分子生物学实验指导_LSW

1、实验一 质粒DNA的小量制备（碱裂解法）一、 实验原理 所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：细菌培养物的生长；细菌的收获和裂解；质粒DNA的提取与纯化。 本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是，加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞壁裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附

2、着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀法或氯化铯溴化乙锭梯度平衡法。 环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；若质粒DNA经过适当的核酸内切限制制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子（L DNA），通称L构型。质粒DNA Mr一般在106107之间，常以kb表示

3、（l kb双链DNA=6.6×105）,如质粒pUC19的Mr为1.8×106 (2.69 kb)。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管Mr相同，仍具有不同的电泳迁移率，其中走在最前沿的是scDNA，其后依次为L DNA和ocDNA。二、 实验材料与设备1. 用品与仪器可调微量取样器（20 l、l 000 l），Tip头，1.5 ml Eppendorf管，常用玻璃仪器，恒温空气摇床，台式高速微量离心机，旋涡振荡器。含pUC19质粒DNA的大肠杆菌。2. 试剂LB（Luria-Bertani）培养基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用

4、10mol/L NaOH调pH至7.0，高压灭菌。溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌(6.895×104Pa) 15min，贮存于4。溶液：0.2 mol/L NaOH，1SDS（临用时配制）。溶液：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAC，11.5ml冰醋酸，28.5ml H2O）。所配成的溶液钾离子浓度为3 mol/L，醋酸根离子浓度为5 mol/L。灭菌。V（酚）：V（氯仿）=11：酚需在180重蒸，加入抗氧化剂8羟基喹啉，终浓度为0.1，并用Tris

5、83;HCl缓冲液平衡至pH7.6。氯仿中加入异戊醇V（氯仿）V（异戊醇）=241。1×TE/RNaseA：10 mmol/L Tris·HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA；20g/ml RNaseA。无水乙醇，70乙醇，氨苄青霉素贮存液50 mg/ml。三、 实验操作程序1 细菌的生长与收获（1）将35 ml含氨苄青霉素（50 g/ml）的LB加入到容量为15 ml、通气良好的长玻璃试管中，接入一单菌落，于37振荡（350 r/min）培养过夜。（2）取1.5 ml细菌培养物加入Eppendorf管中，以5 000 r/min离心2 min去掉上清液，使细菌沉淀

6、尽可能干燥。2 碱裂解法（1） 将细菌沉淀重悬于100 l预冷的溶液中，充分分散混悬细菌。（2） 加入200 l新配制的溶液，盖紧管口，快速颠倒数次，充分混合，要确保离心管的整个内表面均与溶液接触，冰浴放置5min。（3） 加入150 l预冷的溶液，盖紧管口，颠倒数次使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，冰浴放置5min。（4） 在4以10 000 r/min离心5min，转移上清液到另一个Eppendorf管中。（5） 向上溶液加入等体积/酚/氯仿，振荡混匀，以5 000r/min离心2 min，转移上层水相至新的Eppendorf管中。（6） 向水溶液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置5

7、min，以10 000 r/min离心5min，倾去乙醇液，将离心管倒置于吸水纸上，吸干液体。（7） 加入1 ml 70乙醇洗涤质粒DNA沉淀，按步骤（6）所述方法弃上清，于空气中或用电吹冷风使质粒DNA沉淀干燥。（8） 用2030 l含RNaseA酶（20 g/ml）的TE溶解沉淀，4贮存。3 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA通过琼脂糖凝胶电泳方法可鉴定。通常情况下经碱裂解法制备的质粒DNA电泳时可见23条带。四、 讨论 1细胞的裂解作用是分离质粒DNA实验操作的关键步骤。通常是加入溶菌酶或SDS来促使大肠杆菌细胞裂解的。如果寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低质粒DNA的回收率。理想的状况是使每

8、一个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体DNA分子。2提取过程中，除规定的实验条件外，应尽量保持低温，避免过酸过碱，操作中手法要温和，防止机械剪切，尽可能避免脱氧核糖核酸酶对质粒DNA的降解和破坏。3采用酚/氯仿去除蛋白的效果较单独使用酚或氯仿好。一般来讲，要将蛋白质尽量除干净，需多次抽提一次，已能达到实验要求。注意在吸取上层水相时勿吸入下层有机相混于其中。4 乙醇沉淀质粒DNA是最常用的沉淀方法，通常采用冷乙醇（无水乙醇贮存于-20），沉淀条件为-20，1 h。因本实验为微量快速，室温下数分钟DNA即可沉淀，虽然DNA量少，但纯度相对高（因为低温长时间杂质也一并沉

9、淀下来），有利于以后的酶切及电泳结果。沉淀方法也可用乙丙醇，只需0.54倍体积常温下即可将DNA完全沉淀出来，这对于大体积的质粒DNA沉淀十分有效。但缺点是常将盐等亦同时沉淀出来，因此需要用70乙醇很好地洗涤。一般来讲广泛应用的沉淀试剂还是乙醇。实验二 DNA的酶切一、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类：类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。类由两种酶组成：一

10、种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列：5'-GAATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如Sma: 5'-CCCGGG-3')；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端： 5&

11、#39;GAATTC3' 5' G AATTC3' 3'CTTAAG 5' 3' CTTAA G5' DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入

12、第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。 二、材料、试剂和仪器 1 材料：质粒DNA 2 试剂：限制性内切酶、ddH2O3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪 实验程序：取2只清洁、干燥、无菌的Eppendorf管，编号，按照限制性内切酶Hind、EcoR试剂盒说明书用量，用微量注射器加入各种试剂质粒DNA和pBR322，最后用双蒸水补足至10 l，小心混匀。37水浴保温1-2 h，然后各小管内加入1l的酶反应终止液，混匀，终止酶促反应，冰箱内保存备用。操作前各试剂用量要反复核对，保证准确无误，所加试剂用量很少，必须认

13、真操作。I. 单酶切： （1）在一灭菌的1.5 ml 离心管中依次加入： 质粒DNA 5 l ddH2O 3 l 10×buffer 1 l 限制性内切酶 1 l总体积 10 l （2）混匀，稍离心 （3）37水浴13 hr （4）70水浴10 min，中止酶切反应 （5）电泳检测酶切效果 II. 双酶切： （1）在一灭菌的1.5 ml 离心管中依次加入： 质粒DNA 5 l（约1g） ddH2O 3 l 10×buffer 1 l 限制性内切酶1 0.5 l 限制性内切酶2 0.5 l 总体积 10 l （2）混匀，稍离心 （3）37水浴13hr （4）70水浴10min

14、，中止酶切反应 （5）电泳检测酶切效果 注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1g/10;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4-5 hr，甚至过夜。灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。 三、 结果与分析 假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两

15、条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。 M1 1 2 3 4 5 6 M2 图2-1 重组质粒HindIII+XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析： M1: DNA/ HindIII, M2: DL2000, 1-6: 重组质粒HindIII+XbaI. 重组质粒用HindIII+XbaI双酶切后释放出插入片断，因此空载体处于同一水平位置，而插入片断长度分别为0.8, 2.1, 1.6, 1.2, 0.7和0.3 kb。 四、思考题 假设一种内切酶在重组质粒上有两个酶切位点，如果酶切后的电泳显

16、示有三条带，分析可能的原因。说明DNA限制性内切酶图谱的构建在核酸研究和遗传工程等方面的应用价值。实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳一、目的要求1. 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。2. 学习利用琼脂糖电泳方法测定DNA片段大小。3. 学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。二、原 理DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭染色，在波长254n m紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。琼脂糖凝胶电泳对DNA的分离作用主要依据DNA

17、的分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。一定大小的DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离DNA片段大小范围见表1。因而要有效分离大小不同的DNA片段，主要是选用适当的琼脂糖凝胶浓度。不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的DNA移动速度次序如下：共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA。在同一浓度的凝胶中，分子量较小的DNA片段比较大的片段快。DNA片段的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知

18、DNA片段的大小。表3-1 DNA大小范围与琼脂糖凝胶浓度的关系琼脂糖凝胶浓度/%可分辨的线性DNA大小范围/kb0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1本实验采用限制性内切酶Hind 或EcoR酶解DNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，以它们对应的迁移率为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘制出测定DNA分子量的标准曲线。共价闭环质粒pBR322 DNA只有一个EcoR酶切位点，酶解后成为一条线状DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，测量酶解后线型DNA的迁移距离，可以直接在分子量标准曲线上得出其分子大小。三、试

19、剂和器材一）、试剂1. 限制性内切酶Hind、EcoR试剂盒 2. 标准DNA：按使用说明配制3. 标准pBR322：按使用说明配制4. 酶反应终止液（10×0.1mol/L EDTA，20%Ficoll，0.25%溴酚蓝）：10 l/组称取3.72克EDTA·Na2·2H2O，20克Ficoll，0.25克溴酚蓝，溶解后定容至100 ml。5. 电极缓冲液（5×TBE）：用前稀释10倍称取10.88克Tris，5.52克硼酸，0.74克EDTA·Na2·2H2O，溶解后用蒸馏水定容至200ml。使用前用蒸馏水稀释10倍，称为TBE稀

20、释缓冲液（0.5×TBE）。6. 溴乙锭（EB）染色贮存液（1mg/ml）：1滴/组将100mg溴乙锭溶于蒸馏水或电极缓冲液100 ml，棕色瓶内封好，避光保存。EB是诱变剂，配制和使用时应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在地面或桌面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。 7. 1%琼脂糖二）、器材Eppendorf离心管（1.5ml，预先高温高压灭毒，3个/组）及其离心管架，电泳槽（1个/组），电泳仪（1个/2组），凝胶塑料托盘（1个/组），锥形瓶（100 ml×1，烘干），小烧杯（50，100，250 ml），微量注射器（2 l×

21、3，15 l或20 l×1），一次性塑料手套(64只)，胶头滴管（×3），紫外反射投射仪，防护眼镜，洗瓶2个（分别盛重蒸水和蒸馏水），大烧杯1个，胶头滴管2支，量筒（50 ml×1），卡尺（学生自备）四、操作方法一、1.0%琼脂糖凝胶板的制备1. 用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或水平工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进托盘长边上的凹槽内（距一端约1.5 cm），梳齿底边与托盘表面保持0.51 mm的间隙，安置好后保持静置状态。2. 称取0.3克琼脂糖置于小锥形瓶中，加入30 ml TBE稀释缓冲液，在电炉上（或微波炉中）加热融化，轻轻摇匀，避免产

22、生泡沫。图3-1 凝胶托盘的组装1. 托盘 2. 挡板 3. 梳子3. 待琼脂糖冷却至放在手背不觉太烫手（约60）后，滴一滴EB，然后将琼脂糖溶液在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内（注意中间不要间断），使凝胶缓慢而连续地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层（7.1×9.0cm）。胶内不要存有气泡，室温下静置约20分钟。4. 待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加入少量TBE稀释液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。5. 取下封边的挡板，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上，倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面2-3 mm，要防

23、止样品槽内窝存气泡，可以用微量注射器挑除。 二、加样用微量注射器或移液枪将经酶切的样品液和未经酶切的样品液（要加2 l的酶反应终止液）分别加入到胶板的不同加样槽内，每个槽（5×2×2.5 mm）容积约为25 l，因此加样量不要超过20 l，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。加样时，注射器针头穿过缓冲液小心靠近加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内，让其集中沉于槽底部。加完一个样品后的微量注射器应反复洗净后才能用以加下一个样品。三、电泳加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩

24、散，样品进胶后，应控制电压降不高于5V/cm。当染料带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳。四、观察小心地取出凝胶置托盘上，将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长254 nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光，可观察到清晰的条带。观察时应带上防护眼镜，避免紫外灯对眼睛的伤害。五、制作测定分子量标准曲线用卡尺量出DNA/Hind 酶解各片段的迁移距离（cm），以DNA酶解各片段分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上连结各点划出曲线，即为DNA分子量的标准曲线。DNA/Hind 酶解各片段大小见表3-2。表3-2 DNA/Hind 酶解片段片段碱

25、基对数目（kb）道尔顿（×106）1234567823.1309.4196.5574.3712.3222.0280.5640.12515.06.124.262.841.511.320.370.08注意事项:1. 溴乙锭（EB）是诱变剂，配制和使用时应带乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经过专门处理后，才能进行清洗或弃去。2. DNA酶解过程中，使用的器具都应干净，并经消毒。配制时急需用灭菌的双蒸水，还要防止限制性内切酶被污染。3. 加样量的多少取决于加样槽最大容积。可以采用大小不同的样品槽模板以形成容积不同的加样槽，加入样品的体积应略小于加样

26、槽容积，为此，对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。4. DNA/Hind酶解后应有8条带，但实际上只能看见6条，分子量小的2条带由于其荧光弱，往往看不见。思考题1. 名词解释：DNA；限制性内切酶；Marker2. 根据实验结果，解释琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段大小的根据，聚丙烯酰胺凝胶电泳能否测定DNA分子的大小，它们的区别是什么？实验四 PCR技术在农业中的应用（综合性）利用提取的几种不同农作物品种DNA样品，用310个RAPD或SSR引物进行分子标记分析，让学生学会从分子水平研究不同植物扩增DNA片段的遗传多样性。使学生熟悉和掌握PCR技术的原理和方法，并能够使用、掌握相关实验仪

27、器的操作和使用方法。让学生记录扩增样品数量，循环次数和扩增时间，并对扩增结果进行分析。（一） 植物DNA的提取与分离一、目的：学习并掌握CTAB法提取药用植物的总DNA的原理和操作步骤。二、原理和方法 关于植物总DNA的提取方法相关文献报道很多，但从提取原理上看主要有二种:CTAB法及SDS法。1、 CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法：CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的。采用氯仿异戊醇抽提蛋白质，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物溶液加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能

28、溶解于乙醇。CTAB法提取DNA最初用于冷冻干燥的材料。其程序及试剂比例经适当改动后也于新鲜植物组织及细胞器DNA的提取。用冷冻干燥材料提取时，使用1×CTAB。用新鲜材料提取时使用2×CTAB缓冲液。实验需要注意的问题是CTAB溶液在15以下会发生沉淀，所以含CTAB的溶液不能在低温下离心。与SDS法相比，CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用，该方法另一个特点是在提取的前期能同时得到高含量的DNA和RNA。2、SDS（十二烷基硫酸钠）法： 其原理是利用高浓度的SDS，在较高温度(5565)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出

29、核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的作法使蛋白质及多糖杂质沉淀(量常用的是加 5 mol/L的KAC于冰上保温，在低温条件下KAC与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法操作简单，温和，也可提取到分子量较高的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。三、材料、试剂和仪器1 试验材料：新鲜或超低温冷冻干燥植物组织0.2g2 试剂：2×CTAB提取缓冲液：2g/100ml CTAB, 100mmol/L Tirs·Cl(pH=8.0), 50mmol/L EDTA(pH=8.0)，700 mmol/L Na

30、Cl (pH=8.0)无水乙醇，70乙醇，氯仿，异戊醇3 仪器设备：恒温水浴锅，冰冻离心机，移液器及配套枪头，离心管，研钵四、步骤 1）取约0.2g黄化苗或新鲜叶在含有750 l预热提取缓冲液的研钵中磨碎后转至1.5ml的离心管中，65水浴1h,其间轻轻颠倒几次；2）用等体积氯仿-异戊醇（24：1）轻轻混匀并颠倒约510min，然后18下10000r/min离心10min；3）上清液用2倍体积的预冷(-20)无水乙醇沉淀， DNA用70%乙醇洗12次后,干燥,然后用无离子水溶解后保存在-20冰箱中备用。SDS提取缓冲液组成： CTAB提取缓冲液组成：100 mmol/L Tris-HCl pH

31、 8.0 100 mmol/L Tris-HCl pH 8.050 mmol/L EDTA-Na2 pH 8.0 50mmol/L EDTA-Na2 pH 8.0100 mmol/L NaCl 700 mmol/L NaCl2% SDS 1% CTAB五、结果记录观察DNA的颜色、形态变化。（二） DNA的定量分析一、目的 了解检验DNA定量分析的方法和原理，熟悉检验提取DNA的质量，包括浓度与纯度的具体步骤和操作过程。二、原理和方法1、浓度DNA样品的浓度一般可根据其在260nm的吸收值来确定。50gml的双链DNA对260nm紫外光的吸收值为1.0。 凡是浓度大于0.25 gml的纯净DN

32、A样品均可按此关系，由其OD260值求出其浓度。测定时因比色杯最小的容积为0.5 ml，微量制备的样品总体积不过20100l，因此应从所制备的样品中取出少量稀释后进行测定，根据稀释样品的吸收值及释释倍数计算出原样品的DNA浓度。测定方法：取10 l DNA样品溶液，加ddH2O至2 ml，混匀后注入5ml的石英比色杯中，以ddH2O为空白对照调零后进行测定。DNA样品浓度(g/l)=OD260×样品稀释倍数×50/10002、纯度纯净的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度计测定其260nm及280nm的吸收值比应为1.8。若OD260OD280大于1.8，表明样品中有较多的R

33、NA，这时应该用RNA酶重新处理样品，若比值小于1.6，则说明样品中蛋白质杂质较多，这时需要用氯仿重新抽提样品进一步去除去蛋白质杂质。三、材料、试剂和仪器1 实验材料：提取的植物总DNA 2 试剂：超纯水（dd H2O）仪器设备：紫外分光光度计，石英比色杯，烧杯，洗瓶四、步骤（1） 预热分光光度计1020 min。（2） 取两只1.0 ml的狭缝石英比色杯，一只装入1.0ml ddH2O作为空白溶液，校正分光光度计零点和透光度至100。（3） 测定DNA的浓度与纯度： 1） 取5l DNA待测样品，加ddH2O稀释混匀至1000 l。 2） 将两只比色杯放置在分光光度计中，调整入射光波长分别为

34、260nm、280nm和230nm的OD值。（每次用ddH2O液调整零点：T100、OD0）。（4）DNA浓度与纯度的计算：DNA样品的浓度：一般可根据其在260nm的吸收值来确定，50gml的双链DNA对260nm紫外光的吸收值为1.0。凡是浓度大于0.25 g/ml的纯净DNA样品均可按此关系，由其OD260值求出其浓度。测定时因比色杯最小的容积为0.5ml，微量制备的样品总体积不过20100l，因此应从所制备的样品中取出少量稀释后进行测定，根据稀释样品的吸收值及释释倍数计算出原样品的DNA浓度。DNA样品浓度(g/l)=OD260×N（样品稀释倍数）×50/1000D

35、NA样品的纯度：纯净的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度计测定其260nm及280nm的吸收值比应为1.8，OD260/OD230因大于2.0。若OD260OD280值大于1.8，表明样品中有较多的RNA，这时应该用RNA酶重新处理样品，若OD260OD280比值小于1.6，则说明样品中蛋白质或酚杂质较多，这时需要用氯仿重新抽提样品进一步去除去蛋白质杂质；OD260/OD230小于2.0时，表明存在盐和小分子杂质的污染。五、结果 计算DNA浓度和纯度。（三） RAPD或SSR标记技术一、目的学习掌握应用RAPD或SSR技术对植物进行DNA水平的遗传多样性检测。二、原理和方法RAPD标记技术:利

36、用10碱基RAPD引物进行PCR扩增反应。SSR标记技术: 利用20碱基SSR特异引物进行PCR扩增反应。三、材料、试剂和仪器(一) RAPD标记技术1. 实验试剂与RAPD反应混合物体系：ddH2O 10.8 lDNA 2 l (80 ng)10×buffer 2.0 l引物 2 l (40 ng)2.5 mM dNTP 1.5 l 25mM MgCl2 1.5 lTaq酶 0.2 l (1 U) 总体积 20 l2. 实验仪器： PCR仪， 移液器，漩涡振荡器，0.2 ml离心管3. 反应程序： （1） 94 3min ;（2） 94 1min， 37 1min ，72 2min, 35个循环；（3） 72 5min；（4） 4保存（二）SSR标记技术1. 实验试剂与RAPD反应混合物体系：ddH2O 9.0 lDNA 1.6 l (80 ng)10×buffer 2 l 2.5 mM dNTP 1.6 l 上游引物 2 l (40ng)下游引物 2 l (40ng)25mM MgCl2 1.6 lTaq 酶 0.2 l (1 U)总体积 20 l2. 实验仪器：PCR仪，移液器，漩涡振荡器，0.2ml离心管3