聚乙二醇_聚乙烯亚胺_四氧化三铁纳米磁流体的毒性及其生物相容性

1、中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第3期 20100115出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 15, 2010 Vol.14, No.3聚乙二醇-聚乙烯亚胺/四氧化三铁纳米磁流体的毒性及其生物相容性*邹 芬1，潘一峰2，张 红2，李国政2，唐静波2，彭 健2Toxicity and biocompatibility of polyethylene glycol-polyethyleneimine/ferroso-ferric oxide nano-magnetic fluidZou

2、 Fen1, Pan Yi-feng2, Zhang Hong2, Li Guo-zheng2, Tang Jing-bo2, Peng Jian2AbstractBACKGROUND: Polyethylene glycol-polyethyleneimine/ferroso-ferric oxide (PEG-PEI/Fe3O 4 was selected as drug carriers in tumor treatment, which can increase drug loading capacity and targeting capacity.OBJECTIVE: To tes

3、t the toxicity of PEG-PEI/Fe3O 4 nano-magnetic fluid in vitro and in vivo.METHODS: When the prepared PEG-PEI/Fe3O 4 nano-magnetic fluid reached nano level, 7702 and HpG2 cell lines were filtrated and diluted in 5-20 multiple, and detected by in vitro MTT toxicity test assay; in vivo hemolysis test a

4、nd micronucleus test was used to test the toxicity and biocompatibility.RESULTS AND CONCLUSION: MTT assay results indicated that the toxicity grade of PEG-PEI/Fe3O 4 nano-magnetic fluid to 7702 cell line was 0-1, which was harmless to natural hepatic cells; however, PEG-PEI/Fe3O 4 nano-magnetic flui

5、d had slight bystander restraining effect to HpG2 cell line. Maximum hemolysis rate of the material was 0.372%, which was far less than 5%. The micronucleus test result indicated that PEG-PEI/Fe3O 4 nano-magnetic fluid had no teratogenicity or mutagenicity.Modern Chinese Medicine Park inSouth China

6、Co., Ltd, Zhongshan 528451, Guangdong Province, China; 2National Key Laboratory of Nanobiological Technology, South China University, Changsha 410008, Hunan Province, ChinaZou Fen, Master, Modern Chinese Medicine Park inSouth China Co., Ltd, Zhongshan 528451, Guangdong Province, ChinaCorrespondence

7、to: Peng Jian, Doctor, Associate professor, Masters supervisor, National Key Laboratory of Nanobiological Technology, South China University, Changsha 410008, Hunan Province, ChinaSupported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30672047*; PostgraduateInnovation Fund of Hunan Prov

8、ince, No. 2340-74335000013*Received: 2009-10-21Accepted: 2009-12-111摘要背景：为实现纳米基因药物在治疗肿瘤中实现高靶向性，课题采用聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰的磁性四氧化三铁纳米粒(PEG-PEI/Fe3O 4 作为基因药物载体，在提高载体载药能力的同时，使载体具有超顺磁性，增加药物靶向性能。 目的：评价PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体体外和体内毒性。过滤稀释520倍培养7702细胞和HpG 2细胞，方法：对制备的PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体进行表征达到纳米材料水平后，进行体外MTT 毒性试验；通过体内溶血试验和微

9、核试验测定生物相容性和体内毒性。结果与结论：MTT 结果显示，PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体对7702细胞毒性01级，对正常肝细胞无害；PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体对HpG 2细胞有轻微的旁观者抑制效应；PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体溶血率为0.372%，远小于5%；微核试验结果表明PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体无致畸、致突变作用。0 引言治疗癌症的药物，在体内达到一定血液浓度而分布于全身产生治疗作用，往往对机体有巨大的不良反应，在杀死癌症细胞的同时，也杀死了大部分正常细胞，以至于患者在癌症治疗的后期，体质虚弱无法耐受进一步治疗。目前，具有靶向性的药物载体成为

10、肿瘤治疗的热点，磁流体主要成分是具有强顺磁性的纳米四氧化三铁(Fe3O 4 ，作为药物载体不仅很容易通过血脑屏障，而且具有磁控导向，可以很方便的富集于肿瘤处，一方面提高肿瘤处药物浓度，加强药物对肿瘤的作用，减少对其他正常组织的伤害；另一方面，可以在肿瘤附近的血管形成栓塞，减少肿瘤的营养供给2-3。将1具有磁靶向性的Fe 3O 4制备成纳米粒，可实现加载基因药物的目的，同时通过聚乙二醇(PEG与聚乙烯亚胺(PEI的修饰4-6，加大磁性纳米粒对基因的加载能力，达到提高转染率的目的，为实现磁性纳米药物载体应用于临床提供理论依据。1 材料和方法设计：对比观察实验。时间及地点：实验于2007-11/20

11、08-02在中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室完成。材料：细胞：人类肝细胞7702，人肝肿瘤细胞系HepG 2，pEGFP-C1(enhanced greenfluorescent protein由本研究中心冻存和复苏。ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 447 www. CRTER .org1邹芬，等. 聚乙二醇-聚乙烯亚胺/四氧化三铁纳米磁流体的毒性及其生物相容性中山市华南现代中医药城发展有限公司，广东省中山市 528451；2中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室，湖南省长沙市 410008邹 芬，女，1981年生，湖南省怀化市人，2008

12、年中南大学毕业，硕士，主要从事纳米药物载体方面的研究。 miffysweet 通讯作者：彭健，副教授，博士后，硕士生导师，中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室，湖南省长沙市 410008中图分类号:R318 文献标识码:B文章编号:1673-8225 (201003-00447-05动物：昆明种4周龄小鼠 60只，SPF 级，雌磁流体在外加磁场下培养7702细胞和HepG2细胞，其中第1列为DMEM 空白组(阴性对照组 ，第2列为聚丙烯酰胺单体组(阳性对照组 ，312列每种样品浓度加2列，重复3排。继续培养24 h后，每孔加入20 L 的噻唑蓝(50 g/L，继续培养4 h后去掉上清，每孔加入

13、150 L 二甲基亚砜，在摇床上振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。通过计算加入PEG-PEI/Fe3O 4磁流体作用后的细胞吸光度和阴性对照的细胞吸光度之比来测量细胞活性。记录结果，以PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体浓度为横坐标，细胞活性为纵坐标，以MATLAB 数学模型拟合分析两者的相关度，绘制细胞生长曲线，预测PEG-PEI/Fe3O 4磁流体浓度对细胞生长的影响系数。按下式计算细胞相对增殖率，细胞相对增殖率(%=实验组吸光度均值/阴性对照组吸光度均值×100%，并按规定把细胞相对增殖率值转换成6级反应，实验结果为0或1级反应为合格

14、，实验结果为2级反应的结合细胞形态综合评价，实验结果为35级反应为不合格。细胞相对增殖率与细胞毒性分级转换表：8雄各半，体质量(21±2 g，由中南大学湘雅二医院医学实验动物中心提供(许可证号：SYXK(湘2004-0013 。健康新西兰大白兔14只，雌雄各半，中南大学湘雅校区动物学部提供(合格证号：医动字第20-002号 。主要试剂：主要试剂FeCl 3、FeCl 2、氨水来源国药集团化学试剂公司 Aldrich- Sigma 公司产品 Fluka 公司 实验室自制 Sigma 公司3·H2O (NH聚乙烯亚胺(PEI,M W25 000 聚乙二醇(PEG,双蒸水M W

15、2 000DMEM 培养基、 小胎牛血清收稿日期：2009-10-21修回日期：2009-12-11(20091021034/MZ质粒大抽提试剂 QIAGEN公司实验方法：PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体的制备：取双蒸水50 mL，分别溶解FeCl 3 2.7 g，PEI 2000 4.0 g和PEG 1.8 g，依顺序将FeCl 3 溶液、PEG 溶液和PEI 溶液倒入三角瓶中，充分混匀后，加入FeCl 2 2.0 g，氮气保护下溶解在混合液中，速置于三颈瓶中，通入氮气7。取1.5 mol/L的氨水10 mL加双蒸水40 mL，配成50 mL的体系，用分液漏斗匀速滴定入装有混合液的三颈

16、瓶中，55 恒温下高速搅拌2.03.0 h。反应结束后，产物5 000 r/min，离心15 min，弃上清液取15 min，弃上清液取沉淀，用双蒸水重悬，超声波仪功能60 000 W，30 s间隔，间断超声 6 min，得到PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体的悬液在Zetasizer Nano Series 90 粒径分析仪上测定粒径。PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体对DNA 的结合效率：毒性反应相对增殖率(%毒性100 0 级7599 1 级 5074 2 级 2549 3 级 124 4 级 0 5 级沉淀，用双蒸水重悬后，5 000 r/min，离心体内毒性试验：溶血试验9：

17、抽取新西兰兔血10 mL，加入20 g/L草酸钾0.5 mL，按每8 mL加入10 mL生理盐水得到稀释的新鲜抗凝兔血，将0.2 mL兔血稀释液加入10 mL蒸馏水中，用分光光度计测量，波长540 nm，吸光度值为0.685，符合试验要求。血液冷冻干燥后，用生理盐水按0.1 g/mL重悬，总体积取10 mL，超微滤头过滤。生理15 L 的pEGFP-C1的质粒DNA 与0.5 mg/mg的PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体5 L ，室温下轻微振荡2 min后，37 水浴静置30 min，得到PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体与DNA 复合物， 盐水作为阴性对照；蒸馏水作为阳性对照；每5

18、 000 r/min，离心15 min，取上清液测定260 nm组取3支试管。将试验组、阴性对照组和阳性对处的吸光度，计算游离DNA 的浓度。根据公式总DNA -未结合DNA/总DNA×100%计算PEG-PEI/ Fe 3O 4纳米磁流体与DNA 的结合效率。体外毒性试验(MTT比色法 ：将7702细胞和照组放入37 水浴中，预温30 min后，加稀释抗凝兔血0.2 mL，轻轻摇匀，放入37 水浴保温60 min后，将各管溶液2 500 r/min，离心 5 min，取上清液，分光光度计545 nm紫外光波长测吸光度值。微核试验10：取昆明小鼠60只，随机分为6组，每组10只，将等

19、浓度PEG-PEI/Fe3O 4纳米P .O. Box 1200, HepG 2细胞按照1×10个/孔种于96孔板中，待24 h细胞贴壁后，分别用原液以及稀释2倍、5倍、10倍、15倍和20倍的PEG-PEI/ Fe3O 4纳米4485邹芬，等. 聚乙二醇-聚乙烯亚胺/四氧化三铁纳米磁流体的毒性及其生物相容性www. CRTER .org磁流体悬液分为5.00，3.75，2.50，1.25 g/kg4个剂量腹腔注射，阳性对照采用环磷酰胺40 mg/kg腹腔注射，阴性对照采用0.9% NaCl 腹腔注射。采取30 h给予受试物法，即两次给受试物间隔24 h，第2次给受试物6 h后，5

20、min，干后用Giemsa 染液染色15 min后观察11。每只小鼠计数1 000个嗜多染红细胞，并统计有微核的嗜多染红细胞，结果以%表示，用泊松分布检测各组间差异有无显著性意义12-13。主要观察指标：PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体对DNA 的结合效率。体外MTT 毒性试验、体内溶血试验和微核试验测定生物相容性和毒性。设计、实施、评估者：实验设计为第二、六作者；资料收集、实验实施为第一作者；实验评估为第三、四作者。统计学分析：由第五作者采用SPSS Statistics V15.0 与MATLAB7.0 进行正态分析、曲线拟合。2 结果2.1 PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体对

21、DNA 的结合效率 7.3 nm，表面电位为(34.13±2.03 mV，与DNA 结合率为(94.13±1.80%。完全符合纳米材料对粒径在10 100 nm的要求14。 2.2 MTT检测结果PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体对正常肝细胞7702的MTT 实验结果：见表1。 据与阳性对照组比较差异有显著性意义。同时按照ISO1099321. 医疗器械生物学评价的要求15，对不同浓度的PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体溶液进行毒性评级，结果显示全部达到01级，PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体对适合应用于临床实验或治疗。PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体对

22、肝癌细胞HePG 2的MTT 实验结果：见表2。 颈椎脱臼法处死动物，取股骨骨髓液涂片，甲醇固定 7702正常肝细胞的生长没有影响，是合格的生物材料，得到PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体的粒径为(79.99± 由表2可见，PEG-PEI/Fe3O 4 纳米磁流体干预下的肝癌细胞生长与正常的肝癌细胞生长有差异，同时按照ISO1099321. 医疗器械生物学评价的要求，对PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体溶液毒性评级，结果显示大部分评价是1级，50%以上浓度的PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体评价是2级，PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体溶液对HePG 2细胞的生长存在

23、轻微的抑制，可能因为肿瘤细胞吸收PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体的磁性微粒的能力是正常细胞的8400倍16，癌细胞敏感性高，易被磁场下PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体的影响，所以生长受到抑制。HePG 2是肝癌细胞，属于需要抑制和杀死的对象范围，因此认为PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体溶液应用于临床对正常肝细胞是安全的，并且PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体本身对肝癌细胞具有一定的抑制作用。构造以自然数e 为底的指数函数y=a·e -bx +c，其中y 为HePG 2细胞的吸光度值，x 为PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体的使用浓度，用实验数据拟合函数，得到

24、PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体浓度对肝细胞HePG 2数量的影响函数。使用MATLAB 软件编程进行最小二乘法拟合。运算结果：a=1.057,b=4.946,c=1.046。y=1.507×e-4.946×x+449由表1可见，加样组细胞生长与阴性对照组相比较， P > 0.05，即各实验组数据与阴性对照组吸光度值的差异是由实验误差引起的，差异无显著性意义；实验组数ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAHwww. CRTER .org邹芬，等. 聚乙二醇-聚乙烯亚胺/四氧化三铁纳米磁流体的毒性及其生物相容性1.046。

25、见图1。 A v a l u e3 讨论生物材料是否能够进入临床使用的关键标准是生物相容性和无毒性，国际标准化组织(ISO以10993编号发布了18个相关标准被广泛采纳17。本研究参照GB/T1688618(等同于ISO10993 及国内外其他相关标准，通过MTT 法检测材料浸提液细胞毒性试验、溶血试验，以及体内遗传毒性试验微核试验等方法19，对自制PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体的毒性进行评价。自1906年Ehrlich 首次提出将药物选择性地分布于病变部位以降低其对正常组织的毒副作用，并使病变组织药物浓度增大，从而提高药物利用率这一靶向给药的概念。成功的靶向制剂应具有3个要素定位浓度

26、、控制释药以及无毒可生物降解20。PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体是一种纳米级的液态磁性颗粒，具有卓越的磁靶向性，可以通过血脑屏障到达病灶部位，并在病灶部位形成较高浓度，并可生物降解，是一种非常理想的癌症药物的载体，经过PEG 修饰后的磁流体，避免单核巨嗜细胞系统吞噬，其生物相容性更加优越，并且由于PEG 的亲水性，可显著延长磁流体在体内循环的时间，但其直接应用于临床的可行性仍在进一步研究中。本实验采用的MTT 法是一种国际标准检测细胞存活和生长的方法，其只对活细胞产生作用，死亡细胞对MTT 不起作用，其检测得到的吸光度值与活细胞的数量存在线形对照关系，可以直接反映出活细胞的相对数量。通

27、过与阴性对照比较，可以对材料的细胞毒性得出可靠的定量评价。MTT 试验表明，在使用浓度内PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体对正常肝细胞的生长没有影响，在高浓度下，PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体对肝癌细胞的生长有一定的抑制作用，且浓度与抑制率呈依赖关系y=1.507×e-4.946+1.046，这是由于PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体对肝癌细胞具有旁观者效应，可抑制肝癌细胞的生长21。说明PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体作为药物载体，对正常肝细胞没有明显的毒性作用，对肝癌细胞的抑制作用可协助肝癌药物杀死肝癌，增加药物的疗效。PEG-PEI/Fe3O 4 magn

28、etic nanoparticles concentrationFigure 1 Relationship between PEG-PEI/Fe3O 4 magneticnanoparticles concentration and hepatocyte HePG 2 activity图1 PEG-PEI/Fe3O 4磁性纳米粒子浓度(%与肝细胞HePG 2 活性关系2.3 溶血试验 各实验组在545 nm处的吸光度值见表3。 依据公式溶血率(%=(待测样品吸光度均值-阴性对照吸光度均值/(阳性对照吸光度均值-阴性对照吸光度均值×100% ，计算出PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流

29、体的溶血率为0.372%，远小于医用材料的溶血率< 5%的要求。 2.4 微核试验 每只小鼠计数1 000个嗜多染红细胞，并统计有微核的嗜多染红细胞，结果见表4。 450邹芬，等. 聚乙二醇-聚乙烯亚胺/四氧化三铁纳米磁流体的毒性及其生物相容性www. CRTER .orgPEI/Fe3O 4纳米磁流体的溶血率为0.372%，远小于标准中的5%，表明实验用PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体无溶血作用，符合医用材料的溶血试验要求。遗传毒性和致癌试验是生物材料中比较棘手的问题。中国生物材料和医疗器械生物学评价技术要求中推荐使用短期遗传毒性试验首先做筛选，规定短期遗传毒性试验阴性者可不做致

30、癌试验25。因此，选择微核试验这种具有一定敏感性的短期遗传毒性试验来评价PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体的遗传毒性。结果显示该材料对小鼠骨髓微核形率与阴性对照组相比差异无显著性意义，而与阳性对照组相比差异有显著性意义，认为该材料无致畸或致突变作用。结论：由于PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体制作方法、条件和设备要求简单，原材料价格便宜，无毒无致畸作用；在血液中低溶血率说明PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体具有非常卓越的生物相容性，是一种用于临床的理想药物载体，具有广阔的应用前景。PEG-PEI/Fe3O 4纳米磁流体电荷呈阳性，能高效地与DNA 结合，适合加载目前研究较热的基因药

31、物，代替有毒性的病毒基因载体或者脂质体基因载体，成为新一代无毒高效的基因载体。4 参考文献 1Kondo A,Fukuda H. Preparation of thermo-sensitive magnetic microspheres and their application to bioprocesses. Colloids and Surfaces. A. 1999;153(1-3:435.2 Chang Y,Su ZX. Preparation and characterization ofthermosensitive magnetic particles. Materials S

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