微透析液相色谱化学发光联用微透析技术应用于中药药动学的研究(张群林)

1、微透析微透析- -液相色谱液相色谱- -化学发光联用化学发光联用技术应用于中药药动学的研究技术应用于中药药动学的研究安徽医科大学药学院安徽医科大学药学院张群林张群林 副教授副教一一个人简历个人简历二二化学发光技术化学发光技术三三液相色谱液相色谱化学发光联用技术化学发光联用技术四四微透析在体采样技术微透析在体采样技术五五丹参药动学研究丹参药动学研究3ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY个人简历个人简历1992.9-1996.6 沈阳药科大学中药系沈阳药科大学中药系1996.7-2000.8 安徽省药物研究所中药

2、新药研发安徽省药物研究所中药新药研发2000.9-2005.6 中国科学技术大学获分析化学博士学位中国科学技术大学获分析化学博士学位 （导师：崔华教授）（导师：崔华教授）2005.7 “安徽医科大学引进人才安徽医科大学引进人才”2005.7现在现在 药学院药物分析教研室药学院药物分析教研室 2006.8 任副教授、硕士生导师、中青年学术带头人任副教授、硕士生导师、中青年学术带头人 2009.7 任教研室主任任教研室主任 化学发光化学发光1作为一种自然现象很早就为人类所注意作为一种自然现象很早就为人类所注意 18771877年，年，Radziszewski2 证实在乙醇证实在乙醇KOH溶液中洛粉

3、溶液中洛粉碱碱( (Lophine, 2,4,5-2,4,5-三苯基咪唑三苯基咪唑) )被被H2O2等氧化发出绿等氧化发出绿光光 十九世纪末期，德国科学家十九世纪末期，德国科学家Wiedemann3首次解释了化首次解释了化学发光的机制学发光的机制1 B. T. P. Whitehead, L. J. Kricka, et.al. Clin. Chem. 25 (1979) 1531. 2 B. Radziszewski, Chem. Ber. 10 (1877) 70. 3 E. Wiedemann, Ann. Phys. Chem. 34 (1888) 446. 化学发光现象是一种相对简单的

4、有机反应过程化学发光现象是一种相对简单的有机反应过程 化学发光化学发光(Chemiluminescence, CL)4 R. Dubois, Acad. Sci. 132 (1901) 431. 5 K. van Dyke, F. McCapra, I. Behesti, Bioluminescnece and Chemiluminescence, Instruments and Applications. Vol 1. FL: CRC Press, 1985. 6 K. Gleu, Z. Petsch. Angew. Chem. 48 (1935) 57. 1901年，法国生物学家年，法国生

5、物学家Dubois4引入了荧光素引入了荧光素( (Luciferin)和荧光素酶和荧光素酶(Luciferase) 的概念的概念 19021902年，年，Schmitz合成发光试剂鲁米诺合成发光试剂鲁米诺( (Luminol) ), ,它曾被它曾被广泛用于血迹鉴定；广泛用于血迹鉴定；1928年年, ,Albrecht 观察到鲁米诺在碱观察到鲁米诺在碱性介质中的化学发光行为性介质中的化学发光行为5 1935年年, ,Gleu和和Petsch6报道了光泽精报道了光泽精(Lucigenin)与与H2O2反反应产生化学发光应产生化学发光 这些发光试剂的合成，对于化学发光发展为分这些发光试剂的合成，对于

6、化学发光发展为分析化学的一种重要手段起到了非常重要的作用析化学的一种重要手段起到了非常重要的作用 化学发光化学发光(CL)的发展历史的发展历史 由于大多数化学发光非常微弱，且稍纵即逝，早期的化学由于大多数化学发光非常微弱，且稍纵即逝，早期的化学发光研究主要集中在对化学发光反应现象的观察和反应机发光研究主要集中在对化学发光反应现象的观察和反应机理的探讨上，其发展一直比较缓慢。理的探讨上，其发展一直比较缓慢。 19451945年出现了光电倍增管，年出现了光电倍增管，19501950年出现了商品化的化学发年出现了商品化的化学发光检测装置光检测装置 到了八十年代，随着生命科学、环境科学和材料科学的兴到

7、了八十年代，随着生命科学、环境科学和材料科学的兴起，化学发光才被真正应用于分析化学并迅速得到了发展起，化学发光才被真正应用于分析化学并迅速得到了发展目前，化学发光分析的研究和应用已成为当前目前，化学发光分析的研究和应用已成为当前微量和痕量分析领域一个十分重要的研究方法微量和痕量分析领域一个十分重要的研究方法 化学发光化学发光(CL)的发展历史的发展历史化学发光化学发光(CL)的优点的优点1.1.灵敏度极灵敏度极高高 荧光素酶和磷酸三腺甙荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可的化学发光分析，可 测定测定2 10-17 mol/L的的ATP，即可检测出一个细菌中，即可检测出一个细菌中 的

8、的ATP含量含量2.2.线性范围宽线性范围宽 至少二个数量级以上至少二个数量级以上3.3.仪器设备简单仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正不需要光源、单色器和背景校正4.4.分析速度快分析速度快 多数化学发光反应是快速反应，在瞬间或几秒即多数化学发光反应是快速反应，在瞬间或几秒即 可完成可完成, 100 samples h-15.5.易于自动化易于自动化 适合与适合与HPLC和和HPCE等其它的分离技术联用，作等其它的分离技术联用，作 为其高灵敏度的检测器为其高灵敏度的检测器 化学发光化学发光(CL)的基本原理的基本原理 化学反应释放出的化学能激发产物分子或体系共存的其它化学反应释放出的

9、化学能激发产物分子或体系共存的其它分子，这些分子分子，这些分子由激发态回到基态时产生光辐射的现象。由激发态回到基态时产生光辐射的现象。一一. . 化学反应必须释放出足够的能量可以使某种反应产化学反应必须释放出足够的能量可以使某种反应产物或中间体到达激发态；物或中间体到达激发态；二二. . 反应历程必须有利于形成激发态产物；反应历程必须有利于形成激发态产物；三三. . 这种激发态物质必须具有一定的发光量子效率，或这种激发态物质必须具有一定的发光量子效率，或者能够将其能量转移给共存的某种荧光物质，产生者能够将其能量转移给共存的某种荧光物质，产生光辐射。光辐射。 化学发光化学发光(CL)的必须条件的

10、必须条件化学发光化学发光(CL)的基本类型的基本类型q直接化学发光直接化学发光q间接化学发光间接化学发光 化学发光化学发光(CL)的定量原理的定量原理定量原理定量原理：在化学发光分析中，被分析物相在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于发光试剂小得多，对于一级对于一级动力学反应：动力学反应： dc/dt =Kc定量依据：定量依据：（1 1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性（2）在一定条件下，在一定条件下，曲线下面积为发光总强度曲线下面积为发光总强度(S)，其，其与与 被测物浓度成线性被测物浓度成线性 cttcttIAttcl0c

11、l0cldddd 化学发光化学发光(CL)的常见反应体系的常见反应体系& 鲁米诺及其衍生物发光体系鲁米诺及其衍生物发光体系& 吖啶类发光体系吖啶类发光体系 & 四价铈发光体系四价铈发光体系 & 其它发光体系其它发光体系 & 复杂体系中低含量物质的检测复杂体系中低含量物质的检测分析化学挑战之一分析化学挑战之一& 高选择性和高灵敏度的分析技术高选择性和高灵敏度的分析技术& 化学发光是高灵敏分析技术，灵敏度可与质谱媲美化学发光是高灵敏分析技术，灵敏度可与质谱媲美& 分布广泛、疗效确切的黄酮，易于发生氧化还原反应分布广泛、疗效确切的黄酮，

12、易于发生氧化还原反应前期工作基础前期工作基础液相色谱液相色谱化学发光（化学发光（HPLC-CL）联用技术）联用技术分析中药黄酮成分分析中药黄酮成分ChemiluminescenceProducing light with chemicals 化学发光化学发光(Chemiluminescence)技术技术液相色谱液相色谱-化学化学发光联用技术发光联用技术 发光新体系发光新体系 规律和机理规律和机理中药材中药材指纹图谱指纹图谱（复方）制剂（复方）制剂中药药动学中药药动学 葛根素注射液中葛根素含量的测定葛根素注射液中葛根素含量的测定OOOHHOOOHHOHOHOPuerarin首次报道化学发首次报道

13、化学发光法测定葛根素光法测定葛根素Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2004, 36(3): 587592 草豆蔻中豆蔻明含量的测定草豆蔻中豆蔻明含量的测定OHOHOOCH3Cardarmonin首次报道化首次报道化学发光法测定学发光法测定豆蔻明豆蔻明Phytochemical Analysis, 2005, 16(1-2): 440-445.中药沙棘制剂中的三种黄酮含量的测定中药沙棘制剂中的三种黄酮含量的测定 沙棘沙棘( (Hippophae rhamnoides L.)是胡颓子科沙棘属的植物，主要是胡颓子科沙棘属的植物，主

14、要种植于中国的北方和西南地区。种植于中国的北方和西南地区。它是一种传统的中草药，很早以它是一种传统的中草药，很早以前就被人们用于止咳、助消化、前就被人们用于止咳、助消化、促进血液循环和止痛。沙棘油还促进血液循环和止痛。沙棘油还可以治疗皮肤病和血栓可以治疗皮肤病和血栓。 300510152025300.00.20.40.60.81.0QUKAISTime (min)Absorbance (a.u.)a05101520253050010001500200025003000ISKAQUTime (min)Relative CL Intensity (a.u.)b图图2 槲皮素、山萘酚和槲皮素、山萘酚

15、和异鼠李素标准化合物的异鼠李素标准化合物的DAD(a) 和和CL(b)检测色检测色谱图谱图QU, IS: 4.5 10-7 g mL-1 KA: 2.0 10-7 g mL-1051015202530400800120016002000ISKAQUTime (min)Relative CL Intensity (a.u.)a0510152025304008001200160020002400ISKAQUTime (min)Relative CL Intensity (a.u.)b图图3 3 心达康胶囊心达康胶囊(a)和沙棘颗粒和沙棘颗粒(b)样品样品中中三种黄酮醇的三种黄酮醇的CL检测色谱图检

16、测色谱图 Journal of Separation Science, 2005, 28(11): 1117-1256.图图4 二十种黄酮和酚类化合物的化学发光检测色谱图二十种黄酮和酚类化合物的化学发光检测色谱图首次报道能同时响应化合物首次报道能同时响应化合物种类最多的种类最多的CL检测器检测器Journal of Chromatography A 2005, 1095, 94-101.v 黄酮具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等显著药理作用，受到黄酮具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等显著药理作用，受到国内外医药界的广泛重视，但其药动学研究资料的缺乏，制国内外医药界的广泛重视，但其药动学研究资料的缺乏，

17、制约了黄酮类新药的研发与体内作用机制研究约了黄酮类新药的研发与体内作用机制研究v 生物样品中痕量黄酮的高通量、高灵敏分析技术是研究药动生物样品中痕量黄酮的高通量、高灵敏分析技术是研究药动学的基本前提学的基本前提v 中药药动学研究所面临的生物样本具有药物含量低（样品中中药药动学研究所面临的生物样本具有药物含量低（样品中的中药成分浓度常在的中药成分浓度常在ng / mL水平或以下）、药物浓度变化范水平或以下）、药物浓度变化范围大（需要测定的血药浓度范围为峰浓度围大（需要测定的血药浓度范围为峰浓度 Cmax 1/20 Cmax ）、干扰组分多且不确定、样品不易重复获得等特点）、干扰组分多且不确定、样

18、品不易重复获得等特点 HPLC-CL联用技术应用于黄酮药动学研究联用技术应用于黄酮药动学研究24ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY液相色谱液相色谱化学发光法测定大鼠血浆中化学发光法测定大鼠血浆中山奈酚浓度及其药动学研究山奈酚浓度及其药动学研究 25ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY研究背景研究背景山奈酚的性质山奈酚的性质药理作用广泛，药动资料缺乏药理作用广泛，药动资料缺乏 仅有两篇报道：仅有两篇报道： 家兔灌胃，家兔灌胃，HPLC-DAD，前处理复杂，前处理复杂 大鼠静注

19、，大鼠静注，HPLC-UV，未报道药动学参数，未报道药动学参数OHOOOHOHHO1234567812345626ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY实验方法实验方法HPLC-CL条件的条件的优化优化1.色谱分离条件流动相不增加背景、不熄灭发光信号；不生成沉淀发光试剂混合次序发光反应试剂的浓度、试剂流速等2.发光反应兼容性3. 流路的优化4.发光反应条件分离度、峰形、保留时间02468107007508008509009501000105011000.00.10.20.30.40.50.60.70.80.970080090010001

20、10012001300140015000.30.40.50.60.71440146014801500152015400.51.01.52.02.53.03.52004006008001000120014001600Relative CL Intensity (a.u.) Concentration of Rhodamine 6G ( mol/l)abRelative CL Intensity (a.u.) Concentration of Cerium(IV) (mmol/l)cRelative CL Intensity (a.u.)Concentration of Sulfuric Acid

21、 (mol/l)dFlow Rate (ml/min)Relative CL Intensity (a.u.)27ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITYHPLC-CL实验装置示意图实验装置示意图DADComputerInterfacePMTCellHPLC PumpInjection ValveHPLC ColumnPeristaltic Pump1.5 mLmin-1Rho 6G0.4 % aqueous phosphoric acid Methanol Waste1.5 mL min-1Cerium (IV)Mixing Tee28

22、ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY血浆样品的预处理方法血浆样品的预处理方法取血浆样品取血浆样品100 L，精密加入内标溶液（，精密加入内标溶液（0.2 mg mL-1 异鼠李素）异鼠李素）5.0 L，20%的磷酸溶液的磷酸溶液10 L酸化，加甲醇酸化，加甲醇200 L，涡旋混合，涡旋混合1.0 min，离心，离心（10000 r min-1）10 min后，取上清液后，取上清液10 L进样。进样。29ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY方法学考察方法学考察专属性专属性1 1

23、线性关系和检测限线性关系和检测限2 2精密度、准确度与提取回收率精密度、准确度与提取回收率 3 3稳定性稳定性4 430ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY结结 果果专属性专属性0510152025050100150200250300350400450500KAISRelative CL Intensity (a.u.)Retention Time (min)abc123SampleBlankBlank+KA+IS31ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY结结 果果线性关系和检

24、测限线性关系和检测限 线性范围：线性范围：2.0 10-92.0 10-6g ml-1线性方程：线性方程：y = 0.8626 x + 5.553 (r = 0.9991, n = 7)检测限检测限 ：1.0 10-9 g mL-1。32ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY结结 果果精密度、准确度与提取回收率精密度、准确度与提取回收率 日内和日间日内和日间RSD均小于均小于5.0%，回收率大于，回收率大于80.0% Added (ng mL-1)Found (ng mL-1)Precision (%RSD)Accuracy (%)Re

25、covery(%)Intra-day20.016.2 0.63.780.889.2 3.1160.0151.3 3.02.094.697.1 1.710001001.2 32.83.3100.195.3 2.7Inter-day20.016.0 0.74.480.090.0 4.3160.0150.7 4.63.193.997.4 2.41000.01002.4 13.01.3100.295.1 2.433ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY结结 果果4稳定性稳定性xxConcentration(ng mL-1)0 h48 hDevi

26、ation(%) sRSD(%) sRSD (%)20.016.0 0.63.816.4 0.63.60.7160.0152.1 3.02.0146.6 2.61.81.61000.0997.2 28.92.9949.5 25.62.72.6冻融稳定性冻融稳定性Concentration(ng mL-1)Before freeze-thawingAfter freeze-thawingDeviation(%)x sRSD(%)x sRSD (%)20.016.0 0.63.815.7 0.74.30.8160.0152.1 3.02.0142.2 2.61.73.41000.0997.2 28

27、.92.9951.6 33.93.42.334ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY药动学研究药动学研究 给药给药1250mg/kg BW随机分组随机分组2500mg/kg BW前处理前处理取血取血C-T数据数据DAS 2.0药动参数药动参数首次成功将首次成功将HPLC-CL联用技术应用于联用技术应用于中药药动学的研究中药药动学的研究多峰现象多峰现象肝肠循环肝肠循环37ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY结结 果果药动学参数药动学参数ParametersDoses (mg kg

28、-1 BW)25001250Tmax (h)1.21 0.461.08 0.43Cmax (ng mL-1)232.90 5.14165.67 1.99AUC0- (ng h mL-1)1728.41 57.31729.01 29.44MRT0- (h)13.38 3.874.77 2.06t1/2 (h)9.27 1.843.30 1.05Journal of Chromatography B, 2009, 877(29),3595-3600.30微透析采样技术微透析采样技术ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY微透析技术微透析技术

29、(microdialysis, MD)时间分辨性、空间分辨性时间分辨性、空间分辨性不破坏机体完整性不破坏机体完整性提供游离态小分子化合物提供游离态小分子化合物样品可不经预处理直接用于测定样品可不经预处理直接用于测定样品量少、浓度低样品量少、浓度低微透析微透析v 多个器官连多个器官连续取样续取样v 与高灵敏度与高灵敏度分析技术联分析技术联用用v 活体内待测活体内待测组分的实时、组分的实时、连续、检测连续、检测 微透析微透析液相色谱液相色谱化学发光法测定大鼠化学发光法测定大鼠血和脑组织中丹参酚类化合物浓度血和脑组织中丹参酚类化合物浓度及其药动学研究及其药动学研究 脂溶性成分脂溶性成分二萜醌类二萜醌

30、类水溶性成分酚类水溶性成分酚类丹参素丹参素DSS、原儿茶酸、原儿茶酸PA、原儿茶醛原儿茶醛PAL、咖啡酸、咖啡酸CA丹酚酸丹酚酸 A、丹酚酸、丹酚酸B等等丹参丹参近期药理研究发现：近期药理研究发现：丹参酚类化合物具有改善血液循环、丹参酚类化合物具有改善血液循环、减少脑梗死面积、抑制肾素血管紧张素系统、和清除自由基、减少脑梗死面积、抑制肾素血管紧张素系统、和清除自由基、保护损伤的脑组织等药理作用。保护损伤的脑组织等药理作用。研究背景研究背景研究背景研究背景 丹参水溶性成分的药动学研究丹参水溶性成分的药动学研究l吸收和分布：吸收和分布： 丹参提取物给家兔灌服，采用液丹参提取物给家兔灌服，采用液-液

31、萃取技术对家兔血浆液萃取技术对家兔血浆中的丹参素进行萃取，用胶束毛细管电泳进行测定。灌胃后中的丹参素进行萃取，用胶束毛细管电泳进行测定。灌胃后30 min，肝、肺、肾、脑组织中的丹参素浓度最高；，肝、肺、肾、脑组织中的丹参素浓度最高；70 min时，时，心组织中丹参素浓度最高；心组织中丹参素浓度最高；50 min时，脾组织中时，脾组织中DSS浓度最高。浓度最高。灌胃给药后，灌胃给药后，DSS在很短的时间内进行吸收、分布。其中肝组在很短的时间内进行吸收、分布。其中肝组织中的丹参素浓度最大，表明织中的丹参素浓度最大，表明DSS在新西兰大白兔体内的代谢在新西兰大白兔体内的代谢主要在肝组织中进行。主要

32、在肝组织中进行。杨燕杨燕, 杨荣杨荣, 卫引茂卫引茂, 等等. 药物分析杂志药物分析杂志. . 2008, 28(3): 362. 研究背景研究背景l代谢和排泄代谢和排泄 Zhang等利用等利用HPLC-UV和和HPLC-MS对大鼠灌胃对大鼠灌胃200 mg kg-1丹参总酚酸（丹参素丹参总酚酸（丹参素 2.3%，原儿茶醛，原儿茶醛4.6%，丹酚酸，丹酚酸B 60.7%）后）后尿液和粪便中的代谢产物进行了研究，在收集的尿液和粪便中的代谢产物进行了研究，在收集的24 h尿液中检测到尿液中检测到5个代谢产物：丹参素、咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸和个代谢产物：丹参素、咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸和3,4-二

33、甲氧基二甲氧基苯乙酸，而在粪便中未检测到代谢产物。苯乙酸，而在粪便中未检测到代谢产物。 Shen等利用等利用LC/TOFMS，对大鼠静脉注射纯化的丹酚酸，对大鼠静脉注射纯化的丹酚酸A后血后血浆中的代谢产物进行了研究，发现了浆中的代谢产物进行了研究，发现了5个代谢产物：单葡萄糖醛酸个代谢产物：单葡萄糖醛酸化丹酚酸化丹酚酸A、甲基葡萄糖醛酸化丹酚酸、甲基葡萄糖醛酸化丹酚酸A、甲基丹酚酸、甲基丹酚酸A，二甲基丹，二甲基丹酚酸酚酸A和二甲基葡萄糖醛酸化丹酚酸和二甲基葡萄糖醛酸化丹酚酸A。Zhang J, He Y, Cui M, et al. Biomedical Chromatography. 20

34、05, 19(1): 51.Shen Y, Wang X, Xu L, et al. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2009, 23(12): 1810.研究背景研究背景l药动学参数及生物利用度药动学参数及生物利用度 Guo等用等用LC-MS测定了大鼠注射冠心宁冻干粉后血浆中测定了大鼠注射冠心宁冻干粉后血浆中DSS，PA，PAL，绿原酸，绿原酸，CA和和SalB的浓度。获得了这几种酚类化合物的的浓度。获得了这几种酚类化合物的t1/2，Cmax，Tmax。 潘坚扬等考察了丹参素在大鼠体内药动学和口服生物利用度。用潘坚扬等考察了丹参素在大鼠体

35、内药动学和口服生物利用度。用超高压液相色谱三重四级杆质谱联用法测定丹参素血药浓度，计算药超高压液相色谱三重四级杆质谱联用法测定丹参素血药浓度，计算药动学参数，丹参素的口服生物利用度为动学参数，丹参素的口服生物利用度为9.53%，口服生物利用度较差。，口服生物利用度较差。 Han等用等用LC-MS测定了大鼠静脉注射剂量为测定了大鼠静脉注射剂量为10、20和和40 mg kg-1 的纯度为的纯度为98 %的的SalB后的血药浓度，求算了后的血药浓度，求算了AUC，MRT，t1/2，V等参等参数，发现数，发现AUC随剂量增加，各剂量组之间随剂量增加，各剂量组之间MRT，t1/2和和V无差异。无差异。

36、Guo XR, Chen XH, Li L, et al. Journal of Chromatography B. 2008, 873(1): 51.潘坚扬潘坚扬, 赵筱萍赵筱萍, 邵青邵青. 中国中药杂志中国中药杂志. 2008, 33(2): 146.Han DE, Gao ZD, Zhao D, et al. Biomedical Chromatography. 2009, 23(10): 1073.研究背景研究背景l 脑部药动学研究脑部药动学研究 罗世英等对大鼠灌胃丹参水提物（罗世英等对大鼠灌胃丹参水提物（DSS 32.4 , PAL 6.0, SalB 36.2 mg kg-1）采

37、用液）采用液-液萃取法对血清样品和脑组织匀浆样品进行预处理，液萃取法对血清样品和脑组织匀浆样品进行预处理，用用HPLC-UV法测定，在大鼠血清中检测到法测定，在大鼠血清中检测到DSS、PAL和和SalB，在脑组，在脑组织匀浆中未检测到这三种物质。但由于紫外检测器灵敏度较低，脑匀浆织匀浆中未检测到这三种物质。但由于紫外检测器灵敏度较低，脑匀浆中未检测到的原因有待进一步试验证明？中未检测到的原因有待进一步试验证明？ 郑晓晖等在研究复方丹参方中使药冰片对君药丹参药动学和组织分郑晓晖等在研究复方丹参方中使药冰片对君药丹参药动学和组织分布的影响时，用丹参水煎液对新西兰大白兔灌胃给药（布的影响时，用丹参水

38、煎液对新西兰大白兔灌胃给药（10g kg-1），通），通过从小脑延髓池抽取脑脊液，以及脑组织匀浆采用过从小脑延髓池抽取脑脊液，以及脑组织匀浆采用LC-MS，在脑脊液和，在脑脊液和脑组织匀浆中测得脑组织匀浆中测得DSS，但未报道丹参素在脑组织中的药动学参数。，但未报道丹参素在脑组织中的药动学参数。罗世英罗世英, 钟志国钟志国, 林坚涛林坚涛, 等等. 中药药理与临床中药药理与临床. 2009, 25(4): 44.郑晓晖郑晓晖, 赵欣赵欣, 房敏峰房敏峰, 等等. 西安交通大学学报西安交通大学学报 (医学版医学版). 2007, 28(2): 170.研究背景研究背景存在问题：存在问题：脑组织药

39、代动力学研究的报道较少。测定脑组脑组织药代动力学研究的报道较少。测定脑组织中药物含量多采取脑组织匀浆法或抽取脑脊液进行测定织中药物含量多采取脑组织匀浆法或抽取脑脊液进行测定30微透析微透析（microdialysis , MD）采样技术采样技术应用于丹参药动学研究应用于丹参药动学研究 台湾台湾Tsai课题组用课题组用HPLC-UV法测定了大鼠静脉注射纯度为法测定了大鼠静脉注射纯度为98%的的 丹酚酸丹酚酸B（100 mg kg-1）后，血液和胆汁中的游离后，血液和胆汁中的游离SalB，线性范围为线性范围为0.150g mL-1，并，并报道了药动学参数。报道了药动学参数。Chen YF, Jaw

40、 I, Shiao MS, et al. Journal of Chromatography A. 2005, 1088(1-2): 140.研究内容研究内容HPLC-CL体系的建立体系的建立微透析采样技术的研究微透析采样技术的研究丹参药动学研究丹参药动学研究实验一实验一 静脉注射给药静脉注射给药实验二实验二 口服给药口服给药 OHOHOHO OHOHO OHOHOOH HOOHOHOOOOHOOOHOHOHOOHOHO HOHOHOOOOOHOHOHHOHOOHOOHOHProtocatechuic aldehyde (PAL)Danshensu (DSS)Protocatechuic ac

41、id (PA)Caffeic acid (CA)Salviandic acid B (SalB)Salviandic acid A (SalA) 流动相组成、流动相组成、pH、流速、流速 发光反应流路、试剂浓度、发光反应流路、试剂浓度、pH、流速、流速DADComputerInterfacePMTCellHPLC PumpInjection ValveHPLC ColumnPeristaltic Pump2.0 mL min-12.0 mL min-1HAuCl4H2O20.1% aqueous phosphoric acid 0.1% methanolphosphoric acidWaste

42、2.0 mL min-1LuminolMixing Teev 实验一：实验一： 色谱柱：色谱柱：Shim-pack ODS, 250 4.6 mm I.D. 5 m 柱温柱温: 30C 流速：流速：1.0 mL min-1 流动相：流动相：A：水（含：水（含0.1%磷酸，磷酸，v/v） B：甲醇（含：甲醇（含0.1%磷酸，磷酸，v/v） 梯度洗脱：梯度洗脱：015 min，2550% B；1530 min，50% B 进样量：进样量：20 L。v 实验二：实验二： 流动相：流动相：0.1%磷酸磷酸甲醇（甲醇（92: 8，v/v），等度洗脱），等度洗脱 其他条件同实验一其他条件同实验一液相色谱的

43、分析条件液相色谱的分析条件色谱与化学发光分析条件的优化色谱与化学发光分析条件的优化9.510.010.511.011.512.0010002000300040005000600070008000900010000Relative CL Intensity / a.u.pH of NaHCO3-Na2CO3 Buffer(a)010203040500200040006000800010000120001400016000Relative CL Intensity /(A.U.)Concentration of Luminol / mol L-1(b)20304050607080020004000

44、60008000100001200014000Relative CL Intensity / a.u.Concentration of HAuCl4 / g mL-1(c)02040608010010002000300040005000600070008000900010000Relative CL Intensity /a.u.Concentration of H2O2 / mol L-1(d)0.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.4200040006000800010000120001400016000Relative CL Intensity / a.u.Flo

45、w Rate / mL min-1(e)9.510.010.511.011.512.0010002000300040005000600070008000900010000Relative CL Intensity / a.u.pH of NaHCO3-Na2CO3 Buffer(a)010203040500200040006000800010000120001400016000Relative CL Intensity /(A.U.)Concentration of Luminol / mol L-1(b)20304050607080020004000600080001000012000140

46、00Relative CL Intensity / a.u.Concentration of HAuCl4 / g mL-1(c)02040608010010002000300040005000600070008000900010000Relative CL Intensity /a.u.Concentration of H2O2 / mol L-1(d)0.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.4200040006000800010000120001400016000Relative CL Intensity / a.u.Flow Rate / mL min-1(e)

47、DSS PAA PAL CA SalB SalAv 仪器设备：脑立体定位仪脑立体定位仪微量注射泵微量注射泵动物恒温控制器动物恒温控制器 血管探针血管探针脑探针脑探针.Text 2Text 3模型模型组组Blood probeBrain probe血管探针的植入血管探针的植入脑探针的植入脑探针的植入l 探针回收率的测定探针回收率的测定 体外：体外：Rin vitro = Cdia/ Cs 体内：体内：Rin vivo = (Cperf Cdial)/Cperf 实际浓度实际浓度 ：Cf = Cm/R in vivo 流速对探针回收率的影响流速对探针回收率的影响 血管探针：血管探针：2.5、2.0

48、、1.5 L min-1 脑探针脑探针 ：1.0、0.8、0.6 L min-1 浓度对探针回收率的影响浓度对探针回收率的影响 在所选浓度范围内无影响在所选浓度范围内无影响探针回收率的稳定性探针回收率的稳定性 4 h内的体外回收率的内的体外回收率的RSDv 给药给药实验一：丹参注射液（实验一：丹参注射液（ DSS 3.5 mg/kg，PAL 0.5 mg/kg，SalB 0.48 mg/kg）尾静脉注射）尾静脉注射实验二：丹参提取物灌胃实验二：丹参提取物灌胃(DSS，40 mg /kg，PAL149 mg /kg, SalB 50 mg/kg ) 灌胃灌胃v 样品采集样品采集灌流液种类：林格液

49、灌流液种类：林格液实验一：采样部位：脑；灌流液流速实验一：采样部位：脑；灌流液流速 2.0L/min。采样间隔。采样间隔15 min实验二：采样部位：血管、脑同步；灌流液速度：血管实验二：采样部位：血管、脑同步；灌流液速度：血管2.0L/min； 脑脑0.8 L/min；采样时间间隔：血管；采样时间间隔：血管15 min；脑；脑30 min& 专属性专属性 样品中的杂质不干扰测定样品中的杂质不干扰测定& 线性关系和检测限线性关系和检测限 各酚类化合物的线性关系良好（各酚类化合物的线性关系良好（R0.990）。）。 LOD：实验一：实验一： 0.22 12.80 ng/mL，实验

50、二：，实验二：0.29 0.80 ng/mL& 精密度和准确度精密度和准确度 日内和日间日内和日间RSD均小于均小于5.5% DSS 丹参素；丹参素； PA 原儿茶酸；原儿茶酸；PAL 原儿茶醛；原儿茶醛； CA 咖啡酸；咖啡酸；SalB 丹参素丹参素B； SalA 丹酚酸丹酚酸A浓度：浓度：64.0 ng/mLAbsorbanceRelative CL Intensity (a.u.)UVCL(a )(b )(c )(d )HPLC-CLHPLC-UVblood microdialysateBlank brian microdialysateBlank blood microdialysateBrian microdialysate& 实验一：丹参注射液静脉给药 丹参注射液给药后（丹参注射液给药后（DSS 3.5 mg/kg BW，PAL 0.5 mg/kg BW，SalB 0.48 mg/kg BW）在血液和脑中均观察到）在血液和脑中均观察到DSS，而未见，而未见PAL与与SalB。 脑中游离脑中游离DSS的的C-T 曲线曲线0.00.51.01.52.02.50100200300400500600DSS Concentration in Brai