人类Kras基因突变检测试剂盒说明书

1、人类Kras基因突变检测试剂盒说明书人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书【产品名称】通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲 线法）英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human Kras Gene （PCR-Melting Curve Analysis）【包装规格】20测试/盒【预期用途】K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一， 编码一种21kD的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包 括PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途 径是当前肿瘤靶向药物研究的热

2、点，靶向药物经过抑制这些途径 发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致 kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。据中国肿瘤学临床实践指南，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气 管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一 线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者 则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的 基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K

3、-ras基因第12，13 密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。 为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用 于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。表1 本品可检测的K-es基因突变K-ras基因12密码子突变K-ras基因13密码子突变Glyl2SerGGT>AGTGlyl3SerGGOAGCGlyl2ArgGGT>CGTGfyBAigGGOCGCGLyl2CysGGT>TGTGlyl3CysGGOTGCGlyl2AspGGT>GATGlyl3AspGGC>GACGlyl2AlaGGT > GCTGlylSAlaGGOGC

4、CGLyl2ValGGT>GTTGtyl 3ValGGOGTC【检验原理】本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和 熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是 否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可扩增12种突 变型和野生型的K-ras目标序列，利用标记了 FAM荧光基团和淬 灭基团的双标记探针一方面抑制野生型基因的扩增，提高突变基 因的检测灵敏度，另一方面在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产 物的分析，荧光探针在未杂交时因荧光基团和淬灭基团相互接近 而被淬灭，不发荧光，杂交状态时，二者相互离开而产生荧光。 该荧光探针分别与突变基因和野生型基

5、因的杂交产物在熔解曲线 分析时，表现为熔解曲线导数图中出现不同位置的峰，熔解峰对 应的位置即为熔解温度（加值），因野生峰的位置较突变峰位置 大3c以上而得到区分，但各种突变峰因Tm值相差较小而不能辨 别。本品可稳定地检出野生型10ng/ul基因组背景下1%含量的体 细胞突变，其熔解曲线会出现双峰，其中突变峰较野生峰Tm值明 显降低（图1）。图1系列阳性样本的检测结果注：左峰为突变峰，右峰为野生峰【主要组成成份】本试剂盒包含PCR反应液I、PCR反应液n和野生型对照品等 3管试剂。PCR反应液I包含相应的K-ras基因突变检测引物和探 针，探针由FAM荧光指示；PCR反应液n含有dNTP、Taq酶和 MgCl2 等。表2试剂盒组成试剂组分体积主要成分PCK反应液I350pl却M的引物和探针pcr反应液nO.lUplTaq 醒和 30nMdNTP.野生型对照品100pl750nMM/一等20il1 Ong/ul野生型基因组DNA检测必须但试剂盒中不包含的组分：1.5ml离心管（用于配制PCR反应液和DNA提取）；0.2ml PCR管或8联PCR管或96孔PCR板；带滤塞的吸头（1ml、200 口1 和 10口1）；DNA 提 取 试 剂 盒 Relia