龟甲胶、鹿角胶添加牛皮源、驴皮源成分检测方法解读(给学员)

1、胶类药材检测新方法培训胶类药材检测新方法培训程显隆程显隆联系电话：联系电话：010-67095432010-67095432QQ:33965568QQ:33965568微信：微信：wxid_lncxlwxid_lncxlE-mailE-mail：; 培训内容培训内容 标准解读标准解读 样品制备样品制备 质谱条件优化质谱条件优化 结果判断示例结果判断示例一、标准解析一、标准解析胶类补充检验方法批准件胶类补充检验方法批准件一、标准解析一、标准解析胶类药材鉴别项（中国药典胶类药材鉴别项（中国药典2015版公示品种）版公示品种） 龟甲胶 鹿角胶 阿胶鉴别项与补充检验方法的目的鉴别项与补充检验方法的目的

2、鉴别项鉴别项 阿阿 胶胶阿胶特征离子阿胶特征离子 鹿角胶鹿角胶鹿角胶特征离子鹿角胶特征离子 龟甲胶龟甲胶龟甲胶特征离子龟甲胶特征离子补充检验方法补充检验方法 阿阿 胶胶牛皮特征离子牛皮特征离子 鹿角胶鹿角胶驴皮特征离子驴皮特征离子 牛皮特征离子牛皮特征离子 龟甲胶龟甲胶驴皮特征离子驴皮特征离子 牛皮特征离子牛皮特征离子【检查】【检查】 牛皮源成分牛皮源成分 照高效液相色谱-质谱法（中国药典2010年版一部附录 D和二部附录 J）测定。 色谱、质谱条件与系统适用性试验色谱、质谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动

3、相B，梯度洗脱：025分钟，A 95%80%，B 5%20%；2540分钟，A 80%50%，B 20%50%。流速为0.3ml/min。以质谱作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 641.3（双电荷）726.2和m/z 641.3（双电荷）783.3为检测离子对。取牛皮源成分参比溶液，进样5l，m/z 641.3（双电荷）726.2和m/z 641.3（双电荷）783.3的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1。 牛皮源成分参比溶液的制备牛皮源成分参比溶液的制备 取黄明胶对照药材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1% 碳酸氢铵 溶液40ml，超声处理30分钟，加1

4、%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液5ml置100ml量瓶中，加鹿角胶基质溶液（取鹿角胶对照药材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40ml，超声处理30分钟，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得）稀释至刻度，摇匀，用0.22m微孔滤膜滤过，取续滤液100l，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液(取序列分析级胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前现配) 10l, 摇匀，37恒温酶解12小时，即得。 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 取本品粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40ml，超声处理30分钟，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，自“

5、用0.22m微孔滤膜滤过”起，照牛皮源成分参比溶液的制备方法同法操作，即得。 测定法测定法 分别吸取牛皮源成分参比溶液与供试品溶液各5l，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。 结果判断结果判断 以m/z 641.3（双电荷）726.2和m/z 641.3（双电荷）783.3提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与牛皮源成分参比溶液色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中m/z 641.3（双电荷）726.2的色谱峰面积值应不得大于参比溶液中相应的峰面积值。 驴皮源成分驴皮源成分 照高效液相色谱-质谱法（中国药典2010年版一部附录 D和二部附录 J）测定。 色谱、质谱条件与

6、系统适用性试验色谱、质谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：025分钟，A 95%80%，B 5%20%；2540分钟，A 80%50%，B 20%50%。流速为0.3ml/min。以质谱作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 539.8（双电荷）612.4和m/z 539.8（双电荷）923.8作为检测离子对。取驴皮源成分参比溶液，进样5l，m/z 539.8（双电荷）612.4和m/z 539.8（双电荷）923.8的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1。 驴皮源

7、成分参比溶液的制备驴皮源成分参比溶液的制备 取阿胶对照药材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40ml，超声处理30分钟，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液5ml置100ml量瓶中，加鹿角胶基质溶液（取鹿角胶对照药材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40ml，超声处理30分钟，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得）稀释至刻度，摇匀，用0.22m微孔滤膜滤过，取续滤液100l，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液（取序列分析级胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前现配）10l, 摇匀，37恒温酶解12小时，即得。 供试品溶液的制备供试

8、品溶液的制备 取本品粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1% 碳酸氢铵溶液40ml，超声处理30分钟，加1% 碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，自“用0.22m微孔滤膜滤过”起，照驴皮源成分参比溶液的制备方法同法操作，即得。 测定方法测定方法 分别吸取驴皮源成分参比溶液与供试品溶液各5l，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。 结果判断结果判断 以m/z 539.8（双电荷）612.4和m/z 539.8（双电荷）923.8提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与驴皮源成分参比溶液色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中m/z 539.8（双电荷）612.4的色谱峰面积值不得大于参

9、比溶液中相应的峰面积值。8色谱条件色谱条件 驴皮源成分驴皮源成分 照高效液相色谱-质谱法（中国药典2010年版一部附录 D和二部附录 J）测定。 色谱、质谱条件与系统适用性试验色谱、质谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：025分钟，A 95%80%，B 5%20%；2540分钟，A 80%50%，B 20%50%。流速为0.3ml/min。以质谱作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 539.8（双电荷）612.4和m/z 539.8（双电荷）923.8作为检测离

10、子对。取驴皮源成分参比溶液，进样5l，m/z 539.8（双电荷）612.4和m/z 539.8（双电荷）923.8的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1。 驴皮源成分参比溶液的制备驴皮源成分参比溶液的制备 取阿胶对照药材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40ml，超声处理30分钟，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液5ml置100ml量瓶中，加鹿角胶基质溶液（取鹿角胶对照药材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40ml，超声处理30分钟，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得）稀释至刻度，摇匀，用0.22m微孔滤膜滤过，取续滤液100l，置微量进样瓶中，加

11、胰蛋白酶溶液（取序列分析级胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前现配）10l, 摇匀，37恒温酶解12小时，即得。 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 取本品粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1% 碳酸氢铵溶液40ml，超声处理30分钟，加1% 碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，自“用0.22m微孔滤膜滤过”起，照驴皮源成分参比溶液的制备方法同法操作，即得。 测定方法测定方法 分别吸取驴皮源成分参比溶液与供试品溶液各5l，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。 结果判断结果判断 以m/z 539.8（双电荷）612.4和m/z 539.8（双电荷）923.8提取的供试品

12、离子流色谱中，应不得同时出现与驴皮源成分参比溶液色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中m/z 539.8（双电荷）612.4的色谱峰面积值不得大于参比溶液中相应的峰面积值。保证检测的最低要求保证检测的最低要求 驴皮源成分驴皮源成分 照高效液相色谱-质谱法（中国药典2010年版一部附录 D和二部附录 J）测定。 色谱、质谱条件与系统适用性试验色谱、质谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：025分钟，A 95%80%，B 5%20%；2540分钟，A 80%50%，B 20%50%。流

13、速为0.3ml/min。以质谱作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 539.8（双电荷）612.4和m/z 539.8（双电荷）923.8作为检测离子对。取驴皮源成分参比溶液，进样5l，m/z 539.8（双电荷）612.4和m/z 539.8（双电荷）923.8的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1。 驴皮源成分参比溶液的制备驴皮源成分参比溶液的制备 取阿胶对照药材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40ml，超声处理30分钟，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液5ml置100ml量瓶中，加鹿角胶基质溶液（取鹿角胶对照药材粉末0.1g，置50

14、ml量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40ml，超声处理30分钟，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得）稀释至刻度，摇匀，用0.22m微孔滤膜滤过，取续滤液100l，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液（取序列分析级胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前现配）10l, 摇匀，37恒温酶解12小时，即得。 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 取本品粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1% 碳酸氢铵溶液40ml，超声处理30分钟，加1% 碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，自“用0.22m微孔滤膜滤过”起，照驴皮源成分参比溶液的制备方法同法操作，即得。 测定方法测定方法 分别吸取驴皮源成分参

15、比溶液与供试品溶液各5l，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。 结果判断结果判断 以m/z 539.8（双电荷）612.4和m/z 539.8（双电荷）923.8提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与驴皮源成分参比溶液色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中m/z 539.8（双电荷）612.4的色谱峰面积值不得大于参比溶液中相应的峰面积值。参比溶液参比溶液: :正品胶类中掺加了正品胶类中掺加了5%5%的驴皮的驴皮二、溶液制备二、溶液制备2ml2ml离心管离心管微量进样器枪头微量进样器枪头200200 l l微量进样器微量进样器0.220.22 m m微孔滤膜微孔滤膜25

16、0250 l l进样内衬管进样内衬管2m2ml l进样瓶进样瓶注射器注射器二、溶液制备二、溶液制备0.1 g g 对照品或样品对照品或样品加入 50 mL of 1% NH4HCO3, 超声处理过滤，取滤液100 L至200L 进样内衬管取溶液取溶液5ml5ml置置100ml100ml量瓶中量瓶中加鹿角胶基质溶液加鹿角胶基质溶液胰蛋白酶溶液10l37恒温酶解12小时进样胰蛋白酶胰蛋白酶 在碱性条件下使用在碱性条件下使用 序列分析用序列分析用Promega V5113Promega V5113，V5280V5280SigmaSigma，货号为：，货号为：T1426-50MGT1426-50MG中

17、检院，批号：中检院，批号：140615-200206140615-200206（使用时需加倍）（使用时需加倍） 实验材料 胰蛋白酶三、质谱条件优化三、质谱条件优化取对照药材母液进行酶解取对照药材母液进行酶解针对特征离子进行子离子全扫描针对特征离子进行子离子全扫描优化质谱参数优化质谱参数质谱条件优化质谱条件优化 取黄明胶对照药材粉末取黄明胶对照药材粉末0.1g0.1g，置，置50ml50ml量瓶中，加量瓶中，加1% 1% 碳碳酸氢铵酸氢铵 溶液溶液40ml40ml，超声处理，超声处理3030分钟，加分钟，加1%1%碳酸氢铵溶液碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液5ml5m

18、l置置100ml100ml量瓶中，加鹿角量瓶中，加鹿角胶基质溶液（取鹿角胶对照药材粉末胶基质溶液（取鹿角胶对照药材粉末0.1g0.1g，置，置50ml50ml量瓶量瓶中，加中，加1%1%碳酸氢铵溶液碳酸氢铵溶液40ml40ml，超声处理，超声处理3030分钟，加分钟，加1%1%碳碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得）稀释至刻度，摇酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得）稀释至刻度，摇匀，用匀，用0.220.22m m微孔滤膜滤过，取续滤液微孔滤膜滤过，取续滤液100l100l，置微，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液( (取序列分析级胰蛋白酶取序列分析级胰蛋白酶，加，加1%1%碳

19、酸氢铵溶液制成每碳酸氢铵溶液制成每1ml1ml中含中含1mg1mg的溶液，临用前的溶液，临用前现配现配) 10l, ) 10l, 摇匀，摇匀，3737恒温酶解恒温酶解1212小时，即得。小时，即得。质谱条件优化质谱条件优化 取黄明胶对照药材粉末取黄明胶对照药材粉末0.1g0.1g，置，置50ml50ml量瓶中，加量瓶中，加1% 1% 碳碳酸氢铵酸氢铵 溶液溶液40ml40ml，超声处理，超声处理3030分钟，加分钟，加1%1%碳酸氢铵溶液碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，稀释至刻度，摇匀，取溶液取溶液5ml5ml置置100ml100ml量瓶中，加鹿角量瓶中，加鹿角胶基质溶液（取鹿角胶对照药材粉末胶基质溶液（取鹿角胶对照药材粉末0.1g0.1g，置，置50ml50ml量瓶量瓶中，加中，加1%1%碳酸氢铵溶液碳酸氢铵溶液40ml40ml，超声处理，超声处理3030分钟，加分钟，加1%1%碳碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得）稀释至刻度，摇酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得）稀释至刻度，摇匀，匀，用用0.220.22m m微孔滤膜滤过，取续滤液微孔滤膜滤过，取续滤液100l100l，置微，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液( (取序列分析级胰蛋白酶取序列分析级胰蛋白酶，加，加1%1%碳酸氢铵溶液制成每碳酸氢铵溶液制成每1ml1ml中含中含1mg1mg的溶