食品微生物学检验菌落总数培训

1、食品微生物学检验 菌落总数培训（GB/T4789.2）2022-4-261内容一、立项修订依据二、主要修订内容三、检验程序四、第一法五、第二法 2022-4-263一 立项修订依据修订的背景 标准清理 多年未进行修订修订的意义（紧迫性） WTO的要求 原标准的局限（培养基、计数方式等） 3M纸片法菌落总数的卫生学意义2022-4-264修订依据（修订的主要参考方法） FDA/BAM Chapter 3 Aerobic Plate Count Jan. 2001SN 0168-92 出口食品平板菌落计数AOAC 986.32Aerobic Plate Count in FoodsAOAC 988

2、.18Aerobic Plate CountAOAC 990.12Aerobic Plate Count in FoodsUSDA/FSIS MLG CHAPTER 3 EXAMINATION OF FRESH, REFRIGERATED AND FROZEN PREPARED MEAT, POULTRY AND PASTEURIZED EGG PRODUCTS ISO 4833:1991 Microbiology - General guidance for the enumeration of micro-organisms - Colony count technique at 30 d

3、egrees C ISO 6610:1992 Milk and milk products-Enumeration Colony-forming units of micro-organisms-Colony-count technique at 30NMKL APHA CCFRA JAPAN HPB2022-4-265 二、修订的主要内容培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂添加了PetrifilmTM 细菌总数检验测试片法菌落计数公式进行了修改添加了拍打式均质器或等效的设备 2022-4-2661、培养基改变情况平板计数琼脂平板计数琼脂 （PCA)胰蛋白胨 5.0g酵母浸膏 2.5g葡萄糖 1.

4、0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000mL营养琼脂（营养琼脂（NA)蛋白胨 10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水 1000mL2022-4-267培养基改变依据 国外食品微生物权威的检测方法如ISO、AOAC和FDA/BAM等基本上都是采用平板计数琼脂或在平板计数琼脂的基础上进行了改良； 针对能力验证菌落总数的样品，采用两种培养基，结果无显著性差异； 平板计数琼脂具有细菌比较容易生长，菌落特征明显，容易计数等特点。2022-4-2682、3MTM PetrifilmTM 细菌总数试片法 国外情况 比对试验数据（已发表） 标准方法 国内情况 使用状况 比对试验数据（已发表）2

5、022-4-269优缺点优点：1、培养基具有良好的生产质量；2、菌落计数特别方便（容易判读），红色菌落，易于食品颗粒分开，也不菌落重叠现象；3、准确计数，有方格，尤其是数目较多时，两个人分别计数同一纸片时差异；4、菌落分布特别均匀；5、平行平板菌落结果一致性比较好，与避免了热损伤有关；6、菌落蔓延或半透明菌膜现象很少发生；7、安全方面不像玻璃平皿易碎、对人员造成潜在的伤害，另外密封比较好，不容易直接接触菌落。缺点：1、某些有红色颗粒的样品，需要注意；粘稠的液体样品，不易分散开；表面活性比较大，易流出等2、颜色特别重的样品，如桔黄色，掩盖了菌落；3、抑菌剂浓度比较高的样品，如辣椒及辣椒粉、大蒜及

6、洋葱制品；4、某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象，大部分是芽胞杆菌。3、菌落计算公式有两个稀释度的菌落数在合适范围，按照如下公式计算：N = 样品中菌落数C =平板菌落数之和n1 = 含合适范围菌落数的第一稀释度（低）平板数n2 =含合适范围菌落数的第二稀释度（高）平板数d = 第一稀释度（低）2022-4-2611dnnCN)1.0(21菌落计算公式1:100（第一稀释度） 232，2441:1000（第二稀释度）33，35dnnCN)1 . 0(212022-4-26122500024727102 . 254410)21 . 0(2353324423222菌落计算例子300

7、0030150104120610435038024423221022212211222111dnCnCdnCdnCN1:100（第一稀释度） 232，2441:1000（第二稀释度）38，352022-4-26132500024909102 . 254910)21 . 0 (2 3538244232)1 . 0(2221dnnCN统计学依据统计学依据： 平板菌落数越多，结果越具有代表性；平板菌落数越多，结果越具有代表性； （不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等） 取样量越大，结果越具有代表性；取样量越大，结果越具有代表性； （同等取样条件、排除其他方面的干扰因素） 两个相邻的稀释度平板菌落数直接

8、相加，不考虑稀释倍数的影响，采用加权平均值代替简单的算术平均值2022-4-26144、其他内容菌落形成单位的定义菌落总数的英文培养温度和时间 361培养48h2h。水产品301培养72h3h微量移液器天平2022-4-2615三 检验程序2022-4-2616 361 48h2h检 样 25g(mL)样品+ 225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择23个适宜样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养皿内培 养计数各平板菌落数计算菌落总数每皿中加入15mL20mL平板计数琼脂培养基，混匀报 告第一法 平板菌落计数法操作步骤样品稀释 固体和半固体样品：固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL

9、磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1min2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。 液体样品：液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。操作步骤样品稀释 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的

10、样品匀液。 按上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。操作步骤样品稀释 根据对样品污染状况的估计，选择23个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。 及时将15mL20mL冷却至46的平板计数琼脂培养基(可放置于461恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。操作步骤培养 琼脂凝固后，将平板翻转，361培养48h2h。水产品301培养72h3h。 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的

11、琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按上述条件进行培养。菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，cfu）表示。 选取菌落数在30cfu300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30cfu的平板记录具体菌落数，大于300cfu的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后

12、乘以2，代表一个平板菌落数。 平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，则应将每条链（不同来源）作为一个菌落计。结果的表述菌落总数的计算方法若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算。 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均

13、无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。结果的表述菌落总数的报告 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。 大于或等于100时，前第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/

14、mL为单位报告。第二法 菌落总数PetrifilmTM测试片法检验程序 除将平板计数琼脂培养基改成PetrifilmTM菌落总数测试片外，其它与检验程序同第一法。操作步骤样品的稀释 1:10的样品匀液制备后，用1mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节pH至6.67.2。 其他步骤同第一法操作步骤接种 根据对样本污染状况的估计，选择23个适宜稀释度的样品匀液进行检验。将测试片置于平坦实验台表面，揭开上层膜，用吸管或微量移液器吸取1mL样品匀液，垂直滴加在测试片的中央，将上层膜盖下，允许上层膜直接落下，但不要滚动上层膜，将压板（凹面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养膜上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1分钟以使培养基凝固。每个稀释度接种两张测试片。操作步骤培养 将测试片的透明面朝上，水平置于培养箱内。可堆叠至20片，培养温度和时间同第一法。操作步骤计数 培养结束后立即计数,可肉眼观察计数，或用菌落计数器、放大镜、PetrifilmTM自动判