原位杂交具体步骤

1、原位杂交流程以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针对石蜡切片进行mRNA检测的流程图。这些实验操作方法很多参考书中均有但没有一本书是专为这个目的而系统地加以总结的因此特加以综合供同行参考在具体操作过程中很多地方可酌情变更。在临床应用中常常可以买到已经标记好的商品探针那么前面一大部分扩增基因、酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去从石蜡切片处理做起即可。下面介绍的方法笔者已亲手做过数次可获满意结果。主要操作步骤制备感受态细菌用含目的基因的质粒转化细菌小量培养转化的细菌小量提取质粒小量酶切质粒电泳鉴定大量培养转化的细菌大量提取质粒大量酶切质粒电泳分离、回收及纯化标记探针石蜡切片的处理预杂交

2、、杂交杂交后处理抗体连接、显色制备感受态细菌【试剂及配制】1 LB液体培养基在900ml三蒸水中加入胰蛋白月东(bacto-tryptone)10g酵母提取物(bacto-extract)5gNaCl10g磁力搅拌使完全溶解用5molNaOH调节pH至7.0如用进口试剂则不必调。定容为1000ml高压灭菌20min。2 0.1molCaCl2溶液1.1g无水氯化钙溶于90ml三蒸水中定容至100ml用0.22科m滤器过滤除菌置于灭菌试剂瓶中4c保存。【材料】大肠杆菌单菌落或冻存菌种也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。【操作方法】1 从37c培养1216h的平板中用无菌的接种环用前酒精灯

3、烧红晾凉挑一单菌落转入含有5mlLB培养基的无菌试管37c振摇200r/min过夜。次日取菌液1ml加入含100mlLB培养基的500ml锥形烧瓶37c振摇培养200300r/min约23h将烧瓶取出立即置冰浴1015min2 以下均为无菌操作。在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心管中3 4c离心5000gx10min回收细菌4 弃去培养液将管倒置于滤纸上1min流尽培养液5 用冰预冷的0.1molCaCl210ml重悬菌体置冰浴30min6 4c离心5000gx10min弃上清倒置于滤纸上1min7 加4ml用冰预冷的0.1molCaCl2重悬菌体动作要轻8 置4c冰箱12

4、24h即可用于转化。感受态细菌的冻存一次制备的感受态不能用完可冻存起来备用。将甘油装1.5mlEP管中沸水浴10min以杀菌。将感受态细菌分装成400flm一份每份加30%体积的甘油充分混匀置-70C冰箱一年内可使用。用含目的基因的质粒转化细菌【试剂及配制】1 LB液体培养基2 氨芳青霉素Amp选择性培养基LB培养基中加入1.5%的琼脂15g/L高压灭菌20min取出在无菌条件下冷却至50c左右时烧手但尚可忍受加入抗生素或其他必需成分如为氨芳青霉素Amp选择性培养基则以50mg/ml的氨芳青霉素贮存液按50科g/ml的量加入即每ml培养基加入1科l氨基节。3 氨节贮存液将氨芳青霉素钠溶于三蒸水

5、配成50mg/ml溶液以0.22科m滤纸过滤1ml一份分装存于-20C。【操作方法】1 无菌状态下取新鲜感受态200科l置于无菌的10ml玻璃试管中。如果使用冻存的感受态细菌时将其从-70C冰箱取出握于手中待其解冻后立即吸取200dl转移至10ml无菌玻璃试管中剩余的感受态弃去不能再冻存复用2 每管加质粒50100ng轻轻旋转以混合内容物在冰上放置30min3 42C水浴热休克90s不要摇动试管4 每管加无抗生素的LB培养基1ml37c摇床温和摇振100150r/min45min5 用无菌的弯头玻璃铺菌器用前酒精灯烧再晾凉将200dl菌液铺于含氨下可霉素的琼脂平板表面37c放置20min然后倒

6、置培养1420h37C小量培养转化的细菌【操作方法】1 取灭菌处理的10ml玻璃试管用无菌吸管加入约5mlLB液体培养基再加入50mg/ml氨芳青霉素5科l2 用接种环或无菌牙签挑取单菌落送入培养液中晃动使细菌进入培养液封好管口3 37c摇床100200r/min约612h可过夜使生长饱和。质粒的少量提取【试剂及配制】1 溶液I葡萄糖C6H12O6-H2O1.982g三蒸水160ml0.5molEDTApH8.04ml1molTris-ClpH8.05ml以三蒸水定容至200ml高压灭菌4c保存0.5molEDTApH8.0的配制Na2EDTA-H2O186.1g如无水贝U为175g三蒸水70

7、0ml边磁力搅拌边加入固体NaOH缓慢少量加入待充分溶解pH接近8.0用酸度计调节pH8.0HCl/NaOH1molTris-ClpH8.0的配制Tris碱121g三蒸水800ml充分搅拌用浓盐酸将pH调节至8.0酸度计测量2溶液n配制50ml的量现用现配。10molNaOH1ml三蒸水40ml10%SDS5ml用三蒸水定容至50ml10molNaOH的配制40gNaOH晶体加三蒸水至100ml10%SDS的配制68c助溶加数滴1molHCl调pH7.2戴口罩称10gSDS溶于80ml三蒸水中定容至100ml1molHCl的配制于通风橱中三蒸水91.4ml浓盐酸8.6ml混匀3 溶液出5mol

8、乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml三蒸水28.5ml高压灭菌4c保存5mol乙酸钾配制200ml乙酸钾98.14g三蒸水160ml搅拌溶解定容至200ml;4 3ml乙酸钠NaAcpH5.2配制500ml乙酸钠CH3COONa-H2O201.1g三蒸水200ml用冰乙酸调节pH为5.2三蒸水定容至500ml高压灭菌4c保存。5 平衡酚在粗酚中加入0.1%8-疏基唾咻然后倒入0.1molTris-ClpH8.0避光磁力搅拌4h静置后移去水相再加0.1molTris-ClpH8.0搅拌、去除水相反复进行直到水相pH7.8时为止装棕色瓶4c保存。6 TE缓冲液pH8.0配制最终使10mmolTris-

9、ClpH8.01mmolEDTApH8.07 其它试剂氯仿乙戊醇V/V=241、无水乙醇、70%乙醇【操作方法】1 取1ml菌液置于1.5ml的EP管中10000gx30s离心2 控尽上清液3 加溶液I100“重悬菌体4 加溶液n200“倒转均匀5 加溶液出150“混匀6 10000gX5min离心7 转移上清至另一EP管8 加等体积平衡酚混匀室温离心8000gx5min9 小心吸取上清转移至另一EP管中勿将酚层吸出10 重复8、9的步骤11 等体积氯仿乙戊醇混匀12 离心8000gx5min13 转移上清至另一EP管14 加1/10体积3molNaAcpH5.2和2.5倍体积的无水乙醇混匀1

10、5 置液氮10min或-20C冰箱1h16 离心10000gx10min17 弃上清留沉淀70%乙醇洗一次18 离心10000gxI0min19 弃上清留沉淀晾干20力口TEpH8.050dl溶解沉淀21力口RNaseA(10mg/ml)35“混匀稍离心2237C水浴30min23-20C保存待用。小量酶切质粒鉴定常用20“反应体系。【操作方法】1 在灭菌的新EP管中加入7屋三蒸水2 加入10X缓冲液2膜3 力口限制酶5“4 最后加入质粒DNA10l5 稍离心混匀6 37c水浴11.5h7 无水乙醇沉淀2.5倍体积无水乙醇混匀液氮10min或-20C30min离心8 弃上清晾干加10川TE建立

11、第二个酶切体系37C11.5h电泳鉴定【试剂及配制】1 0.5XTBE先配5XTBE贮存液然后用三蒸水稀释10倍5XTBE配制1000mlTris碱54g硼酸27.5g0.5molEDTApH8.02ml2 EB10mg/ml3 琼脂糖4 上样缓冲液0.25%澳酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油【操作方法】1 用胶带纸封住洗净、晾干的电泳胶盒两端放好梳齿水平放置于工作台上2 0.5XTBE+琼脂糖1%电炉上融化勿暴沸待其冷却至5060C入EB约5“充分混匀3 将凝胶倒入胶模厚约35mm避免产生气泡4 在室温中放置3045min撕去胶带纸放入电泳槽电泳槽内为0.5XTBE应没过凝胶去除梳齿预电

12、泳10min5 将DNA样品与上样缓冲液混合加进上样孔内应设一marker作对照6 60100V恒压电泳使DNA向阳极移动黑线为负极红线为正极7 电泳完成后戴塑料手套取出胶盒将凝胶放紫外灯下观察有无切出的电泳带。大量培养转化的细菌小量酶切鉴定证实细菌内含有目的基因即可大量培养。【操作方法】在500ml灭菌处理过的培养瓶中加LB培养基200ml加入50mg/ml的氨芳贮存液200科l将小量培养的菌液取2ml加入瓶中37C200300r/min振摇培养610h可过夜。大量提取质粒常用碱裂解法。【试剂及配制】1 .溶液I2 .溶液n3 .溶液出4 .异丙醇5 .3molNaAcpH5.26 .平衡酚

13、pH8.07 .氯仿乙戊醇2418 .无水乙醇9 .70%乙醇10 .TEpH8.011 .RNaseA(10mg/ml)12 .溶菌酶取100mg溶菌酶用2ml三蒸水溶解分装成200“/管贮存于-20C备用【操作方法】1 扩增好的菌液装入50ml离心管中置冰浴10min2 4c离心5000X10min3 将沉底的细菌收集到一只50ml离心管中再离心弃上清将离心管倒置滤上1min控干残液4 加入6ml冰预冷的溶液I200“溶菌酶充分振摇混匀5 加溶液n10ml缓慢振摇以充分混匀内容物室温放置10min6 加入8ml冰预冷的溶液出小心摇动离心管以混匀内容物置冰酒精浴10min7 4c离心1000

14、0gx10min8 小心倒出上清弃沉淀如有沉淀再次离心9 加入0.6体积异丙醇充分混匀-20C放置20min10 4c离心10000gx10min11 弃上清晾干2mlTEpH8.0溶解沉淀12 加入2ml冰预冷的5molLiCl溶液并混匀13 4c离心10000gx10min14 将上清转移至另一离心管加入0.6体积异丙醇充分混匀-20C放置20min15 4c离心10000gx10min16 弃上清70%乙醇洗一次4c离心10000gx10min弃上清晾干17 将沉淀溶于1.2mlTEpH8.0中18 力口RNaseA30“封管口37C水浴30min19 将样品分装2个EP管各加等体积平衡

15、酚混合20 室温离心5000gx5min21 将上层水相转移至另一EP管小心勿吸出酚相22 重复平衡酚抽提23 等体积氯仿异戊醇241抽提24 室温离心5000gx5min25回收上层水相勿吸出氯仿26力口1/10体积3molNaAC(pH5.2)再加2.5体积无水乙醇充分混匀置-20C30min或液氮10min27室温离心12000gx15min28弃上清70%乙醇洗一次再离心29晾干溶于500“TEpH8.0-20C保存30取2“稀释至200dl用紫外分光光度计测260nm、280nmOD值OD260/OD280=1.72.0如小于1.7蛋白未提净大于2.0有机溶剂多。DNA含量为OD26

16、0X50gg/ml大量酶切质粒【操作方法】1 在新的灭菌EP管中依次加入三蒸水70wl10X缓冲液10“限制酶5“质粒DNA2dg/“15”稍离心以混匀2 37C水浴1.52h3 取5“电泳鉴定酶解效果如不完全可延长时间或加限制酶4 双酶解反应如两种酶可用同一缓冲液则可同时加入一个体系稍增加反应体积否则以乙醇沉淀晾干重建第二个反应体系。电泳分离、回收及纯化DNA片段电泳的方法如前述不同点在于使用低熔点琼脂糖在4C冰箱中电泳D将23个梳齿用透明胶布粘在一起以增加上样量。从低熔点琼脂糖中回收及纯化DNA【操作方法】1 在紫外灯下将含有所需DNA片段的凝胶条切下放入EP管中加入2倍体积的TE缓冲液在

17、70C保温10min使凝胶条融化2冷却至室温加等体积平衡酚充分混匀后以6000g离心10min回收水相注意不要将界面处的白色物质即粉状的琼脂糖吸出再用等体积的氯仿/乙戊醇抽提次3将上清液转移到一个新的离心管中加入0.2体积的10mol的乙酸胺和2倍体积的无水乙醇置-20C冰箱20min离心沉淀核酸晾干后以TE溶解。取2“稀释至200dl测DNA浓度。标记探针使用BoehringerMannheim地高辛标记探针试剂盒。【操作方法】1 1“模板DNA加灭菌三蒸水至最终体积为16科l2 10min沸水浴立即冰乙醇冷轧3 加入4科l探针标记液试剂盒中vial1稍微离心混匀4 37C水浴20h5 加入

18、2科l0.2molEDTApH8.0或加热65c10min以终止反应。石蜡切片的处理【试剂及配制】1二甲苯2乙醇100%95%90%75%3 甲醇4 0.2molHCl5 0.1%TritonX-1006 0.2%甘氨酸PBS7 5mmolMgCl2-PBS8 PBS配制配成10X的贮存液用时稀释10倍NaCl80g137mmolKCl2g2.7mmolNa2HPO47H2O11.5g4.3mmolKH2PO42g1.4mmol配成1000mlpH7.3高压灭菌。9 蛋白酶K0.1molTris-ClpH8.0力口50mmolEDTApH8.0配制浓度为1科g/ml。10 4%多聚甲醛在通风橱

19、中配制称40g多聚甲醛溶于装有500mlDEPC水的烧瓶中加热65c并磁力搅拌使成乳白色悬液用1molNaOH调节pH7.0呈清亮状再加入约450ml的2XPBS充分混匀再检查pH过滤后定容至1000ml4C保存。【操作方法】1将烤好的切片入二甲苯I30min二甲苯n、m各10min2逐级酒精入水100%、95%、90%、75%各5min甲醇冲洗5minX23用三蒸水或PBS快速洗2次40.2molHCl室温作用10min0.1%TritonX-100作用15min50.2%甘氨酸-PBS室温卯?育15min6蛋白酶K37C消化1530min70.2%甘氨酸-PBS室温卯?育15min8PBS

20、-5mmolMgCl2洗2次各10min94%多聚甲醛室温下固定15min10PBS-5mmolMgCl2洗2次各10min11逐级酒精脱水37C烤干保存。预杂交、杂交【试剂及配制】12XSSC先配制20XSSCT存液用时稀释。NaCl175g3mol枸椽酸三钠2H2O88g0.3mol三蒸水加至1000ml用1molHCl调pH7.024XSSC50%去离子甲酰胺V/V去离子甲酰胺的配制500ml甲酰胺与25gBio-RadAG501-X8（2050目）混合室温避光搅拌4h过滤分装为50ml-20C存放3 100xDenhardt液聚蔗糖10g聚乙烯口比咯烷酮10g牛血清白蛋白10g消毒三蒸

21、水定容至100ml4 预杂交液去离子甲酰胺5ml20XSSC2.5ml加温至50C加入硫酸葡聚糖1g聚合物溶解后加入100xDenhardt500l10%SDS500科l10mg/ml变性鲜鱼精子DNA100“消毒三蒸水400“充分混合5 杂交液将标记好的探针用沸水浴10min立即冰酒精冷轧用预杂交液将探针稀释至0.55ng/l。【操作方法】1 用2XSSC简洗15min2 4XSSC50%去离子甲酰胺37C孵育15min3 每片加预杂交液50“放入湿盒42C孵育2h4 去除预杂交液每片加杂交液50“放湿盒中42C杂交1218h不能超过24h。杂交后处理【试剂及配制】1 2XSSC2 2XSSC50%去离子甲酰胺3 1XSSC50%去离子甲酰胺4 PBS5 4XSSC/10mmolDTT先配制1molDTT通风橱中称3.1gDTT溶于20ml消毒三蒸水中用时取2ml加入1