø 粮食生产工业化Ø 纤维素代粮发酵 7、现代发酵工程时期现代

13、分子生物学技术Ø （1972）DNA 重组技术、原生质体融合技术等应用Ø 1982，第一个基因工程产品利用工程菌生产的人胰岛素问世Ø 现有许多种类的产品: 红细胞生成素 ( 治疗贫血) 生长激素 ( 促进生长) 胰岛素 (治疗糖尿病) 干扰素 (抗病毒、抗肿瘤) Ø定义：应用分子生物学和分子遗传学的方法，人为的将任意生物的特定又有用的遗传基因组合到特定微生物的基因中去，在分子水平上选育新的物种，创造新的微生物，从而达到定向改变自然界微生物所不能合成的产物。（基因工程阶段）Ø现代分子生物学技术的应用是第四次转折四、微生物工程的应用（一）微生物工程

14、应用领域1、在食品工业的应用微生物技术最早开发应用的领域，至今产量和产值仍占微生物工程的首位微生物技术最早开发应用的领域，至今产量和产值仍占微生物工程的首位食品加工：单细胞蛋白（酵母、真菌等）含醇饮料：葡萄酒、黄酒、白酒、啤酒、白兰地、威士忌发酵乳制品：奶酪、酸奶调味品：味精、肌苷酸、酱油、醋等2、在医药卫生中的应用Ø 抗生素：12 000余种青霉素、金霉素、四环素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、螺旋霉素、头孢霉素等 Ø 氨基酸：可发酵生产的有谷、赖、丙、组、异亮、亮、苯丙、脯、苏、色、酪、缬、瓜、鸟氨酸（国内40亿元，占发酵业产值12%）维生素：VB2 、VB12、

15、Vc、VA、VD等Ø 生物制品：亚单位疫苗、重组疫苗、DNA疫苗等Ø 酶抑制剂： 棒酸（可抑制b-内酰胺酶对青霉素的破坏） a-淀粉酶的抑制剂可治疗糖尿病 胆固醇抑制剂可治疗高血压高血脂3、在轻工业中的应用糖酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、凝乳酶、氨基酰化酶、甘露聚糖酶等4、在化工能源中的应用醇及溶剂：乙醇、甘油、异丙醇、丙酮、丁醇、丁二醇等有机酸：醋酸、丙酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、水杨酸等多糖：黄原胶、海藻糖等清洁能源：氢气、微生物燃料电池等5、在农业中的应用生物农药： 杀虫剂（Bt、白僵菌、病毒、微孢子虫） 防治植物病害（假单孢菌、木霉、弱病毒、庆丰霉素）生物除草剂

16、：利用杂草的病原微生物生物增产剂：根瘤菌、蓝细菌、钾细菌、磷细菌等6、在环境保护中的作用污水处理（厌气法、好气法）7、在高技术领域中的应用基因工程的各种工具酶等（二）微生物工程产品类型1、微生物菌体的发酵SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）生物防治制剂（如苏云金杆菌）活性乳制剂细胞的生长与产物的积累成平行关系，生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段2、微生物酶发酵1894 日本高峰 米曲霉高峰淀粉酶各种酶制剂糖化酶、氨基酰化酶（DL氨基酸光学拆分）、蛋白酶、脂肪酶等与动植物酶相比：易于进行大规模生产易于改善工艺3、微生物代谢产物发酵初级代谢产物：F 指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢

17、和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质，如氨基酸、核苷酸、脂类、有机酸、糖等，即为初级代谢产物次级代谢产物： F 指某些微生物在一定的生长时期（通常是稳定期），能合成一些具有特定功能的产物，而这些产物与微生物的生长繁殖无明显关系，如抗生素、色素、生物碱、胞外多糖等，即为次级代谢产物比较初级代谢产物和次级代谢产物初级代谢产物：F 与菌体生长相伴随的产物，F 氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、溶剂F 菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累次级代谢产物： F 与菌体生长不相伴随，以初级代谢产物为原料而合成 F 抗生素、生物碱、毒素、胞外多糖等 F 结构常较复杂对环境条件敏感4、微生物的生物转化 利

18、用微生物细胞的一种或几种酶，作用于一些化合物的特定部位（基团），使它变成结构相类似，但具有更大经济价值的化合物的生化反应。如脱氢、氧化、脱羧、脱水、氨化、异构化等。最突出的生物转化是甾体转化。 反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性5、微生物特殊机能的利用利用微生物消除环境污染（污水、废料处理）保持生态平衡（生物固氮）探矿冶金（硫化细菌）石油脱蜡（深层石油由于吸附在岩石空隙间，难以开采，微生物分解蜡质 增加石油流动性而使石油产量增加）利用基因工程菌开拓发酵工程新领域五、发酵工业的特征 1、发酵原料的选择和预处理2、微生物菌种的选育及扩大培养3、发酵工艺控制及设备

19、选择4、发酵产物的分离提取5、发酵废物的回收及利用六、微生物工程面临的挑战和发展趋向(一）面临的挑战1、化学合成工业的竞争 有机溶剂，如丙酮、丁醇 发酵法产品所占份额已很少 当然也有多种原来通过化工合成的产品逐渐被发酵法所取代，如乳酸2、农业生物工程的冲击 转基因植物中表达生产 PHB、抗体、药物、植酸酶（将饲料中的有机磷转变为动物可以利用的形式，减少粪便中的磷，降低饲养场地区的污染）等二）微生物工程发展趋向1、利用基因工程等先进技术，人工选育和改良菌种，提高现有发酵工业水平 利用基因工程技术，可以根据人们的意愿创造新的物种，这些新物种将为人类做出不可估量的贡献2、利用发酵技术进行高等动植物细

20、胞培养3、固定化酶和细胞技术广泛应用将酶固定在不溶解的膜状或颗粒状聚合物上，使其在连续的催化反应中不流失，从而可以回收并反复利用4、广泛应用于环境工程5、开拓极端酶极端酶由于极端酶的极端稳定性，为开拓新的生物催化和生物转化提供了广阔的应用前景。本章重点 重要概念：发酵、发酵工程、微生物工程、发酵工业、初级代谢产物、次级代谢产物、代谢控制发酵技术、 了解发酵工业的分类、应具备的条件和特点 了解发酵工程的发展史，掌握四个转折点 熟悉微生物工程产品的类型第二节 微生物的发酵过程 定义：由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应的过程。又叫微生物反应过程。 分类(三种分类方式)： 微生物的种类（好氧、厌

21、氧、兼性厌氧） 培养基状态 发酵设备 根据微生物的种类不同，微生物发酵过程可以分为： 好氧性发酵：在发酵过程中需要不断的通入一定量的无菌空气。 黑曲霉 柠檬酸发酵 棒状杆菌 谷氨酸发酵 黄单孢菌 多糖发酵 厌氧性发酵：在发酵时不需要供给空气。 乳酸杆菌 乳酸发酵 梭状芽孢杆菌 丙酮、丁醇发酵 根据培养基状态的不同，微生物发酵分 固体发酵 液体发酵 根据发酵设备的不同，微生物发酵分 敞口发酵：设备简单，繁殖快，好氧 密闭发酵：密闭设备，要求严格，工艺复杂 浅盘发酵：（表面培养法） 深层发酵：（常用）（重点）液体深层发酵同其他发酵方法相比，优点：ü 液体悬浮状态是很多微生物的最适生长环境

22、ü 易于扩散；易于扩大生产规模ü 液体运输方便，易于机械化操作ü 厂房面积小，生产效率高，易进行自动化控制，产品质量稳定ü 产品易于提取、精制等等因此，液体深层发酵在发酵工业中被广泛应用本节主要内容一、发酵工业中常用的微生物二、培养基三、发酵的一般过程一、发酵工业中常用的微生物 已经探明的微生物有10万种之多，用到的只有10，常用的仅有100多种，能代谢出产物1300种，形成工业生产的有150多种；微生物产生的酶有1000多种，形成工业生产的酶有40多种。 常用的工业微生物菌种有： 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌（一）细菌 自然界中分布最广、数量最多的一类，

23、单细胞原核生物Ø 基本结构：细胞壁、细胞膜和核区Ø 繁殖：主要是二分裂方式Ø 菌落：菌种鉴定的重要方式 发酵工业中常用的细菌有：Ø 枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等 主要用于生产：Ø 淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸、肌苷酸等1,细菌的结构2、细菌的繁殖：细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖3、细菌的菌落 定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。 功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。

24、举例：如金黄色葡萄球菌落、枯草芽孢杆菌落等。（二）放线菌 自然界中分布最广，在有机质丰富的微碱性土壤中大量存在。属原核生物类群。大多腐生，少数寄生。Ø 结构：营养菌丝（基内菌丝）、气生菌丝、孢子丝Ø 繁殖：主要是无性孢子繁殖，菌丝断片繁殖（液体） 发酵工业中常用的放线菌有：Ø 链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等 主要用于生产：Ø 链霉素、金霉素、土霉素、庆大霉素等2、放线菌的结构3、放线菌的工业应用（三）酵母菌 单细胞真核生物，主要分布在含糖质较多的偏酸性环境。Ø 结构：单个细胞，细胞壁，细胞膜，细胞质，细胞核Ø 繁殖：通常是出芽繁殖

25、Ø 鉴定方式：主要是生理生化特性学、分子生物学 发酵工业中常用的酵母菌有：Ø 啤酒酵母、假丝酵母、毕氏酵母等 主要用于生产：Ø 酿酒、制造面包、生产可食用、药用和饲料用的酵母菌体蛋白等1、酵母菌的形状、大小基本特征：单细胞, 椭圆形、圆形或柱形。 宽1-5um,长5-30um。2、酵母菌的结构3、酵母菌繁殖特殊形态：假菌丝假菌丝是由酵母菌细胞与其子细胞连接而成的链状丝。4、酵母菌的菌落特征（四）霉菌 在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的真菌 分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处 喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性，多腐生，少寄生Ø 繁

26、殖：主要是无性孢子繁殖Ø 生长方式：菌丝末端的伸长和顶端分支 发酵工业中常用的霉菌有：Ø 藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等 主要用于生产：Ø 霉制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等1、基本特征：菌丝：管状根据菌丝的基本形态分 有隔膜菌丝根据菌丝的分布和功能分2、霉菌的繁殖方式：3、菌落形态：其它的微生物 担子菌、藻类等Ø 担子菌即是通常所说的菇类；Ø 藻类是自然界分布极广的一大群自养微生物资源，如螺旋藻等；二、 培养基定义：人们提供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。成分和配比：生长、发

27、育、代谢及产物积累，乃至发酵工业的生产工艺都有很大影响。1、培养基的类型： 根据营养物质来源 Ø 天然培养基： 采用化学成分还不清楚不稳定的植物浸出物，水解液制成Ø 合成培养基： 化学成分和数量完全不同的物质配成的Ø 半合成培养基：一部分天然有机物体作碳、氮源，再加入一些化学药品作无机盐。 根据在生产中的用途不同分（重点）Ø 孢子培养基：制备孢子用。ü 要求：能形成大量优质孢子，且不能引起菌种变异ü 通常：基质浓度（特别N）要低，否则影响孢子形成； 无机盐浓度要适量，否则影响孢子的数量和质量。ü 常用Medium：麸皮培养基

28、、大（小）米培养基等ü 种子培养基：供孢子发芽和菌体生长繁殖用ü 要求：营养成分应是易被菌体吸收利用的，同时比较丰富和完整ü 通常：N和维生素略高些，总浓度略稀薄ü 培养基组成随菌种的不同而不同。ü 应考虑种子培养基与发酵培养基组成的内在联系ü 发酵培养基：供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物ü 要求：组成丰富完整；浓度、粘度适中；利于菌体生长，合成大量代谢产物ü 培养基组成须考虑菌体在发酵过程中的各种生化代谢的协调，在产物合成期，使发酵液pH不出现大的波动2、发酵培养基的组成： 碳源：构成菌体和产物的碳架及能量来源。

29、 单糖、多糖；玉米淀粉及其水解液等等 氮源：凡是构成微生物细胞本身的物质或代谢产物中氮素来源的营养物质。 有机氮和无机氮 无机盐和微量元素：微生物的生长、繁殖和产物形成需要各种无机盐和微量元素。Ø 生理功能：构成菌体原生质的成分（如磷、硫等）；作为酶的组成成分或酶的活性（镁、铁、锰、锌、钴等）；调节细胞的渗透压和影响细胞膜的通透性（NaCl、KCl等）；参与产物的生物合成等。Ø 对微量元素要求是极微的（ug/ml） 生长因子：是一类微生物维持正常生活不可缺少，且自身又不能合成的微量有机化合物。 维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物以及脂肪酸等 水：是培养基的主要组成成分。&#

30、216; 构成菌体细胞的主要成分Ø 一切营养物质传递的介质Ø 直接参与许多代谢反应 产物形成的诱导物、前体和促进剂：Ø 许多胞外酶的合成需要适当的诱导物存在Ø 前体：被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质Ø 在有些发酵过程中，添加促进剂能刺激菌株，提高产量三、发酵的一般过程以霉菌发酵为例，发酵的一般过程为：培养基原料培养基配制 培养基灭菌 储备种子 摇瓶 种子罐 生产罐 培养液 产品精制、包装产品提抽 无细胞醪液 菌体分离 菌体1、菌种： 菌种来源：Ø 自然界中分离、纯化及选育得到Ø 经基因工程改造后的“工程菌”

31、保持稳定的高产菌株 选育更高产、更高质量的优良菌株2、种子扩大培养：定义：将保存在砂土管、冷冻干燥管或冰箱中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面培养基上活化后，再经过茄子瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种，这个全过程称为种子扩大培养，这些纯种培养物称为种子。 种子制备的方式：Ø 菌丝进罐培养Ø 孢子进罐培养3、发酵：是在无菌状态下对微生物进行纯种培养，本阶段微生物合成大量的产物，是整个发酵工程的中心环节。 要求无菌Ø 培养基Ø 空气Ø 中间补料 发酵条件的控制Ø 温度Ø pH值Ø 罐压Ø

32、 空气流量Ø 搅拌 等等4、下游处理： 发酵结束后，要对发酵液进行分离和提取精制，将发酵产物制成符合要求的成品第三节 液体深层发酵本节主要内容：一 发酵的操作方式二 发酵工艺控制三 发酵设备四 下游加工过程发酵的操作方式 液体深层发酵主要有分批发酵、连续发酵和补料分批发酵三种类型1. 分批发酵定义：营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。 特点：Ø 操作简单，除了控制温度和pH及通气以外，不进行任何其他控制 Ø 从细胞所处的环境看，发酵初期营养物质过多，可能抑制微生物生长；发酵中后期又可能因为营养物减少而降低培养

33、效率 Ø 从细胞的增殖来看，初期浓度低，增长慢；后期浓度高，但营养物浓度低，也生长不快；总的生长能力不是很高。 分批发酵的具体操作过程：Ø 种子培养系统开始工作（空消、实消）Ø 接种（摇瓶种子接入种子罐） Ø 培养（同时进行主发酵罐的准备工作，若为大型发酵罐，则对培养基连消） Ø 种子转移到主发酵罐中Ø 发酵（控制温度、pH值；搅拌和通气）Ø 结束后提取、精制 一个发酵周期：（定义）（重点） 发酵的全过程包括空罐灭菌、加入灭过菌的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐，所需要时间的总和。 微生物分批培养的生长曲线（图） 延滞期：

34、细胞浓度的增加不明显 加速期：（短暂）细胞开始大量繁殖 指数生长期：细胞浓度随培养时间呈指数增长 减速期：细胞的生长速率逐渐下降 静止期（稳定期）：细胞浓度不再增大 衰亡期：活细胞浓度不断下降2. 连续发酵 定义：以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。 特点： 稳定状态可以有效的延长分批培养中的对数期 在稳定状态下，微生物所处的环境条件都能保持相对恒定 微生物细胞的浓度及其比生长速率可维持不变 可根据需要调节生长速度分类：按反应器的形状分类、罐式反应器、管式反应器连续发酵的控制方式 恒浊器（turbidostat）

35、法：Ø 利用浊度来检测细胞的生长状况，通过自控仪表调节输入料液的流量，以控制培养液中的菌体浓度达到恒定值 恒化器（chemostat）法Ø 与恒浊器法相似之处是维持一定的体积，不同之处是菌体的密度不是直接控制的，而是通过恒定输入的养料中某一种生长限制基质的浓度来控制与分批发酵相比，优缺点 优点： 能保持稳定状态，利于微生物的生长代谢 有利于实现机械化和自动化 减少非生产占用的时间 灭菌次数减少，测量仪器探头寿命延长 容易优化工艺，提高发酵产率 缺点： 开放系统，周期长，易染菌 周期长，菌体易变异 对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高 黏性丝状菌不适宜此种发酵方式 原料的利

36、用率较低连续发酵的应用 目前主要用于研究工作中， 工业应用不多 面包酵母的生产 饲料酵母的生产 有机废水的活性污泥处理等3. 补料分批发酵 定义：是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术，又称半连续发酵 特点： 营养物浓度可以较长时间的保持在一定范围 可保证微生物的生长需要，不造成不利影响，从而提高产率 分两种类型：Ø 单一补料分批发酵：在开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始连续补加碳源、氮源和其他的必需基质，直到发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，停止补料，最后将发酵液一次全部放出。ü

37、; 特点：受罐容积的限制Ø 反复补料分批发酵：在单一补料分批发酵的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大操作容积，从而在理论上可以延长发酵周期，直至发酵产率明显下降，才最终将发酵液全部放出。ü 特点：保留了优点，避免了缺点补料分批发酵的优点 同分批发酵相比：Ø 可以解除营养物基质的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖效应；ü 葡萄糖效应：葡萄糖被快速分解代谢，所积累的产物在抑制所需产物合成的同时，也抑制了其它一些碳源、氮源的分解利用。（葡萄糖分解阻遏效应）Ø 可以避免在分批发酵中因糖过多，造成细胞大量生长，耗氧

38、过多，以致通风搅拌设备不能匹配的状况；Ø 可以减少菌体量，提高有用产物的转化率。 同连续发酵相比：Ø 不会产生菌种老化和变异Ø 周期较短，染菌的机率较小Ø 适用范围最广二、发酵工艺控制 反映发酵过程变化的参数有两类：Ø 直接参数：可以直接采用特定的传感器检测的参数，包括反映物理环境和化学环境变化的参数。 如温度、压力、搅拌功率、转速、泡沫、发酵液粘度、浊度、pH值、离子浓度、溶解氧、基质浓度等Ø 间接参数：难于用传感器检测的参数。 如细胞生长速率、产物合成速率和呼吸商等 对发酵过程影响较大的主要有： 温度、pH值、溶解氧浓度1、温度

39、温度对发酵过程的影响：Ø 酶反应速率 ü T速率 (酶反应常数k)产物生成衰老速率 在温度相对范围内 Ø 发酵液中的溶解氧 发酵ü 25 1大气压，纯水中溶解氧为0.25mmol/l在发酵液中为0.20mmol/l. ü 一般情况T溶解氧下降。 Ø 影响微生物的合成方向ü 同一微生物，不同温度，发酵产物不同。ü 金色链霉菌温度低（<30）时产金霉素，温度高（>30）时产四环素。 ü 谷氨酸发酵：32-36 是谷氨酸；36 以上是乳酸Ø 影响微生物酶系及酶特性 ：Ø 酪液的理

40、化性质，如粘度、渗透压等最低、最适、最高生长温度 最适发酵温度：该温度范围内最适宜于微生物的生长以及产物的形成。Ø 菌种不同，最适温度不同；(如bacteria、yeasts)Ø 培养条件、菌体的生长阶段不同，最适温度不同 （如terramycin fermentation） 最低、最高生长温度影响温度变化的因素（了解） 生物热 、搅拌热 、蒸发热、辐射热等 Q 发酵=Q 生物+Q 搅拌-Q 蒸发±Q辐射 温度的控制：通过热水、冷水或蒸汽等 调节2、pH值pH值与微生物之间的关系Ø 不同种类的微生物对pH要求不同 ü 细菌 6.8-7.5 放线

41、菌 6.8-8.8 üØ 同种微生物在不同的pH条件下产物不同ü 酵母菌：酒精（pH3.0-4.0）、甘油（pH7.0-7.5）ü 黑曲霉：柠檬酸（pH2.0-3.0）、草酸（pH7.0）Ø 发酵的不同阶段微生物的最适pH不同 ü 土霉素发酵：生长繁殖pH6.0-7.5，代谢pH5.5左右Ø 对微生物生长和产物合成的影响：ü 酶的活性ü 细胞膜所带电荷的状态 改变通透性ü 酪液中物质的电离 影响此物质利用ü 改变菌体代谢的方向ü pH可以影响某些霉菌的形态（出芽短梗霉 影响p

42、H变化的因素 pH值的变化取决于微生物的种类、发酵条件和培养基的组成Ø 菌种：产酸、产碱代谢Ø 培养基成分：ü 基质利用不彻底，有机酸积累，pH下降ü 基质中酸性物质或碱性物质含量高，ü 氮源被利用，pH上升Ø 发酵条件：T高，代谢快，pH下降等发酵过程中pH的控制 Ø 培养基原始pH值调节ü 变化大，加缓冲液ü 无机盐的比例（如磷酸盐、碳酸钙等）üØ 发酵过程中pH值调节ü 流加弱酸弱碱 ü 补加生理酸性物质（如硫酸铵）和生理碱性物质（如氨水）ü 补料：

43、如青霉素发酵利用补加葡萄糖的速率控制pH3、溶解氧浓度 对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一两个概念 呼吸强度QO2：单位重量的干菌体在单位时间内所消耗的氧的mmol量。 耗氧速率：单位时间内单位体积的培养液所消耗的氧的mmol量。 溶解氧对发酵的影响 不同微生物需氧量不同，20-80 mmol/L·h 青霉素40-45mmol/L·h 链霉素 45-50 mmol/L·h 同种微生物在不同菌龄，需氧量不同 幼龄菌 （时间概念）正在繁殖状态，浓度小 对数生长期：繁殖茂盛，耗氧速度大 稳定期：耗氧较大，稳定 晚龄期：主要生长代谢产物，耗氧小 发酵的不同阶段，需

44、要量不同 谷氨酸：生长13mmol/L·h，代谢50mmol/L·h 受酪液中溶解氧的限制临界氧浓度：某种MO对环境中的氧有最低的溶氧要求 发酵过程中溶解O2的变化 （图）Ø 前期：大量繁殖，需氧量增加，溶解氧下降Ø 中期：需氧量稳定Ø 后期：需氧量下降，溶解氧上升 影响氧溶解的因素 （重点）Ø 搅拌与挡板 Ø 线速度 ：在一定范围内醪液中溶解氧与线速度呈正比 Ø 空气分布管 Ø 氧的分压 ：分压越大溶解氧效果越好 Ø 发酵罐内液注高度 ：（一般为70）Ø 发酵罐体积 ：体积越大，溶氧

45、越好Ø 发酵液的物理性质 ：浓度、粘度、表面张力等Ø 发酵过程中溶解氧的控制 供氧：将空气中氧气溶解在发酵液中的过程耗氧：微生物在其生长代谢过程中所消耗的溶解在醪液中的氧的过程控制供氧与耗氧平衡三、 发酵设备定义：进行微生物深层培养的设备统称 为发酵罐，又叫生物反应器。作用：为细胞代谢提供一个适宜的物理及 化学环境，使细胞能更快更好地生长，并得到更多需要的生物量或代谢产物。生物反应器是发酵工程中最重要的设备之一：一般生化反应过程 空气 细胞或酶等生物催化剂 除菌 CO2等 监测和控制 （游离或固定化） 生物反应器 冷却水 原材料 培养基 灭菌 产物预处理 废物 产品提取或液

46、化 产物 副产物 废物由图可见，生物反应器在生物过程中，具中心作用，是实现产品产业化的关键设备，是连接原料和产物的桥梁。反应器中，通过产物合成，廉价原料被升值了。生物反应器的设计和操作，是生物工程中一个及其重要的问题，对产品成本和质量有很大影响。 1、生物反应器设计的目标和原则 一个优良的生物反应器应具备的条件：Ø 严密的结构Ø 良好的液体混合性能Ø 高的传质和传热速率Ø 灵敏的检测和控制仪表 判断生物反应器好坏的唯一标准是：该装置能否适合工艺要求以取得最大的生产效率。2、生物反应器的分类 根据微生物与氧的关系分： 机械搅拌式发酵罐 Ø 好氧发

47、酵设备 通风搅拌式发酵罐Ø 厌氧发酵设备机械搅拌式发酵罐 是发酵工厂常用的类型之一； 利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促进氧的溶解，以保证供给微生物生长繁殖和代谢所需的溶解氧。 典型的有：Ø 通用式发酵罐和自吸式发酵罐 通用式发酵罐的基本条件 发酵罐应具适宜高径比（一般高径比为1.74倍）  发酵罐能承受一定压力发酵罐搅拌通风装置能使气液充分混合，保证发酵液 必须的溶解氧发酵罐应具足够冷却面积。微生物生长代谢过程放出大量热量必须通过冷却来调节不同发酵阶段所需温度发酵罐应尽量减少死角，避免藏垢积污，灭菌彻底 搅拌器轴封应严密，尽量减

48、少泄漏发酵罐的部分部件机械搅拌的作用：（重点）Ø 打碎空气气泡，增加气液接触面积，以提高气液间的传质速率；Ø 使发酵液充分混合，液体中的固形物料保持悬浮状态。传热装置：有夹套（<5吨）和蛇管（>5吨）两种搅拌器分平叶式、弯叶式、箭叶式三种，国外多用平叶，我国多用弯叶。 其作用是打碎气泡，使空气与溶液均匀接触，使氧溶解于醪液中。挡板的作用：改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体激烈翻动，增加溶解氧。消泡器消泡器的作用是将泡沫打破。最常用的形式有锯齿式、梳状式及孔板式。孔板式的孔径约1020mm。空气分布装置单管式分布装置：管口正对罐底中央，与罐底的距离约40

49、mm，这样的空气分散效果较好。环形管的分布装置：以环径为搅拌器直径的0.8倍较有效，喷孔直径为58mm，喷孔向下，喷孔的总截面积约等于通风管的截面积。空气流速取：20m/sec轴封 （2）自吸式发酵罐 是一种不需要空气压缩机，而在搅拌过程中自吸入空气的发酵罐。 应用：Ø 医药工业、酵母工业、生产葡萄糖酸钙、力复霉素、维生素C、酵母、蛋白酶等。取得了良好的成绩。工作原理： 1. 搅拌器中央带吸气口 2.搅拌器由从罐底向上伸入的主轴带动 3.叶轮旋转时叶片不断排开周围的液体使其背侧形成真空，于是将罐外空气通过搅拌器中心的吸气管而吸入罐内， 4.吸入的空气与发酵液充分混合后在叶轮末端排出，

50、 5.通过导轮向罐壁分散，经挡板折流涌向液面，均匀分布。 6.空气吸入管通常用一端面轴封与叶轮连接，确保不漏气。 优点：Ø 气液接触良好，提高了氧的溶解速率Ø 虽搅拌功率大，但总体能耗较少 缺点：Ø 对空气除菌装置要求高（普通过滤器阻力大）Ø 进罐空气处于负压，易染菌Ø 搅拌转速太高，可能切断菌丝，影响菌体正常生长通风搅拌式发酵罐 通风的目的：Ø 供给微生物所需要的氧气Ø 利用通入的空气代替搅拌器使发酵液均匀混合 分类：Ø 循环式通风发酵罐Ø 高位塔式发酵罐 循环式通风发酵罐是利用空气的动力使液体在循环管

51、中上升，并沿着一定路线进行循环。（空气带升式发酵罐或带升式发酵罐） 高位塔式发酵罐（略）厌氧发酵设备厌氧发酵也称静止培养，不需供氧，设备和工艺都较好氧发酵简单。Ø 严格的厌氧液体深层发酵的主要特色：ü 排除发酵罐中的氧ü 罐内的发酵液应尽量装满，以便减少上层气相的影响，有时还需充人非氧气体ü 发酵罐的排气口要安装水封装置ü 厌氧发酵需使用大剂量接种（一般接种量为总操作体积的10%20%），使菌体迅速生长，减少其对外部氧渗入的敏感性。厌氧发酵的应用Ø 酒精、丙酮、丁醇、乳酸和啤酒等四、下游加工过程定义：从发酵液中分离、精制有关产品的过程

52、。（提炼）目的：将目的产品从发酵液中分离出来并纯化，制成成品1. 发酵液的理化性质 组成：菌体细胞、代谢产物和剩余培养基等 黏度通常很大，分离固体物质很困难 发酵产品在发酵液中浓度很低 产品与其他物质共存于胞内或胞外，形成复杂的混合物 产品通常很不稳定，遇热、极端pH值、有机溶剂会分解或失活2. 提炼工艺需考虑 发酵液的理化性质 发酵是分批操作，各批次不尽相同，要求工艺有弹性 对待染菌批次也要能处理 提纯的产品要求纯度较高故：下游加工过程是最重要、成本费用最高的环节，如抗生素、乙醇、柠檬酸等占总投资60%3. 提炼工艺一般分四个阶段Ø 发酵液预处理和固液分离Ø 提取

53、6; 精制Ø 成品加工4.提炼工艺的一般流程图：发酵液 预处理（加热 调pH、絮凝）细胞分离（过滤、离心分离、错流过滤）细胞破碎（匀化、研磨） 胞外产物细胞碎片分离（离心分离、错流过滤、两水相萃取）初步纯化（沉淀、吸附、离子交换、萃取、超滤）（提取）高度纯化（沉淀、超滤、层析分离、结晶）（精制）成品加工（浓缩、无菌过滤、干燥）5. 提炼工艺的具体操作阶段发酵液预处理和固液分离Ø 预处理目的：改善发酵液的性质，以利于固液分离。ü 预处理：常用酸化、加热、加絮凝剂ü 固液分离：常用过滤、离心Ø 目的产物在胞内：先对细胞进行破碎ü 实验室方法：机械、生物、化学ü 工业方法：高压匀浆机、球磨机ü 细胞碎片分离：离心，两水相萃取提取Ø 目的产物的环境：存在于滤液或离心上清液中，液体体积很大，浓度 很低Ø 目的：主要是浓缩，也有纯化作用Ø 常用方法：Ø 吸附法：大网格聚合物、活性炭等