NSCLC侵袭转移与CXCLl2-CXCR4生物学轴关系的研究完整版课题

1、NSCLC侵袭转移与CXCLl2-CXCR4生物学轴关系的研究一 课题根据【1】 本题的理论及实际意义1） 理论 肿瘤的浸润和转移是连续的过程，各阶段的时间和具体表现依肿瘤细胞不同的生物学特性而异，肿瘤细胞运动和黏附能力及其相关分子生物学的变化存在着一定的规律性。在转移的始动阶段，肿瘤细胞的黏附能力下降；使瘤细胞易从原发灶脱落，开始转移。此阶段的生物学变化有：细胞间连接蛋白表达明显下降，钙黏着蛋白表达下降，黏附分子表达的变化等。转移的第二阶段，即肿瘤细胞转运，附壁阶段，肿瘤细胞在到达血窦或靶组织附近的毛细血管后，需增加某些黏附分子介导的与血小板，血管壁等的黏附。转移的第三阶段，即继发瘤形成阶段

2、。转移的第四阶段，以新生血管长入为主要的特征。显然转移、浸润的分子事件是一复杂的特定的过程，有待进一步阐明。趋化因子(Chemokines)是一类最早发现与免疫细胞具有控制细胞向炎症定向迁移的细胞因子，在调控免疫细胞分化、发育及定向迁移过程中起重要作用。研究显示，趋化因子及其受体不仅表达于免疫细胞，在某些肿瘤细胞也呈高表达，并且与肿瘤转移密切相关。CXCR4在肿瘤中的作用已分别在乳腺癌、非小细胞肺癌、横纹肌肉瘤中得到证实。目前已经发现几十种趋化因子，根据半胱氨酸残基位置不同，趋化因子分为4个亚族：C、CC、CXC与CX3C，相应的受体称为XCR、CCR、CXCR与CX3C。CXC族趋化因子受体

3、4(CXCR4)是CXC趋化因子家族成员基质细胞衍生因子1（SDF-l/CXCL12）的惟一受体，而SDF-1也是CXCR4的唯一配体。趋化因子受体CXCR4属于G蛋白耦联7次跨膜受体，广泛表达在许多细胞表面，与其配体CXCL12构成生物学轴，参与调节许多生物学活性作用，不仅调节胚胎发育、干细胞归巢和组织器官的损伤修复，而且与许多疾病的发生和发展有关，成为一些疾病治疗的分子靶目标。CXCLl2-CXCR4生物学轴是指由趋化因子CXCLl2与其特异性受体CXCR4相互作用而构成的一个与细胞间信息传递、细胞迁移有密切关系的偶联分子对。其实质在于CXCR4对其配体CXCL12的高度亲和力和绝对特异性

4、，即CXCR4作CXCLl2的专属受体(specific receptor)而存在。这区别于可兼与CCL3(MIP一1A）、CCL4(MIPlB)、CCL5(RANTES)结合的CCR5等共享型受体(sharedceptor)。CXCL12又称基质细胞衍生因子一1(strormal cell-derivcd factor，1，SDF一1)或前B细胞刺激因子(PBSF)，属于CXC族趋化因子成员，分子内无谷-亮一精氨酸(ELR)基序。人CXCLl2对T淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞等均有趋化作用，而这些细胞也都表达CXCR4。CXCLl2虽为ELR CXC族趋化困子，但有促血管生成的

5、作用。 SDF一1及其受体CXCR4与肿瘤生物学为：参与细胞增殖、生存与凋亡【1】参与血管管形成【2】；参与降解基质和基底膜酶【3】；参与细胞粘附【4】；参与肿瘤器官特异性转移【4】；参与肿瘤预后【5】。CXCLl2-CXCR4生物学轴介导肿瘤器官特异性转移的机制：CXCLl2一CXCR4生物学轴在肿瘤组织器官特异性转移中的作用虽已在多种肿瘤研究中得到证实，但其机制仍不清楚。目前人们只是对CXCLl2与CXCR4结合后转移性癌细胞的细胞生物学行为及细胞内某些相关分子的改变有一定程度的了解。CXCR4与其配体CXCLl2的结合可引起乳腺癌细胞内骨架蛋白的聚合与再分布，随后调节细胞的运动和迁移。体

6、外实验中用激光共聚焦显微镜观察到，100nmdL的CXCL12在20秒内便可使乳腺癌细胞内的丝状肌动蛋白(F_肌动蛋白)增加22倍，使细胞形成明显的伪足，并直接呈剂量依赖性诱导乳腺癌细胞定向迁移和侵袭，抗CXCR4抗体可阻断这一效应。近年来，对趋化性细胞因子及其受体的研究取得了令人瞩目的进展。趋化性细胞因子通过与受体结合，对免疫细胞在体内的迁移、活化和分布起重要作用，并参与免疫应答的调控。最新研究表明，一些趋化性细胞因子及受体与癌症的发展及转移密切相关。以往的研究发现CXCR4在不同来源肿瘤中的表达方式是不同的，在肝癌、消化道肿瘤中CXCR4表达通常是降低的，而在胶质瘤、乳腺癌、肾癌等中CXC

7、R4表达上调。CXCR4上调表达见于肺癌转移形成的早期阶段，提示CXCR4的高表达可能是判定肺癌是否发生转移的一个指标。CXCR4在肿瘤中的作用已分别在乳腺癌、非小细胞肺癌、横纹肌肉瘤中得到证实。 目前报道肺癌侵袭与转移与趋化因子受体4(CXCR4)有相关性，进一步研究CXCR4其发生机制认为CXC族趋化因子受体4(CXCR4)是CXC趋化因子家族成员基质细胞衍生因子1（SDF-l/CXCL12）的惟一受体，而SDF-1也是CXCR4的唯一配体。CXCLl2-CXCR4生物学轴在肺癌侵袭与转移作用的研究成为本课题研究的对象。但CXCR4的高表达在某种程度上决定了肺癌细胞的转移能力还是肺癌转移过

8、程中伴随着CXCR4表达的升高，我们尚不清楚【6】。2）实际意义 目前肺癌诊断的标记物已用于临床如：CEA、CYFRA21-1、NSE，并进一步开发敏感和准确度高的分子标记物。对于已发生肺癌的转移目前影像学诊断有较高敏感度和准确度如：PET、纵隔镜检查。但对肺癌的侵袭与转移的早期诊断还未出现，其研究目的及方向在于找出诊断肺癌早期淋巴结转移的分子标记物。这将为临床诊断肺癌早期转移及治疗提供有效途径。一方面可弥补纵隔镜淋巴结活检不足之处，另一方面可明确有无淋巴结转移，在行肺癌肿块切除术时可避免过多淋巴结清扫同时可避免遗漏已发生转移的淋巴结。应用western blot、免疫组字化学检测肺癌组织中C

9、XCR4/CXCL12表达及在细胞水平的分布，论证肺癌组织与癌旁肺组织在表达水平上的差异，从而推论此水平的表达能否作为肺癌侵袭及转移的指标，抑制此水平的表达能否降低肺癌的转移能力。【2】目的和要解决的问题本实验采用定量、定位的方法检测肺癌组织与癌旁肺组织CXCR4阳性表达差别，进一步明确这种差别在量上有无意义。 CXCR4高表达能否成为临床上肺癌转移的一个参考指标。 【3】国内外研究概况对于SDF-1/CXCR4信号系统的研究主要集中在免疫系统，研究表明它在造血干细胞归巢、淋巴细胞迁移和 HIV感染等方面发挥着重要作用【7,8】 。近年来研究发现，某些肿瘤细胞可以局限性地表达一些趋化因子和趋化

10、因子受体如IL-8、MCP-1、CXCR4和CCR7 等，为趋化因子及其受体参与肿瘤细胞侵袭和转移提供了直接或间接的证据 9,10。 Muller【11】表明，乳腺肿瘤细胞较正常乳腺细胞表达明显增高，其特异性配体SDF-1 与乳腺肿瘤细胞CXCR4结合后，可转导调节肌动蛋白聚合和伪足形成的信号，从而导致肿瘤细胞趋化和侵袭，而功能性阻断这一受体可以抑制肿瘤的转移他们的研究结果表明趋化因子信号途径在乳腺癌转移中的重要作用。基于以上研究，我们推断一些不同的癌细胞亦可能通过途径介导它们的转移12,13 ，有人检测分析了CXCR4在人肺癌高、低转移细胞的表达和其体外转移潜能的关系。通过，我们检测到人肺癌

11、高转移细胞株较高水平地表达趋化因子受体 CXCR4mRNA。细胞的运动性、增殖率是评价肿瘤细胞体外转移潜能的其中两个指标。SDF-1/CXCR4的相互作用与细胞迁移运动有关，这可能是 SDF-1/CXCR4的相互作用激发了细胞内信号传导，导致下游效应分子的聚集，使细胞内骨架蛋白重排，从而诱导了细胞的趋化迁移14。有研究结果证明了在人肺癌细胞上功能性地高表达， 与其配体 的相互作用可能在其侵袭转移中发挥着重要作用，因此推断抑制肿瘤细胞表面的表达，干扰的相互作用可能是抗肿瘤侵袭转移的一个比较有意义的靶点和策略。这有待于进一步的深入研究。肿瘤的生长、侵袭和转移必须依赖于血管生成(angiogenes

12、is)，近来研究发现，肿瘤干细胞在新生血管形成中发挥着重要作用，CXCR4是具有侵袭性肿瘤干细胞的重要表面标志15。在体外研究中，阻断CXCR4特异性配体CXCLl2可以下调结肠癌细胞CT226表面CXCR4表达，导致肿瘤细胞向肝、肺转移的数量显著减少或被完全阻断【16】。Phillips【17】证实肺癌的器官特异性转移中也发挥重要作用。手术切除的NSCLC组织和细胞系(A549和CALv_1)均表达CXCR4，但不表达CXCLl2。在CXCLl2的刺激下，CXCR4阳性的NSCLC细胞系会发生趋化反应，而在倾向于转移的靶器官如肾上腺、骨髓、肺和肝中CXCLl2的表达高于原发肿瘤组织和血清，由

13、此形成该趋化因子的浓度梯度。在小鼠的A549移植瘤模型用CXCLl2特异性抗体可显著性地抑制原位肿瘤向肺中其他部位的转移，而原位肿瘤的大小、增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞的数目均无改变，肿瘤源性的血管生成活性也未受影响。国内多次报道CXCR4在肺癌组织的表达相关文章，其结论多认为CXCR4表达的上调与肺癌淋巴结转移相关。二 实验设计，方法及步骤 实验部分一组织样本 收集本院61例肺癌组织及组织切片由武汉大学人民医院胸外科和武汉大学人民医院病理科提供，并以癌旁正常肺组织（61例）作对照。方法 应用western blot检测肺癌组织中CXCR4/CXCL12表达主要试剂 PVDF膜 预染标准

14、相对分子质量蛋白 ECL化学发光试剂 浓缩蛋白分析液 抗体目的 检测趋化性因子受体CXCR/CXC12信号转导通路在肺癌组织、癌旁肺组织及转移淋巴结中的表达情况实验部分二组织样本 收集本院61例肺癌组织及组织切片由武汉大学人民医院胸外科和武汉大学人民医院病理科提供，并以癌旁正常肺组织（61例）作对照。方法 免疫组织化学法 主要试剂 鼠抗人CXCR4单克隆抗体 EnVision反应液目的 检测CXCR4/CXCL12在细胞水平的分布三 进度，预期结果 （1）进度2010.32010.4 查阅相关文献 2010.42010.9 实验阶段 2010.92011.4 论文写作 （2）预期结果 应用we

15、stern blot、免疫组织化学法检测肺癌组织中 CXCR4/CXCL12表达及在细胞水平的分布，论证肺癌组织与癌旁肺组织 在表达水平上的差异，进而将这种差异纳入影响肺癌侵袭与转移的因素之一进行对比分析，用统计学方法算出其差异有无意义。从而推论此水平的表达能否作为肺癌侵袭及转移的指标。该实验能为以后研究奠定基础，为进一步研究CXCR4/CXCL12生物轴在肺癌中的作用机制提供平台，因为CXCR4的高表达在某种程度上决定了肺癌细胞的转移能力还是肺癌转移过程中伴随着CXCR4表达的升高，我们尚不清楚。若顺利完成实验，可在国内核心期刊发表文章1-2篇。四 实验条件基本掌握western blot检

16、测、免疫组织化学法技术。武汉大学第一临床学院中心实验室、武汉大学医学部免疫系实验室、结构中心支持。五 困难与挑战 病理标本量大，收集困难，需要胸外科、病理科及病案室等科室积极有效提供支持，提前做好病理组织的收集并妥善管理并短时间收集足量标本及时做好组织包埋、切片、染色。本课题开展前熟练掌握western blot、免疫组织化学法技术，从技术层面排出假阳性、阴性结果。六 参考文献1 Orimo A,Gupta PB,Sgroi DC,et al.Stromal fibrolasts present in invasive human breastcarcinomas promote tumor

17、growth and angiogenesisthroughelevatedSDF-1/CXCL12secretionJ.Cell,2005,121(3):335-348.2 Kryczek I,Lange A，Mottram P，et al.CXCL12 and vascular endothelial growth factor synergistically induce neoangiogenesis in human ovarian cancers J.Cancer Res,2005,65(2):465-472.3 Sutton A,Friand v,Brule-Donneger S

18、,et al.Stromal cell derived factor-1/chemokine(C-X-C Motif)ligand 12 stimulates human hepatoma cell growth,mirgration,and invasionJ.Cancer Res,2007,5(1):21-33.4 Azenshtein E,Luboshits G,Shina S,et, al. Involvement of chemokine receptor4/stromal cell-derived factor 1 system during osteosarcoma tumor

19、progressionJ.Clin Cancer Res,2006,11(6):490-497.5 Ritz MM,Sidhu SS,Blaveri E,et al.CXCR4 expression reflects tumor progression and regulates motility of bladder cancer cellsJ.Nat Immun,2005,6(10):1038-1046.6 苏丽萍，等CXCR4在肺癌组织中的表达及临床意义-中国癌症杂志2005（15）.7 Kim C H,Broxmeyer H E. SLC/exodus2/6Ckine/TCA4 ind

20、uces chemotaxis of hematopoietic progenitor cells:differential activitu of ligands of CCR7,CXCR3, or CXCR4 in chemotaxis vs suppression of progenitor proliferation J.J Leuk Biol,1999;66:455-461.8 Bleu C C,Farzan M, Choe H et al.The lymphocyte chemoattractantSDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and bloc

21、ks HIV-1 entry J.Nature, 1996;382;829-833.9 Norgauer J,Metzner B,Schraufstatter I.Expression and growth-promoting function of the IL-8 receptor beta in human melanoma cells J.J Immunol,1996;1569(3):1132-1137.10 Masahiro O,YASUHIKO K,Shinji T et al.Monocyte chemoattractan protein-1 expression correla

22、tes with macrophage infiltration and tumor vascularity in human esophagesl squamous cell carcinomas J.Int J Cancer,2002;102;220-224.11 MullerA.HomeyB,SotoH,etal.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis.Nature,2001,410(6824):50-56.12 Liotta L A.An attractive force in metastasis J.Naure,2001;410;24-25.13 Murphy P M.Chemokines and the molecular basis of cancer metastasis J.N Engl j Med,2001;345:833-835.14 Ramesh K,Stephanie A,Joshua M et al. The a-chemokine,stromal Cill derived fctor-1a,Binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and acti