生物化学检验实验

1、临床生物化学实验临床生物化学实验 实验一实验一 实验室基础知识实验室基础知识 一、现代化学试剂及玻璃器械的使用 实验目的： l、了解化学试剂的等级和保管原则 2、掌握玻璃器械的规范使用 3、明确各玻璃器械的功用 实验材料：不同等级的化学试剂量材 量筒 容量瓶 吸管（移液管 无分度两标线管 有分度吸管 微量吸管）吸球 实验步骤： 1、根据试剂瓶上的标志说明该试剂的等级及保管方法 2，玻璃量器的使用：按照玻璃量器上的标示，分量入式及量出式量取一定量的液体 5 次以上， 达到熟练使用， 注意吸液时的刻度的读取及量液时角度。 二、恒重法校正移液管 实验目的；掌握恒重法校正玻璃量具 实验器材：万分之一天

2、平纯水 移液管 温度什 移液瓶 实验原理：VtWt/dt 实验步骤： 1、调整万分之一天平。 2、用被检的移液管取 20ml 水，注入已称量质量的移液瓶中。 3、称量总质量，得出水质量 4、用温度计测量水温，确定该温度下的水密度。 5、计算水体积。 6、计算称量误差，确定是否在允许范围之内。 实验二实验二 无蛋白血无蛋白血滤液制备滤液制备 实验目的：掌握无蛋白血滤液制备的方法 一、钨酸法 实验原理：钨酸钠与硫酸混合，生成钨酸，钨酸可以与血液中蛋白质结合生成蛋白质盐沉淀，经离心将蛋白质除掉。 实验试剂： 1、100g/L 钨酸钠溶液：称取钨酸钠 100g，溶于水中加水至 1000ml 2、1/3

3、M 硫酸：取己标定的当量硫酸 2 份加水 1 份混合。 实验操作： 用吸管将全血缓慢放入蒸馏水中，每次加入试剂后充分混匀，静止 10分钟后离心，取上清液备用 注意事项： 1、抗凝血中草酸盐过剩时，蛋白质沉淀不完全，沉淀不能变为暗褐色，此时可滴加 100g/L 硫酸一滴，摇匀，至沉淀变为暗褐色再进行过滤。 2、除蛋白滤液不透明时，应将蛋白质沉淀及滤液倾回试管，按 1 所示方法加人硫酸，使蛋白质完全沉淀。 3、此滤液适于葡萄糖、肌酐、肌酸、尿酸等测定 二、三氯醋酸法 实验原理： 血液中蛋白质能与三氧醋酸作用于生成不溶性的蛋白质盐沉淀，经离心将蛋白质除去，上清液为无蛋白血滤液 实验试剂：100 gL

4、 三氯醋酸溶液 实验操作：取血清或血浆一份，三氯醋酸 9 份，加入血清或血浆中（边加边摇）充分混匀后离心，取上法备用 注意事项： 1、此法所得滤液量多，酸性较强，适于较强酸性溶解的物质定测定，如钙、磷等。 2、不适于碱性还原法血糖定量测定。 3、三氯醋酸易潮解，注意保存 实验三实验三 吸收曲线的制作和吸收曲线的制作和 721721 波长的校正波长的校正 实验目的： l 过硫酸铜和镨铷滤光片的吸收曲线的测绘，了解分光光度计波长度盘上标度的正确性 2、掌握 721 分光光度计波长校正方法（镨铷滤光片法）及重复性检查 实验原理：镨铷滤光片在可见光区域最大吸收峰为 529nm，利用这个特性校正 721

5、 分光光度计 实验器材：721 分光光度计 镨铷滤光片 坐标纸 烧瓶 吸管硫酸铜标准储存液 血清总蛋白测定液 实验步骤： 一、校正 1、预热仪器 2、置波长 580nm 处，T 调至最大，用一白纸条观察是否有光强均匀的光斑在吸收池处出现，调节光源灯泡使用其符合要求 3、把灵敏度钮置于最低端，波长度盘置 529nm 处，反复调节透光度和100直至稳定，将镨铷滤光片插入光路，仔细旋转波长度盘，找到 T 值最低点，此时波长应为 529nm（m） 4、计算波长误差：m 5、校正：调波长于 529nm 处，取出镨铷滤光片，调节 T 值至于 100处，再插入镨铷滤光片，打开盖板，调节波长校正螺丝，使值最低

6、波长校正步骤反复检查波长误差，直至符合要求。 二、重复性检查 1、用蒸馏水作空白将波长度盘固定在先 690nm，调节透光度为 100 2、连续测量五次硫酸铜标准液（31.35molL 即 2000ugml），分别记录 透光度值。 3、计算：l=lmaxlmin。 Lmax、lmin 分别为透光度最大值和最小值，一般要求 l 小于0.5 三、吸收曲线制作 1、连续测定五个不同浓度的蛋白标准液，记录其吸光度值 2、分别以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制吸收曲线 实验四实验四 血清蛋白醋酸纤维素膜电泳血清蛋白醋酸纤维素膜电泳 实验原理：带电质在电场中向与其极性相反的方向流动的现象称为电泳血清中各蛋白

7、质都有不同的等电点，当将其置于比其等电点高的 PH 缓冲液中时，他们都将带负电荷在电场中向正极泳动由于各蛋白质等电点及所带电荷量和分子量大小都有所不同，因而在电场中泳动速度不同，利用这个特点将血清中各种蛋白质分开 实验仪器：电泳仪电泳槽 血清加样带 分光光度计 滤纸 剪刀 实验材料：醋酸纤维素膜规格 28cm。 实验试剂： l、巴比妥巴比妥钠缓冲液（PH8.6 0.1、离子强度 0.06）：称取巴比妥 2.21g，巴比妥钠 12.369 于 500ml 蒸馏水中，加热溶解，待冷至室温后，再用蒸馏水补充至于 1L。 2、氨基黑 10B 染色液：称取氨基 10B 0.1g，溶于无水乙醇 20ml

8、中，使溶解。另取磺基水杨酸 2.5g，溶于 74.5ml 蒸馏水中，再将二液混合摇匀。 3、漂洗液：甲醇 45ml，冰醋酸 5ml 和蒸馏水 50ml，摇匀 4、0.4M 氢氧化钠溶液。 实验操作： 1、将缓冲液加入电泳槽内，调节两侧槽内的缓冲液，使其在同一水平面上。 2、 醋纤膜的准备： 取在缓冲液中浸泡的醋纤膜一张， 在毛面的一端 （负极侧）1.5 厘米处，用铅笔画一横线，作点样标记，编号后，将醋纤膜置于巴比妥巴比妥钠缓冲液中浸泡，待充分浸透后取出（一般为二十分钟）夹于洁净滤纸中间，吸去多余的缓冲液。 3、将醋纤膜毛面向上贴于电泳槽的支架上拉直，用微量吸管吸取无溶血血清在横线处沿横线加 3

9、5 微升。样品应与膜的边缘保持一定距离，以免电泳图谱中蛋白区带变形，待血清渗入膜后，反转醋纤膜，使光面上平直地贴于电泳槽的支架上，用双层滤纸或四层纱布将膜的两端与缓冲液连通，稍待片刻 4、接通电源，注意醋纤膜上的正负极，切勿接错电压 90150 伏，电流 040.6mA/cm 宽（不同电泳仪所需电压、电流可能不同，应灵活掌握）；夏季通电 45 分钟，冬季通电 60 分钟，待电泳区带展开约 2535mm。，即可关闭电源。 5、染色：通电完毕，取下薄膜直接浸于氨基黑 10B 染色液中，染色 510 分钟（以白蛋白染透为止），然后在漂洗液中漂去剩余染料，直至背景无色为止。 6、定量：将漂洗净的薄膜吸

10、干，剪下各染色的蛋白区带放入相应的试管内，在白蛋白管内加 0.4M 氢氧化钠溶液 6ml（计算时吸光度乘 2），其余各加 3ml， 振摇数次， 置 37 度水箱 20 分钟， 使其染料浸出、 对于浸出的氨基黑 10B，用分光光度计，在波长 600620nm 读取各管吸光度，然后计算各自的含量（在醋纤膜的无蛋白区带部分， 剪一条与白蛋白区带同宽度的膜条， 作为空白对照） 计算： 各组分蛋白=AxAt100 各组分蛋白 g/L各组分蛋白百分数血清总蛋白 g/L AX 表各组分蛋白吸光度 At 表各组分蛋白吸光度总和 参考值： 失败原因： 1、电泳图谱不整齐：点样不均，薄膜未完全浸透或温度过高致使膜

11、面局部干燥或水分蒸发，缓冲液变质：电泳时薄膜放置不正确，使电流方向不平行 2、蛋白组分分离不佳：点样过多，电流过低，薄膜结构过分细密，透水性差，导电性差等 3、染色后白蛋白中间着色浅：由于染色时间不足或染色液陈旧所致：若因蛋白含量高引起，可减少血清用量或延长染色时间，一般以延长 2 分钟为宜若时间过长，球蛋白百分比上升，A/G 值会下降 4、薄膜透明不完全：温度未达到 90 度以上将标本放入烘箱，透明液陈旧和浸泡时间不足等。 5、透明液上有气泡：玻璃片上有油脂，使薄膜部分脱开或贴膜时滚动不佳 实验五实验五 火焰光度分析火焰光度分析 实验原理：火焰光度分析法是一种发射光谱分析样品中的钾钠原子受火

12、焰的热能作用被激处于激发态， 激发态原子不稳定， 迅速回到基态， 放出能量，发射出元素特有波长的辐射谱线，利用此原理可进行火焰光度分析钾的火焰呈深红色波长为 767nm。，钠的火焰呈黄色波长为 589nm。 实验试剂：钾钠标准液 实验仪器：火焰光度计（HG3 型HG5型） 实验操作： 一、HG3 型 1、开机： （l）、接通电源，打开电源开关及压力开关 （2）、当压力达到 0.04MPa 时打开煤气阀，同时按下点火开关点火，稳定 10 分钟后进行测定 2、加样 3、测定 （1）、调零：扭动电源开关旋到测定档，转动调零钮，以蒸馏水调零。 （2）、定标。调零后，用钾或钠标准调到标准值位置 （3）、

13、测定：吸入待测样品，测得值即为所测标本中钾或钠的含量。 4、关机：先关闭煤气开关，然后再关闭电源开关。 二、HG5 型 1、开机： （l）接通电源，打开电源开关及压力开关 （2）当压力达到 0.08MPa 时打开煤气阀，仪器自动点火，如未点着15秒后，仪器会自动再次点火调整火焰高度至 8mm 左右，稳定 20 分钟 2加样：以锂内标波为稀释被，对标本进行 1：200 稀释即为测定液 3、测定： （1）以锂内标稀释液调零 （2）以钾钠标准液进行定标 （3）按下测定旋钮或进行测定 实验六实验六 电化学分析（离子选择电极）电化学分析（离子选择电极） 一、实验原理：离子选择电极分析法是以测量电池的电动

14、势为基础的定量 分析方法将离子选择电极和一个参比电极连接起来，置于待测的电解质溶液中，就构成一个测量电池，此电池的电极电位与被测的离子浓度符合能斯特方程：02.303 RTnFLgai。离子选择电极由于锂钠等离子不同活度的作用而产生不同的电位， 这种电位的变化由离子活度决定， 与离子浓度成比列 二、实验试剂。厂家供给 三、实验操作： 1、开启仪器，冲洗管道 2、用活化液活化电报活化时间一般 1530 分钟为 3、仪器自动定标 4、测定结果，由仪器内微处理计算器后，打印教值 5、关机前，应冲洗电极和管道 实验七实验七 酶学标准曲线的制作酶学标准曲线的制作 一、实验目的：掌握酶学标准曲线的制作、酶

15、学固定时间法的测定及半自动化分析仪的使用。 二、实验原理： L丙氨酸酮戊二酸 ALT 丙酮酸L谷氨酸 丙酮酸NADHHL乳酸NAD+ 三、实验试剂仪器：ALTGPT 试剂 待测标准物 半自动生化分析仪 试管 加样器 四、实验操作： 1、稀释试剂 2、开机预温达 37 度 3、选取测定程序 4、测试： 五、实验结果：把测得数据按 A/minU/L 作图，绘制标准曲线 实验八实验八 酶活性测定（连续监测法）酶活性测定（连续监测法） 一、实验目的：掌握连续法和定酶的活性及半自动生化分析仪的使用 二、实验原理：U/LKA/min。 三、实验操作： 1、诱导试剂 2、开机预温达 37 度 3、选取测定程

16、序 4、测试：加入试剂准确计的 30 秒后测定读取吸光度以后每隔 30 秒测定一次 四、实验结果：计算 A/min 求出测定结果 实验九实验九 溶血、黄疸对酶活性测定的影响溶血、黄疸对酶活性测定的影响 一、实验目的：考察在干扰物质存在时，酶活性测定的准确性 二、实验原理：L丙氨酸酮戊二酸 ALT 丙酮酸L谷氨酸 丙酮酸NADHHL乳酸NAD+ 三、实验试剂仪器：ALTGPT 试剂 待测正常和溶血黄疸血清 半自动生化分析仪 试管 加样器 四、实验操作： 1、稀释试剂 2、开机预温达 37 度 3、选取测定程序 4、测试： 5、结果分析： 实验十实验十 核酸的提取与纯化核酸的提取与纯化 实验目的：

17、掌握核酸提取与纯化的方法，离心技术的合理使用 一、DNA 的提取 实验原理：酚为有效的蛋白质变性剂，并且饱和的酚与水相有效的分开因此，在含核酸的样品加入酚，可将样品中的蛋白质变性后形成沉淀层，位于水相与有机相的界画，从而达到纯化核酸的目的但酚不能完全抑制 RNA 酶的活性，而且酚层中含有 1015%的水,从而溶解一部分 poly（A）RNA。将酚与氯仿联合使用即可克服这两方面的不足氯仿除可使蛋白质变性外，还能加速水相与有机相的分层在氯仿中加入少许异戊醇可减少油提生产生的泡沫 在酚氯仿联合抽提核酸后，再加氯仿抽提一次；可除去样品中的痕量酚 实验试剂： l、饱和的熏蒸酚：市售 AR 经酚须在 18

18、2 度用空气冷凝管进行重蒸馏，冷却后加入 8 一羟基喹啉， 使其浓度达到 1gL， 向液体酚中加入等体 0.5mlTrisHCL 缓冲液（PH8.0），置磁力搅拌 15min，抽取上层（水层）液体再加入等体积 0.lmolLTrisHCL 缓冲液（pH8.0），同样搅拌 15min，分相完全后吸取上层液体， 最后向酚层 （下层） 加入 110 体积的含 2g/L 巯基二醇的 0.1mol/LTrisHCL 缓冲进（pH8.0），分装后避光 20 度保存，至少可用一个月， 2、氧仿 3、异戊醇 4、氯仿异戊醇混合液，比例为 24：1 或 9：1 8 一羟基喹啉为黄色化合物，是一种抗氧化剂又是酶的

19、部分抑制剂和金属离子的弱结合剂 加入 8 一羟基喹啉使酚层呈黄色， 又可作为识别的标记 实验操作： l、样品加入等体积和酚或酚氯仿（1：1）混合液 2、上下颠倒很匀 3、室温，12000 转分钟，离心 5 分钟如蛋白质较多或分界不清时，可离心 10 分钟。 4、吸取上层（水层）移置另一新的离心管中 5、加入等体积酚氯仿异戊酸（25：24：1）溶液重复步骤 2、3、4 6、加入等体积氯仿异戊酸（24：1）溶液重复步骤 2、3、4。 7、乙醇沉淀核酸（见核酸的沉淀纯化） 二、核酸的纯化（醋酸钠乙醇沉淀法） 实验原理：核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，可以与许多 1 价、2 价离子结合形成盐类， 后者

20、在有机溶剂中不溶解也不变性 在较低温度下形成沉淀 实验试剂： 1、3molL 醋酸钠缓冲液，pH5.2：称取醋酸钠（NaAC3H20）408.1g，由于 800ml 水中，用冰醋酸调节至 pH5.2，加重蒸馏水至 1000ml分装后高压灭菌（以下称 3mol/L 醋酸钠缓冲液） 2无水乙醇及 70（VV）乙醇 实验操作： 1、将含核酸的溶液用移液器转至一新的 Eppendorf 离心管，同时测量合算溶液的体积 2、加入 110 体积的 3molL 醋酸钠缓冲液。使醋酸钠的终浓度为0.3mo1/L 3、下颠倒混匀后，准确加入 2 倍体积（RNA 为 2.5 倍体积）的预冷无水乙醇，颠倒混匀，置冰

21、浴中 1530min 或一 2030min。 4、412000rmin，离心 15min 5、手持 Eppendorf 成 45 度角，使核酸沉淀面向上，用微量移液器或连接真空泵的吸头不可接触沉淀物 6、向管中加入预冷的 70%乙醇至 23 体积混匀漂洗，以除去残余的盐 7、412000rmin 离心 2min，如步骤 5 吸取上清液 8、不盖管盖置室温 10l5min 或真空中 2min，使乙醇挥发。 三、核酸浓度的测定（DNA） 实验原理：构成核酸的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使核苷核和核酸在紫外线光具有特征性的吸收光谱，最大吸收峰为 260nm。窄光带紫外分光光度计，长 260nm，比色

22、杯光径 1cm，1 个吸光度值（1A）相当于 50ug/ml 双螺 DNA，40ug/m1 单螺旋 DNA 或 RNA），20ug/ml 寡核苷酸 实验步骤： 1、取 DNA 溶液 10ul，加双蒸馏水 600ul（即稀释 61 倍）。 2、用双蒸馏水调零，测定 260nm 和 280nm 的吸光度值（A260、A280） 3、DNA 浓度（ugul）A26050611000 4、 DNA 纯度： A260/ A280的比值应大于 1.7 以上， 若样品中含有蛋白质 （吸收峰在 280nm）等杂质时，比值下降，应重新纯化 实验十一实验十一 聚丙烯酰胺凝胶不连续圆盘电泳聚丙烯酰胺凝胶不连续圆盘电

23、泳 一、实验原理：利用各种载脂蛋白在一定 pH 下所带电荷数量及颗粒大小不同的差异，从而在电场中获得不同的迁移庇，达到分离测定的目的， 二、实验试剂： 1、凝胶储备液制备及工作混合液比例表 2、脱色剂：乙醇 1000ml，冰醋酸 320ml 加水至 4000ml 3、染色剂：考马斯蓝 0.46g，溶于 400ml 脱色剂中。 4、溴酚蓝水溶液：溴酚蓝 0.05g，水溶至 100ml。 实验操作。 1、 按上表所给的比例配制分离胶， 3 号试剂要最后加， 之后快速混匀 立刻往已封底中的玻璃管中加入上述分离胶约至管长的 23 处，然后沿管壁轻轻加入一薄层水封闭空气一般在 20室温中约 40 分钟左

24、右便形成凝胶倾去水层， 倒立在滤纸上将管内水分沥干， 接着按上表已制浓缩胶，6 号试剂最后加入，快速混匀，立刻加在分离胶之上距管口上缘 8mm 处，其上再轻轻加一薄层水，令其在日光灯照射下聚合，约 20 分钟左右即可聚合完毕，倾去水层 2、将管底口封闭打开，将装柱完毕的玻璃管插入电泳槽孔中（分离胶在下面），周围不得漏水 3、 加样： 先将 4 号液稀释 （取 2ml4 号液， 加水至 6m1） 取血清 0.5m1，加 4 号液释液 1.5ml，加 7 号 3 滴及溴酚蓝试剂 3 滴，混匀检查凝胶管上下口是否已浸在缓冲液中，否则要进行调整用微量加液器吸取上面已经准备好的样品 3035ul（约含血

25、清 7.5ul），沿管壁慢慢将加样器针头伸到上端胶面处将样品缓缓加到胶面上（要成层不要分散开来）。 4、电泳：上槽接负极，下槽接正极，盖上电泳槽盖，开启电泳仪开关调节输出电压。使每管电流量为 12mA，待溴酚蓝批示剂进入分离胶后，加大输出电压，使每管电流增至 45mA，当溴酚蓝指示剂泳动到距管下次端 0.5cm时停止电泳 5、剥胶：比电泳槽上取下胶管，用长针头注射器吸满水后，将针头紧贴管壁慢慢插入，且边插边旋转玻璃管，边将水注入，使凝胶与内管壁分离开，令其脱出，放入染色液中。 6、固定与染色：让剥出的胶柱在染色液中染色 30 分钟，凝胶被国定，蛋白质染上蓝色，成若干个圆盘样区带。脱去浮色：将染

26、色后的胶柱轻轻转入小试管中，加入脱色剂浸泡，并多换洗几次，直至背景清晰及区带清晰为止 实验十二实验十二 方法学评价（批内重复性试验）方法学评价（批内重复性试验） 一、实验目的：考察实验方法的随机误差，评价该方法的精密度。 二、实验步骤： 1、在短时间内，对同一份样品按定的操作方法重复测定 20 次。 2、 统计处理： 对所测定结果 按下式分别计算均值 （X） 、 标准差 （SD） 、变异系数（CV）。 XXn SD(X-X)2n1 CVSDY100% 3、评价：一般分析 CV 值小于 50，精密分析 CV 值小于 2% 实验十三实验十三 方法学评价（回收试验）方法学评价（回收试验） 一、实验目

27、的：检测比例系统误差，以衡量分析方法的准确度 二、实验步骤： 1、样品制备： 基础样品：血清 2.0ml蒸馏水 0.1ml 低浓度回收样品：血清 2.0ml4mmol/L 钙标准液 0.1ml 高浓度回收样品：血清 2.0m125mmo1/L 钙标准液 0.1m1 2、按下式分别计算加入浓度 加入浓度标准液浓度标准液量/血清量标液量 3、分别测定各, 样品管的浓度 3 次以上 4、计算。分别计算样品回收浓度和回收率 5、回收浓度回收样品测得浓度基础样品测得浓度 回收率回收浓度/加入浓度100% 实验十四实验十四 方法学评价（干扰试验）方法学评价（干扰试验） 一、 实验目的： 考察该方法的恒定系

28、统误差， 以评价候选方法的准确度 二、实验步骤： 1、样品制备： 基础样品：血请 1.8m10.2ml 低浓度回收样品：血清 1.8m163umol/L 肌酐标准液 0.2ml 高浓度回收作品：血清 1.8m1414umol/L 肌酐标准液 0.2ml 2、按下式分别计算加入浓度 加入浓度标准液浓度标准液量血清量标液量 3、分别计算各样品管的浓度 4、计算干扰值： 干扰值干扰样品测得浓度干扰样品测得浓度 5、如何消除干扰（讨论） 实验十五实验十五 LevyLevyJenningsJennings 质控目的绘制质控目的绘制 一、实验目的： 1、明确临床生物化学室内质量控制的意义。 2、 掌握 L

29、evyJennings 质控图的绘制及结果解释和失控原因的分析方法。 二、实验步骤： l、OCV 和 RCV 的计算：分别在 OCV 和 RCV 的条件下，对同一批号的质控血清测定不少于 20 次，分别计算出均值、标准差、变异系数。 2、绘图： （）在纵坐标上标出 X、X 2SD、X 3SD 的标志，并将其具体数值标在左坐标尺上。 （）用红笔画出 X 2SD 线，用蓝笔画出 X 3SD 线即成为一张OCV （或 RCV 的空图、 其中每一小格代表 SD10， 同时还应添齐图纸上方的各项：实验项目、测定单位、血清来源和批号、起止日期、主要仪器及使用波长等 （）在图纸下方日期、同定值、操作者按原始

30、计录添入相应内容。日期一栏内，在 OCV 测定中，应改为检测批次（或序号）未做测定的节假日，星期日在图上做空格处理。 （）画出每个检测值所对应的图点：在图上的横坐标为其日期，而纵坐标为测定值。 失控处理： 1、简单迅速回顾整个操作，分析最可能发生误差的步骤，核对计算是否正确。若操作是手工的，要核对吸管是否用错，仪器功能是否正常，比色杯是否清洁等。 2、如上述无误，再将质控血清重复测定一次，看结果是否有改进，如有改进，说明误差很可能为操作错误所致如加标本量、试剂量的错误，波长或滤光片选择错误等偶然误差所致 3、如重做后结果仍不在允许范围，用一瓶新的质控血清重做。观察结果能否更正。 4、如仍不能解

31、决问题，用定值血清与质控血清同时测定。如定值血清结果满意，说明原有一批质控血清己变质或污染 5、如仍不能解决问题，应重新校正仪器，或者更换新的标准液以及重新配制试剂，然后重新操作查找原因。 实验十六实验十六 改良改良 MonicaMonica 质控图质控图 一、实验目的： 1、掌握室间质控的意义。 2、掌握改良 Monica 质控图的绘制及结果判定。 二、实验步骤： 1、对同一份质控血请进行双份测定。 2、 分别以 T0.8CCVT 和 T 土 1.5CCVT 作为最大警告值和最大允许值，画出警告线和最大允许线 3、画出每个测定值所对应的图点，每个图点在图上的横坐标为其日期，纵坐标为测定值，连

32、接每日所测两点，联连线中点用红点标出 4、连接所标红点 5、添好其它项目。 实验结果分析与判定：精密度准确度 室间质评成绩 实验十七实验十七 临床生化实验室参观临床生化实验室参观 一、实验目的： 1、了用临床生化实验室的合理布局。 2、掌握生物化学测定方法学种类，熟悉全自动生物化学分析仪的使用及相关参数的设置 3、熟悉实验室数据的处理和合理使用 实验十八实验十八 血清总蛋白测定（双缩脲法）血清总蛋白测定（双缩脲法） 一、实验原理：凡分子中含有两个甲酰胺基（CONH2）的化合物都能与碱性铜溶液作用， 形成紫红色化合物这一反应称双缩脲反应蛋白质分子中有许多肽健（CONH2）都能起此反应，而且各种血

33、浆蛋白显色程度基本相同 二、实验试剂： 1、蛋白标准液：收集混合血清，用凯氏定氮法固定蛋白含量定值参考血清。 2、双缩脲试剂： 三、实验操作：按表进行 混匀，置 2530min。（3710min）在波长 540nm。 比色杯直径 1.0cm 以空白管调零、读取各管光密度。 四、计算 血清总蛋白 g/L测定管（或校正）吸光度/标准管吸光度蛋白标准液浓度（gL） 五、注意事项： 1、血清蛋白质含量一般用 g/L 表示，因各种蛋白质的分子量不同，不能用 mol/L 表示。 2、酚酞、溴磺酞钠在碱性溶液中显色影响双缩脲测定结果，右旋糖酐可测定管浑浊亦影响结果，理论上这些干扰均可用相应的标准空白管来除，

34、如标准空白管吸光度太高，可影响到定的准确度 3、含脂类极多的血清，显色应浑浊不清，可用乙酸 3.l 抽提后再进行比色。 参考值：6080gL 实验十九实验十九 血清白蛋白溴甲酚绿法测定血清白蛋白溴甲酚绿法测定 一、实验原理： 在 pH42 的缓冲液中，白蛋白作为一种阳离子，结合阴离子染料溴甲酚绿（BCG）形成蓝绿色化合物，在波长 630nm 处有吸收峰，其吸光度与白蛋白浓度成正比例，与同样处理的白蛋白标准液比较可求得血清中白蛋白含量。 二、实验试剂。 1、 0 5molL琥珀酸缓冲贮存液 （PH4 0） 溶解Na0H 10g琥珀酸 56g于 800m1 蒸馏水中， 用 1molL 氢氧化钠调至

35、 pH4.10.05 加水稀释至 1000ml此液置 4冰箱保存 2、 BCG 已存液 （10molL） ： 溶解 BCG （MW720.22） 1.80g 于 5m1 Na0H中用蒸馏水稀释至 250ml 3、叠氮钠贮存液：溶解叠氮钠 40g 于 1000ml 蒸馏水中。 4、聚氧化乙烯月桂醚（BYij35）贮存液溶解 2.5g 聚氧化乙烯月桂醚于 80ml 蒸馏水中，加热助溶然后加蒸馏水至 10ml 5、BCG 试剂：与 1L 容量瓶中盛蒸馏水约 400m1，加琥珀酸缓冲贮存100ml，用吸管准确加入 BCG 贮存液 80m1，并用蒸馏水将吸管壁上残留的少量染料冲洗到液体中加叠氮钠 25m

36、l，聚氧化乙烯月桂醚 25ml 最后用蒸馏水稀释到刻度，配好 BCG 试剂应为 4.15 土 0.05。 6、40gL 白蛋白标准应用液 三、实验操作：按下表进行 波长 630nm。用空白管调零，用定量加液器加 BCG 应用液与血清标本混合后， 立即在 30 土 3S， 读取吸光度， 如果标本混浊可做标本空白管 （血清 0 02m1加琥珀酸缓冲液 40ml）以琥珀酸缓冲液调零测定标本空白管吸光度，测定管吸光度减去标本空白管吸光度后计算结果 四、计算： 血清白蛋自（gL）测定管吸光度标准管吸光度标准管白蛋白浓度（g/L） 同时测定血清标本的总蛋白浓度，减去血清白蛋白浓度，即得血清球蛋白浓度，并可

37、计算血清白、球蛋白比值 参考值：3555g/L 五、注意事项： 1、实验证明 BCG 不但与白蛋白显色，而且与各种蛋白成分显色其中以球蛋白、转铁蛋白、融珠蛋白更为显著，其反应度较该蛋白稍慢，故有人主张用定值参考血清作标准比较理想，BCG 与血清特异结合后，在此 30 秒读取吸光度，可明显减少非特异性结合反应. 2、当 60g/L 白蛋白标准与 BCG 结合后，溶液光径 1.0cm。，在 630nm测定的吸光度 0811 士 0035，。如达不到此值，表示灵敏度较差。 3、此法测定正常血清标本的批间异系数63左右 4、试剂中的聚氯化乙烯月桂醚也可用其它表面活化剂代替，如吐温20 等，用量为 2m

38、lL。 实验二十实验二十 血浆纤维蛋白原测定血浆纤维蛋白原测定 一、实验目的：通过此实验，使学员掌握血浆纤维蛋白原测定原理、方法及试剂的配制。 二、 实验原理： 在血浆中加入适量的亚硫酸钠； 使纤维蛋白原形成沉淀，其余的蛋白质均尚在溶液中 将沉淀溶于氯化钠溶液中， 双缩脲测定蛋白质的量 三、实验试剂： 1、12.5%亚硫酸钠溶液：称取无水亚硫酸钠（AR 或 GP125g 溶于蒸馏水中并用蒸馏水稀释至 1000m1 2、9gL NaCL 溶液 3、双缩脲试剂 4、标准白蛋白血清 四、操作方法：。 在 15100mm 试管内加入血浆 0.5ml，再加水 125gL 亚硫酸钠溶液混匀，置于 37水溶

39、 15min 或更长时间，取出、离心、倾弃上清液，沉淀再以 125gL 亚硫酸钠溶液洗三个多小时洗时先同小量亚硫酸钠使它分散均匀离心应倾弃上请液，将试管置于滤纸上，淋干管内液体于管内加入 9gL NaCL 1.0ml，充分混台使沉淀溶解即为“测定管”，在另一试管中用 0.lm1 刻度吸管准确加标准血清 0.05m1 并加入 9gL NaCL 溶波 0.95m1，混合作为标准试管,在另一试管中加入 9gL 氯化钠溶液 1ml 作为空白管 在空白管标准及测定管内各加双缩脲试剂，混合后的室温放置 30min540nm波长进行比色以空白管校正吸光度到零点，读取各管内吸光度读数。 五、计算： 测定管吸光

40、度标准管吸光度O.1标准血清蛋白浓度纤维蛋白原 gL 血浆 六、注意事项： 1、亚硫酸钠与血浆作用，有时 10min 尚不能使纤维蛋白析出，可适应延长时间 2、以亚硫酸钠先洗涤沉淀是为了支除纤维蛋白以外的蛋白质，所以在洗涤时须将沉淀均匀分散 3、在洗涤沉淀时，如纤维蛋白原被亚硫酸钠溶液全部或部分溶解可再将试管置 37水浴，以待纤维蛋白原析出 选择标准液时不能任选未知性能的蛋白作为血清蛋白质的标准液。 实验二十一实验二十一 血清粘蛋白测定血清粘蛋白测定 一、实验原理：0.6mol/L 过氯酸测定血清中蛋白质时粘蛋白不被沉淀，而存留于滤液中， 再加磷钨酸使粘蛋白沉淀， 然后以酚试剂测定其中蛋白质的

41、含量。 二、实验试剂： 1、154mmol/L 氯化钠溶液 2、1.8mol/L 过氯酸：取含水量为 7072过氯酸 28ml，加蒸馏水稀释 200ml 并标定之 3、17.74mmol/L 磷钨酸溶液，称取磷钨酸 5g 溶于 2mol/L 盐酸中并加至 100ml。 4、 酚试剂： 于 1500ml 球形烧瓶中加钨酸钠 100g， 铝酸钠 （Na2MoO4 2H20）25g，水 700ml，浓磷酸 50ml，浓盐酸 100ml：缓缓用细流蒸馏 10h。取下冷凝管，加硫酸锂 75g，蒸馏水 50ml，并加溴水 23 滴，再煮沸 15min，以除去多余的溴，冷却后稀释至 1000ml，制成的酚试

42、剂为鲜明黄色，置棕色瓶保存，用前取出一部分，以等量蒸馏水稀释之。 5、1.88molL 碳酸钠溶液。 6、标准酪氨酸溶液（1ml0.05mg）；精确称取酪 AA5mg，以 0.lmolL 盐酸溶液并稀释至 100ml。 三， 实验操作： 血清 0.5ml， 加 154mmo/L 氯化钠 4.5ml， 混匀， 1.8mol/L，过氯酸溶液 2.5ml，静止 10min，用定量滤纸过滤或离心取溶液 2.5ml，加17.74mmolL 磷钨酸 0.5ml 混匀，静止 10min，以 3000rmin 离心 10min，倾去上清液沥干，再加磷钨酸溶液 2ml，悬浮沉淀物，同法离心后倾去上清液取沉淀备用

43、。 按下表测定 混匀，放置 37水浴 15min，取出比色，用分光光度计 650nm，比色杯光径 1.0cm，以空白管调零，读取各管吸光度。 四、计算： 血清粘蛋白（gL）测定管吸光度标准管吸光度1.785血清粘蛋白（mgL）（以酪氨酸计）测定吸光度标准管吸光度75 参考值：以蛋白计为 0.710.87g/L 以酪氨酸计为 33.8 土 27mg/L 五、注意事项： 1、本法影响因素很多。正常值观察报告不一，故无论用蛋白或酪 AA表示结果，均须说明所采用的方法及正常值。 2、操作中血清与 154mmol/L 氯化钠液稀释液必须准确。 3、滴加过氯酸的速度宜慢。以 3040s 时间内加完 2.5

44、ml 为宜，速度过快易发生混浊，离心后不易得到清晰的上清液。 4、过氯酸沉淀血清蛋白在 30以下进行较好，否则结果编低。 5、过氯酸为强氧化剂，应按危险品条例保存。 实验二十二实验二十二 血清葡萄糖测定（一）血清葡萄糖测定（一） 一、实验方法：葡萄糖氧化酶法（GOD） 二、实验原理：葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖醛酸，并产生过氧化氢：葡萄糖十 2H2OO2葡萄糖酸十 2H2O2。 在色原性氧受体（如联大菌香胺，4 氨基安替比林偶联酚）的存在下，过氧化物酶催化过氧化氢，氧化色素原，生成有色化合物。 三、实验试剂： l、lmolL 磷酸盐缓冲液（PH7.0）：溶解无水磷酸氢二钠 8.67g

45、及无水磷酸二氢钾 5.3g 于 800ml 蒸馏水中，用 lmoL/L 氢氧化钠或盐酸调节 PH 值至70，然后用蒸馏水稀释至 1L 2、酶试剂：取葡萄糖氧化酶 1200W 过氧化物酶 1200w，4-氨基安替比林 10mg，叠氮钠 10Omg，加上磷酸盐缓冲液至 80ml 左右，调节 pH7.0 加磷酸盐缓冲液到 100ml，置冰箱保存，至少可稳定三个月。 3、酚溶液：重蒸馏酚 100mg 溶于 100ml 蒸馏水中，贮存棕色瓶中 4、酶酚混合试剂；酶试剂和酚溶液等量混合，在冰箱内可以存放一个月 5、葡萄糖标准应用液（5.6mmol/L） 四、操作：取数支 16mmm100mm 试管，按下表

46、进行操作。 混匀，置 37水浴中，保温 15min，用分光光度计，波长 505nm，比色杯光径 1.0cm，以空白管调零，分别读取标准管及测定管吸光度。 五、计算： 血清葡萄糖 mmol/L测定管吸光度/标准管吸光度 参考值：空腹血清葡萄糖为 3.896.11mmolL 六、注意事项： 1、 新配制的葡萄糖标准液主要是 型， 故需放置 2h 以上 （最好过夜） ，待等适衡后方可应用 2、葡萄糖氧化酶催化反应的最适 PH 范围（6.58.0），但当 PH 低至6.6 时，反应终点的吸光度略有下降，选用 PH7.0 土 0.1 3、由于温度对本法影响较大，故试剂从冰箱取出达到室温时，再进行测定 4

47、、测定样本以草酸钾氟化钠为抗凝剂的血浆为好。 实验二十三实验二十三 血清中葡萄糖测定（二）血清中葡萄糖测定（二） 一、实验目的：通过此实验使学生掌握邻甲苯胺法测血糖的原理，试剂的配制学会邻甲苯胺法测定血糖的方法。 二、实验原理：葡萄糖与邻甲苯胺在强酸溶液中加热，葡萄糖的醛基与邻甲苯胺缩合成葡萄糖基胺后者脱水生成席夫（Schiff）碱，再径结构重排生成有机化合物，吸水峰 630nm。 三、实验试剂： l、 邻甲苯胺试剂： 940ml 冰醋酸中加入硫脲 1.5g 邻甲苯胺 60ml 混合 直至硫脲完全溶解，置棕色瓶中 2、 12mmol/L 苯甲酸溶液： 于 900ml 蒸馏水中加入苯甲酸 （MW

48、122.12）1.46g，加热助溶，冷却后置于 1L 容量瓶中，加蒸馏水至刻度 3、葡萄糖标准贮存液（100mmol/L）：称取无水葡萄糖（MW180.16）预先置 80烤箱干燥至恒定，移置干燥器内保存）1.802g，溶解于 80ml 苯甲酸溶液中移置 100ml 容量瓶中，再加苯甲酸溶液至刻度 4、 葡萄糖标准应用液 （5mmol/L） ： 葡萄糖标准贮存液 50ml， 置于 100ml容量瓶中加苯甲酸溶液至刻度 四、实验操作；取数支 16mm150mm 试管，按下表进行操作： 混匀后，置沸水浴中加热 12min，取出置冷水中冷却 5min；分光光度计630nm，比色杯光径 1.0cm 空白

49、管调零，读取标准管与测定管吸光度。 五、计算： 体液葡萄糖 mmolL测定管吸光度/标准管吸光度5 参考值：血清葡萄糖为 3.896.11mmolL70110mg/dL 六、注意事项： 1、本法不需除蛋白，邻甲苯胺试剂只与醛糖显色，血液中其它还原物质基本无影响。 2、葡萄糖与邻甲苯胺试剂显色的深浅及稳定性与试剂中邻甲苯胺浓度冰醋酸及加热时间有关 因此， 测定管、 标准管、 空白管的加热时间及温度必须一致，每批测定数不宜过多，水浴中水量要大，水面应超过试管中试剂液面以便能较好的控制反应条件。 3、最终反应液偶尔会产生混浊，最常见的原因是高脂血症；此时可向 3ml显色液中加入异丙醇， 充分混匀溶解

50、脂质， 可清除浊度， 所测得吸光度乘以 1.5 实验二十四实验二十四 糖化血清蛋白测定糖化血清蛋白测定 一、实验原理： 血清葡萄糖能与白蛋白及其它血清蛋白分子 N 末端的氨基上发生非酶促糖化反应，形成高分子酮胺结构此酮胺结构能在碱性溶液中与硝基四氮唑蓝（NBT）发生还原反应，生成用甲胺，并以 1脱氧1吗啉果糖（OMF）为标准参照物进行比色测定 二、实验试剂： 1、0.1mmol/L 碳酸盐缓冲液，PH10.8：无水碳酸钠 9.54g，碳酸氢钠0.84g， 溶于蒸馏水并稀释至 1000ml。 2、0.11mol/L NBT 试剂：称取氯化硝基氮唑蓝 100mg，用于上述缓冲液溶解并稀释至 100

51、0mL置冰箱保存，至少可稳定 3 个月； 3、4mmol/L DMF 标准液：称取 DMF99.6g，熔于 40g/L 牛血清白蛋白溶液 100ml 中 三、实验操作：测定管加待检血清（血浆）0.1ml，空白管加蒸馏水 0.1ml，各加 37预温的 NBT 试剂 4ml，混匀，置 37水浴准确 15min，立即取出，流水冷却（低于 25），冷却后 15 分钟内分光光度计波长 550nm，10nm 光径比色杯以空白管调零，读取测定管从标准曲线查得结果，以果糖胺 mmol/L 报告。 标准曲线制备： 取 4mmol/L DMF 标准液用牛血清蛋白溶液 （40g/L） 稀释成 1、 2、 3、 4m

52、molL，并以血清蛋白，40g/L 与测定管同样操作，读取各浓度 DMF 相应的吸光度，以 DMF 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制成标准曲线。浓度在 4mmol/L 以内与吸光度呈线性关系 参考值：1.9 十 0.25mmol/L 四、注意事项： 1、PH 值、反应温度，反应时间对本实验影响较大，必须严格控制 2、血清蛋白经非酶促糖化反应可形成酮胺结构。DMF 在适当的 PH 值及温度条件下，经过结构重排可由氧环式结构形成 1脱氧氨基2酮基的酮胺结构，因此用它作为标准参照物是合理的以 mmol/L 报告结果较为理想 3、固定值冻于精化血红蛋白做标准，测定结果更稳定，因为不同的标准物时所测得结

53、果不完全一致，最好建立实验室的参考值。 实验二十五实验二十五 血清总胆固醇测定血清总胆固醇测定 一、实验方法：异丙醇抽提，高铁硫酸显色法 二、 实验原理： 采用异丙醇， 抽提时用氧化铝吸附胆红素等于干扰物 （也吸附磷脂与甘油，放此抽提液可用于化学法测 TG）。离心后在上清液中加入高铁硫酸试剂显紫红色，显色程度与 TG 浓度呈正比 三、实验试剂： 1、异丙醇 2、氧化铝（层析用中型氧化铝，用蒸馏水洗数次，倾去不易下沉的细颗粒，吸滤干后在 110烘箱中活化至少 8h，贮藏在密闭容器或干燥器内 3、三氯化铁贮存液：称取 FeCl3贮存液与浓硫酸（优级纯）按 1：1 体积混合，室温放置可稳定 2 个月

54、左右 4、显色剂；1g/L（即 0.18/dL Fecl 贮存液与浓硫酸（优级纯）按 1：1 体积混合，室温放置可稳定 2 个月左右 5、胆固目标准液：精确称取胆固醇（纯度 99.5%以上）200mg，用异丙醇配成 100ml 存 4冰箱内，临用时达到室温后才可吸取 四、实验操作： l、吸取血清及标准液（或定值血清）20Oul，分别放入带塞离心管中，向管底吸入异丙酸 5.0ml， 冲散血清， 使蛋白沉淀成细颗粒， 加塞混匀后放置 6O水浴中 1min，加入氧化铝（或沸石合剂）1g 加塞，将试管横卧固定在震荡器上振 10min（也可用旋祸混合器或手摇）离心 2、 测定管及标准管中分别加入相应的上

55、清液 1ml， 空白管加异内醇 lml，放入 60水浴中 1min，分别沿管壁加入显色剂 3ml，充分混匀继续放在 60水浴中 15min，然后置室温冷却后比色 3、用光度计比色，波长 530550nm，以空白管校零点，读取各管吸光度，用 1cm 比色杯时，线性范围至少可达 10.3mmol/L（400g/dL） 五、计算： 血清胆固醇浓度测定管吸光度/标准管吸光度标准液胆固醇浓度 六，注意事项。 1、Fe3磷酸硫酸者颇多，但以本法测定显色稳定，灵敏度比 LB反应高约 5 倍，但显色反应的干扰因素多于 LB 反应法 2、本法可以同时测定甘油三脂和胆固醇 3，抽提波与显色剂混合时产生热，发落程度

56、与显色深浅有关。故操作时 应注意 F 列各点。 （l）同一批标本测定时需用同样口径及厚度的试管，为便于混合，试管口径 最好大些。 （2）沿管壁加人显色剂，须与异丙醇抽提血清为两层，然后迅速混合，不可 边加边摇否则显色不完全。 （3）显色剂必须加一管混合一管，不可成比加完一起混合，混合后手法要一 致。 4、 所有试管和比色杯均须干燥， 浓 H2SO4必须优级纯密闭保存防止吸水。 5、本法准确性接近 ALBK 法，回收率接近 100%，重复性好，熟练操作者 内 CV1%天与天之间2%。 实验二十六实验二十六 血清甘油三酯（血清甘油三酯（TGTG）测定（化学法）测定（化学法） 一、实验方法：乙酸丙酮

57、法 二、实验原理：本法用异丙醇抽提血清 TG，氧化铝吸附磷脂及游离甘油 氢氧化钾皂化，过碘酸钠氧化生成甲醛，甲醛与乙酸丙酮在氨离子存在下加热生 成黄色的 3，5 二乙酰-1，4 二甲基吡啶Hantgsch 止反应）显色程度与标本中 TG 浓度成正比。 三、实验试剂： 1、异丙醇（分析试剂） 2、氧化铝（中性、层分用）：用蒸馏水洗数次，倾去不易下沉的细颗粒，吸滤干后在 110烘箱中活化至少 8h，贮存于密闭容器或干燥器中 3、50gL 氢氧化钾，内含异丙醇 40% 4、氧化剂：每升中含有无水醋酸铵 77g 冰醋酸 60ml，过碘酸钠 650ml 5，显色剂：乙酰丙酮 075ml，异丙醇 20ml

58、，用蒸馏水稀释至 100ml，贮存 棕色瓶内 6，三油酸甘油酯标准液（226mmol/l 即 200g/dl）精确称取纯三油酸甘油酯 200mg，用异丙醇配成 100ml，紧塞贮 4冰箱中 四、实验操作： 1、抽提：方法同胆固醇相同 2、皂化、氧化，显色、测定管与标准管分别加人相应的抽提液 1.0ml，空 白管中加异丙醇 lml，各管中加人 5Og/LKOH 溶液 O.2ml 皂化，放置 60水浴15min，冷却后加入氧化剂 0.5ml，混匀后加人显色剂 O.25ml，再混合，置 60水浴中 20min，取出冷却。 3、比色：波长 410nm 1cm 光径比色杯，以空白管调零，读取各管光密度。

59、 五、计算： 血清甘油三酯=测定管吸光度/标准管吸光度标准浓浓度 六、注意事项： 1、本法所用的皂化、氧化、显色等试剂都很稳定，在室温中可保存半年， 但最好少量分装使用，以减少试剂污染引起空白管色加深 2、皂化、氧化与显色的温度和时间对显色后的吸光度均有影响因此每批 标本都须做好标准管，而不宜从标准曲线查得结果，显色后的吸光度基本稳定， 显色放在室温 20不避光的条件下，吸光度略会增高，但对测定结果影响不大。 3、甲醛以乙酸丙酮反应产物的吸收峰在 415nm，用 721 型分光光度计时， 420nm 比色结果满意。 4、本法回收试验及重复性好，准确性能符合临床要求。 实验二十七实验二十七 AP

60、OA APOBAPOA APOB 测定测定 一、实验原理：火箭免疫电泳法是单向免疫扩散法的一种改进，通过应用直 流电（稳压稳流）使抗（APOA1 和 B）在含有特异性抗体的琼脂糖凝胶中扩散， PH8.6 时抗原向阳极移动，在泳动图中与凝胶中的抗体反应，逐渐形成类似火箭 的沉淀锋，其锋高（或锋面积）与抗原浓度成正比，故可作抗原定量。 二、实验器材： l、电压用稳压整流器，有流水冷却装置的电泳槽（国产电泳仪一般都可使 用） 2、水平台。 3、10cmX7cm 玻璃板及同样大小的聚脂薄膜（选择不被染色的投影仪用薄 膜即可） 4、搭桥用纱布及滤条。 5、粗滤纸若干张。 6、琼脂糖胶打孔器。 三、实验试