流式细胞凋亡分析PPT学习教案

1、会计学1流式细胞凋亡流式细胞凋亡(dio wn)分析分析第一页，共105页。概概 念念 细胞凋亡是维持人体正常细胞凋亡是维持人体正常(zhngchng)(zhngchng)生生理过程和功能活动所必需的，是多细胞生物生命理过程和功能活动所必需的，是多细胞生物生命活动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存活活动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。的需要，贯穿了生物全部生命周期中。第1页/共105页第二页，共105页。概概 念念 细胞凋亡与细胞坏死（细胞凋亡与细胞坏死（necrosisnecrosis）是细胞）是细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区别。后者死亡的两种

2、模式，但两者有明显的区别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞毒药是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞毒药物作用后发生物作用后发生(fshng)(fshng)的被动分解过程，的被动分解过程，并可导致周围组织的炎症反应。并可导致周围组织的炎症反应。第2页/共105页第三页，共105页。概概 念念细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：清除无功能的细胞；清除无功能的细胞；控制控制(kngzh)(kngzh)细胞数量；细胞数量；清除病态的或有害的细胞；清除病态的或有害的细胞；清除多余的细胞；清除多余的细胞；第3页/共105页第四页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio

3、 wn)的特征的特征形态学特征：形态学特征： 光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征是光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜保持胞膜保持(boch)(boch)完整，其中胞核变化尤为完整，其中胞核变化尤为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细胞核双突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链链DNADNA发生裂解所致。发生裂解所致。第4页/共105页第五页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征形态学特征：形态学特征： DNA DNA降解后，形成长度主要为降解后，形成长度主要为180-200bp180-200b

4、p的的DNADNA片断，随后细胞裂解成许多有膜包被的片断，随后细胞裂解成许多有膜包被的小体，称为凋亡小体（小体，称为凋亡小体（apoptotic bodies),apoptotic bodies),最后被巨噬细胞吞噬，但不会引起周围组织最后被巨噬细胞吞噬，但不会引起周围组织(zzh)(zzh)的炎症反应。凋亡小体是凋亡细胞的炎症反应。凋亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到凋亡小特征性的标志。如在显微镜下观察到凋亡小体，则可确认为细胞发生了凋亡。体，则可确认为细胞发生了凋亡。第5页/共105页第六页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的特征的特征形态学特征：形态学特征： 电

5、镜下，细胞核内可见高电子密度区电镜下，细胞核内可见高电子密度区，这是核，这是核DNADNA在核小体连接处断裂成核小体在核小体连接处断裂成核小体后，在异染色质区聚集形成的染色质浓缩后，在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。染色质聚集区以外的低电子密度区为块。染色质聚集区以外的低电子密度区为透明区，是由于核孔变大导致其通透性增透明区，是由于核孔变大导致其通透性增加，细胞质中水分不断渗入而造成。线粒加，细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋体增殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得致密变得致密(zhm)

6、(zhm)、紊乱。、紊乱。第6页/共105页第七页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征形态学特征形态学特征(tzhng)(tzhng)： 第7页/共105页第八页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征形态学特征形态学特征(tzhng)(tzhng)： 第8页/共105页第九页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征形态学特征：形态学特征： 共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和线粒共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细胞膜上新出现体膜电位下降，膜流动性降低。细胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝氨酸（了一些生物大分子如磷脂酰

7、丝氨酸（phosphatidylserine,ps)phosphatidylserine,ps)和凝血酶敏感蛋白等，和凝血酶敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细胞的清除这些分子的出现与凋亡细胞的清除(qngch)(qngch)有有关。关。 第9页/共105页第十页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的特征的特征形态学特征：形态学特征： 凋亡细胞另一个形态特征通过总凋亡细胞另一个形态特征通过总DNADNA提取，提取，DNADNA凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱，可见凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱，可见(kjin)(kjin)清晰的清晰的DNADNA梯子梯子(ladder)(ladder)。

8、 第10页/共105页第十一页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶： 细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水解酶细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水解酶级联切割的过程，它将大分子级联切割的过程，它将大分子(fnz)(fnz)结构的物结构的物质如质如DNADNA、细胞骨架水解变性成小分子、细胞骨架水解变性成小分子(fnz)(fnz)碎片，致使细胞发生凋亡。碎片，致使细胞发生凋亡。第11页/共105页第十二页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspas

9、e蛋白酶：蛋白酶： 其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作用。它具有一段携带活化位点的保守氨基作用。它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨酸转酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有相同氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有相同(xin(xin tn tn) )的结构和功能特性而被称为的结构和功能特性而被称为caspasecaspase。第12页/共105页第十三页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶： caspase

10、caspase可能可能(knng)(knng)在凋亡细胞的在凋亡细胞的形态变化中起了主导作用。形态变化中起了主导作用。CaspaseCaspase通常是通常是以酶原形式存在，通过其自身诱发的蛋白以酶原形式存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有活性的酶，活化的水解而转化为有活性的酶，活化的caspasecaspase进一步激活其他的进一步激活其他的caspasecaspase前体，形成了级前体，形成了级联放大切割过程，裂解重要的大分子物质联放大切割过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。，导致凋亡。第13页/共105页第十四页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征

11、：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶： 目前已发现目前已发现1515个个caspasecaspase家族成员家族成员(chngyun)(chngyun)，分别命名为，分别命名为caspase-1caspase-11515，并，并根据其功能特点分成两类，即启动根据其功能特点分成两类，即启动caspase(caspase-2caspase(caspase-2、8 8、9 9、1010）和效应）和效应caspase(caspase3caspase(caspase3、6 6、7 7）。）。第14页/共105页第十五页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生

12、化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶： 启动启动caspasecaspase作用于凋亡信号触发后上游的作用于凋亡信号触发后上游的不可逆位点。效应不可逆位点。效应caspasecaspase由启动胱冬肽酶激活由启动胱冬肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解细胞成凋亡小，作用于下游的执行位点，裂解细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这两部分影响线粒体体。分子结构相互联系的这两部分影响线粒体，通过线粒体方式执行凋亡的信号。，通过线粒体方式执行凋亡的信号。bcl-2bcl-2家族家族成员成员(chngyun)(chngyun)能调节执行位点的进程。能调节执行位点的进程。第15页/共1

13、05页第十六页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶： caspase-3 caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为是最重要的指示蛋白酶，为17kD17kD和和12kD12kD亚单位组成的异二聚体。活化的亚单位组成的异二聚体。活化的caspase-3caspase-3可可以蛋白水解切割和激活其他以蛋白水解切割和激活其他caspasecaspase、相关的胞质、相关的胞质靶位点（细胞因子靶位点（细胞因子1818，CK18)CK18)和细胞核靶位点。和细胞核靶位点。Caspase-3Caspase-3切割切割CK

14、18CK18是凋亡是凋亡(dio wn(dio wn) )过程中过程中caspasecaspase切割发生的早期指示因子。切割发生的早期指示因子。 第16页/共105页第十七页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征：2 2 核酸内切酶的激活：核酸内切酶的激活： 细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，将核小体间连接将核小体间连接DNADNA降解，形成长度主要为降解，形成长度主要为180-180-200bp200bp整数倍的寡核苷酸片段，组蛋白和其他核整数倍的寡核苷酸片段，组蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也不改变。在内蛋白质不降

15、解，核基质也不改变。在DNADNA凝胶凝胶电泳分析中呈现出特征性电泳分析中呈现出特征性“梯状梯状”条带，而细条带，而细胞坏死时，胞坏死时，DNADNA片断大小不一，无片断大小不一，无“梯状梯状”条带条带出现出现(chxin)(chxin)。但并非所有凋亡细胞都能检。但并非所有凋亡细胞都能检测到这种典型的生化特征。测到这种典型的生化特征。 第17页/共105页第十八页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征：2 2 核酸核酸(h sun)(h sun)内切酶的激活：内切酶的激活： 第18页/共105页第十九页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特

16、征：生化特征：3 3 线粒体的变化：线粒体的变化： 线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型因子使线粒体通透性升高，膜上巨型(j (j xnxn) )通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中，线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体膜，线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体膜电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶联。电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶联。 第19页/共105页第二十页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生化特征：3 3 线粒体的变化：线粒体的变化： 线粒体膜电位的变

17、化发生在细胞凋亡的早线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧质子和其期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧质子和其他离子分布不对称造成的。线粒体参与了凋亡他离子分布不对称造成的。线粒体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切相关的的调控和实施。与凋亡密切相关的bcl-2bcl-2家族家族(jiz)(jiz)分布在细胞内膜系统，其中线粒体外分布在细胞内膜系统，其中线粒体外膜上分布最多，膜上分布最多，bcl-2bcl-2具有抑制线粒体通透性变具有抑制线粒体通透性变化的能力，并通过此途径抑制细胞凋亡。化的能力，并通过此途径抑制细胞凋亡。 第20页/共105页第二十一页，共105页。细

18、胞细胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征：4 4 胞质胞质Ca2+Ca2+和和pHpH的变化：的变化： 细胞内细胞内Ca2+Ca2+和和H+H+浓度的稳定对维持生命活动浓度的稳定对维持生命活动至关重要。胞内至关重要。胞内Ca2+Ca2+库的释放，胞质库的释放，胞质Ca2+Ca2+与细胞与细胞凋亡关系密切。胞外凋亡关系密切。胞外Ca2+Ca2+内流促使胞质内流促使胞质Ca2+Ca2+持续持续(chx)(chx)升高，作为凋亡信号启动凋亡发生。升高，作为凋亡信号启动凋亡发生。 第21页/共105页第二十二页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生化特征：

19、4 4 胞质胞质Ca2+Ca2+和和pHpH的变化：的变化： 此外，此外，Ca2+Ca2+的释放打破了细胞内结构的的释放打破了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡效应稳定，使得细胞凋亡效应(xioyng)(xioyng)系统系统的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。到的基质接触，从而触发细胞凋亡。 第22页/共105页第二十三页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生化特征：4 4 胞质胞质Ca2+Ca2+和和pHpH的变化：的变化： 细胞细胞pHpH的变化可影响细胞凋亡。细胞凋亡时的变化可影响细胞凋

20、亡。细胞凋亡时伴随胞质伴随胞质pHpH降低，胞质酸化影响细胞凋亡。胞质降低，胞质酸化影响细胞凋亡。胞质pHpH降低可能与胞质降低可能与胞质Ca2+Ca2+升高有关升高有关(yugun)(yugun)。胞。胞质酸化主要通过激活酸性质酸化主要通过激活酸性DNaseDNase启动细胞凋亡。启动细胞凋亡。pHpH降低也影响了一些酸性功能蛋白在细胞凋亡过降低也影响了一些酸性功能蛋白在细胞凋亡过程中的作用。程中的作用。 第23页/共105页第二十四页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的基因的基因调控调控 细胞凋亡受基因细胞凋亡受基因(jyn)(jyn)的调控，其的调控，其机制非常复杂。凋亡基因

21、机制非常复杂。凋亡基因(jyn)(jyn)可分为可分为两类：两类：1 1诱导基因诱导基因(jyn)(jyn)：野生型：野生型p53p53基因基因(jyn)(jyn)、c-mycc-myc、细胞表面抗原基因、细胞表面抗原基因(jyn)Apo-1(Fas)(jyn)Apo-1(Fas)等等2 2抑制基因抑制基因(jyn)(jyn)：bcl-2bcl-2、突变型、突变型p53p53基因基因(jyn)(jyn)和和rasras基因基因(jyn)(jyn)等等 第24页/共105页第二十五页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡的基因调控凋亡的基因调控 上述两类基因蛋白产物的表达对凋亡上述两类基因蛋白产物

22、的表达对凋亡(dio wn(dio wn) )起重要调控作用。诱导基因蛋起重要调控作用。诱导基因蛋白产物表达上调，可提高细胞对凋亡白产物表达上调，可提高细胞对凋亡(dio (dio wnwn) )信号的敏感性，促进凋亡信号的敏感性，促进凋亡(dio (dio wnwn) )发生。抑制基因蛋白产物表达，可降发生。抑制基因蛋白产物表达，可降低细胞对凋亡低细胞对凋亡(dio wn(dio wn) )信号的敏感性，信号的敏感性，抑制或推迟凋亡抑制或推迟凋亡(dio wn(dio wn) )。第25页/共105页第二十六页，共105页。细胞凋亡的基因细胞凋亡的基因(jyn)调控调控 诱导与抑制凋亡两大基

23、因蛋白表达的平衡，诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的平衡，可对细胞的增殖、分化可对细胞的增殖、分化(fnhu)(fnhu)和死亡进行调和死亡进行调控，维持细胞群体的正常稳定性。当调控失衡时控，维持细胞群体的正常稳定性。当调控失衡时，就会导致疾病，如肿瘤、，就会导致疾病，如肿瘤、AIDSAIDS、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等。等。第26页/共105页第二十七页，共105页。细胞凋亡的基因细胞凋亡的基因(jyn)调控调控常见的凋亡基因及其蛋白：常见的凋亡基因及其蛋白：1 bcl-2 1 bcl-2 是研究是研究(ynji)(ynji)最早的与凋亡有关的最早的与凋亡有关的基因。基因。 bcl-2 bc

24、l-2基因是一种对细胞凋亡具有明显基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后途抑制作用的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后途径，而对细胞周期无明显影响。它能抑制由许多径，而对细胞周期无明显影响。它能抑制由许多因子，如化疗药物、某些病毒、因子，如化疗药物、某些病毒、p53p53、c-mycc-myc及生及生长因子等激发的凋亡。长因子等激发的凋亡。第27页/共105页第二十八页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的基因的基因调控调控常见常见(chn(chn jin) jin)的凋亡基因及其蛋白：的凋亡基因及其蛋白：2 p53 p532 p53 p53基因不仅是一种与

25、肿瘤发生、发展相关基因不仅是一种与肿瘤发生、发展相关的抑癌基因，而且参与细胞生长、分化及死亡的的抑癌基因，而且参与细胞生长、分化及死亡的调控。调控。P53P53在调节凋亡中起重要作用。正常细胞和在调节凋亡中起重要作用。正常细胞和肿瘤细胞在受到紫外线或肿瘤细胞在受到紫外线或gammagamma射线照射后，含正射线照射后，含正常常p53p53的细胞，可发生凋亡，而的细胞，可发生凋亡，而p53p53基因缺失或突基因缺失或突变的细胞则表现出对电离射线和化疗药物的抗性变的细胞则表现出对电离射线和化疗药物的抗性。野生型。野生型p53p53对凋亡起促进作用，突变型对凋亡起促进作用，突变型p53p53对凋对凋

26、亡起抑制作用。亡起抑制作用。第28页/共105页第二十九页，共105页。细胞凋亡的基因细胞凋亡的基因(jyn)调控调控常见的凋亡基因及其蛋白：常见的凋亡基因及其蛋白：3 Fas3 Fas和和FasFas配体配体 Fas Fas是肿瘤坏死因子（是肿瘤坏死因子（TNFTNF）受体和神经生长因子受体家族的细胞表）受体和神经生长因子受体家族的细胞表面分子。面分子。FasFas配体（配体（Fas ligand,FasL)Fas ligand,FasL)是是TNFTNF家族的细胞表面分子。家族的细胞表面分子。FasLFasL与其受体与其受体FasFas结合导致携带结合导致携带(xidi)Fas(xidi)

27、Fas的细胞凋的细胞凋亡。抗亡。抗FasFas抗体、表达抗体、表达FasLFasL的细胞和可溶性的细胞和可溶性的的FasLFasL与与FasFas交联均产生细胞凋亡信息，而交联均产生细胞凋亡信息，而bcl-2bcl-2过度表达能抑制过度表达能抑制FasFas致凋亡作用。致凋亡作用。第29页/共105页第三十页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)与疾病与疾病细胞凋亡与肿瘤：细胞凋亡与肿瘤： 以往，细胞增殖的失调、细胞分化与增殖以往，细胞增殖的失调、细胞分化与增殖紊乱被认为是恶性肿瘤的发生机制。近来，人紊乱被认为是恶性肿瘤的发生机制。近来，人们认识们认识(rn shi)(rn shi)到

28、在肿瘤细胞快速增殖过程到在肿瘤细胞快速增殖过程中，同时也发生凋亡，增殖与凋亡之间的平衡中，同时也发生凋亡，增殖与凋亡之间的平衡有可能决定着肿瘤的生长速度。细胞凋亡的减有可能决定着肿瘤的生长速度。细胞凋亡的减少，在肿瘤发生、发展中起着重要作用。少，在肿瘤发生、发展中起着重要作用。第30页/共105页第三十一页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病细胞凋亡细胞凋亡(dio wn(dio wn) )与肿瘤：与肿瘤： 凋亡凋亡(dio wn(dio wn) )调节基因的紊乱、凋调节基因的紊乱、凋亡亡(dio wn(dio wn) )机制蛋白的增加是肿瘤形成机制蛋白的增加是肿瘤形成的重要机

29、制。用于调控肿瘤细胞凋亡的重要机制。用于调控肿瘤细胞凋亡(dio (dio wnwn) )的基因主要有的基因主要有bcl-2bcl-2基因家族、基因家族、p53p53基因基因、FasFas基因家族和基因家族和c-mycc-myc基因家族。基因家族。第31页/共105页第三十二页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：细胞凋亡与肿瘤： 许多肿瘤，尤其是消化道肿瘤常可见许多肿瘤，尤其是消化道肿瘤常可见凋亡的发生。凋亡在胃粘膜发生肠上皮化凋亡的发生。凋亡在胃粘膜发生肠上皮化生等病变中起决定性作用生等病变中起决定性作用(zuyng)(zuyng)，但，但胃癌的凋亡指数低于慢

30、性胃炎和胃溃疡。胃癌的凋亡指数低于慢性胃炎和胃溃疡。因此，胃粘膜病变细胞凋亡减少、生存期因此，胃粘膜病变细胞凋亡减少、生存期延长、细胞大量堆积可能是胃癌发生、浸延长、细胞大量堆积可能是胃癌发生、浸润及转移的基础。润及转移的基础。第32页/共105页第三十三页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：细胞凋亡与肿瘤： 凋亡还可能与胃癌的血管生成有关。凋亡指凋亡还可能与胃癌的血管生成有关。凋亡指数与肿瘤内部微血管密度数与肿瘤内部微血管密度(md)(md)成负相关，并成负相关，并与胃癌的组织类型有关。与胃癌的组织类型有关。第33页/共105页第三十四页，共105页。细胞凋亡

31、细胞凋亡(dio wn)与疾病与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病细胞凋亡与免疫系统疾病(jbng)(jbng)： 许多以免疫功能异常为主要特征的疾许多以免疫功能异常为主要特征的疾病病(jbng)(jbng)均存在细胞凋亡现象。细胞均存在细胞凋亡现象。细胞凋亡在免疫形态的发生分化以及抗感染免凋亡在免疫形态的发生分化以及抗感染免疫和自身免疫病的发生中起重要作用。疫和自身免疫病的发生中起重要作用。第34页/共105页第三十五页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：细胞凋亡与免疫系统疾病： 当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或

32、自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染力下降时，容易继发感染(gnrn)(gnrn)与肿瘤。与肿瘤。在细胞凋亡过程中，在细胞凋亡过程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)CD95(Fas)/CD95L(FasL)以以及及CD40/CD40LCD40/CD40L之间的相互作用起了重要作用。之间的相互作用起了重要作用。它们通过激活它们通过激活T T淋巴细胞的自杀或杀伤激活的淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B B淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。第35页/共105页第三十六页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡

33、(dio wn)与疾病与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：细胞凋亡与免疫系统疾病： 当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程(guchng)(guchng)中，中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及以及CD40/CD40LCD40/CD40L之间的相互作用起了重要作用。它们之间的相互作用起了重要作用。它们通过激活通过激活T T淋巴细胞的自杀或杀伤激活

34、的淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B B淋巴细淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。胞，进一步调节免疫反应的强弱。第36页/共105页第三十七页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：细胞凋亡与免疫系统疾病： 近来研究近来研究(ynji)(ynji)发现，淋巴细胞凋发现，淋巴细胞凋亡作用的缺陷与系统性红斑狼疮（亡作用的缺陷与系统性红斑狼疮（SLESLE）的发）的发生、发展有密切关系。淋巴细胞凋亡的缺陷生、发展有密切关系。淋巴细胞凋亡的缺陷常是自身基因调控异常的结果。目前已明确常是自身基因调控异常的结果。目前已明确定义为自身基因的有定义为自身基因的有FasFas和和b

35、cl-2bcl-2等。等。第37页/共105页第三十八页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)与疾病与疾病细胞凋亡细胞凋亡(dio wn(dio wn) )与皮肤病：与皮肤病： 某些皮肤病是以凋亡某些皮肤病是以凋亡(dio wn(dio wn) )的增加为的增加为特征。银屑病表皮的基底膜上层中观察到凋亡特征。银屑病表皮的基底膜上层中观察到凋亡(dio wn(dio wn) )的形态学和生化特征。的形态学和生化特征。plaqueplaque基底基底细胞层细胞层bcl-2bcl-2阳性细胞数显著下降。阳性细胞数显著下降。第38页/共105页第三十九页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾

36、病凋亡与疾病细胞凋亡与皮肤病：细胞凋亡与皮肤病： 自身免疫性皮肤病，如皮肌炎、硬皮自身免疫性皮肤病，如皮肌炎、硬皮病等，其免疫异常与自身反应性病等，其免疫异常与自身反应性T T、B B淋巴淋巴细胞凋亡缺陷有关。恶性黑色素瘤的发生细胞凋亡缺陷有关。恶性黑色素瘤的发生、发展与细胞凋亡基因调控失常而导致凋、发展与细胞凋亡基因调控失常而导致凋亡障碍有关。此外，细胞凋亡与皮肤肿瘤亡障碍有关。此外，细胞凋亡与皮肤肿瘤(zhngli)(zhngli)自动消退有关。自动消退有关。第39页/共105页第四十页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：缺血性脑损伤和缺血性心脏

37、病： 以往，脑缺血导致的细胞以往，脑缺血导致的细胞(xbo)(xbo)死死亡被认为是由于神经元广泛坏死所致。近亡被认为是由于神经元广泛坏死所致。近来研究表明，全脑或局部脑梗死均激活细来研究表明，全脑或局部脑梗死均激活细胞胞(xbo)(xbo)凋亡过程。大脑半球短暂缺血凋亡过程。大脑半球短暂缺血后，缺血中心区域神经细胞后，缺血中心区域神经细胞(xbo)(xbo)很快很快坏死，但周围的神经细胞坏死，但周围的神经细胞(xbo)(xbo)，以海，以海马马CAICAI区的锥形细胞区的锥形细胞(xbo)(xbo)最为明显，最为明显，要经过一个潜伏期才出现延迟性神经细胞要经过一个潜伏期才出现延迟性神经细胞(

38、xbo)(xbo)退化，即细胞退化，即细胞(xbo)(xbo)凋亡。凋亡。第40页/共105页第四十一页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：缺血性脑损伤和缺血性心脏病： 这种凋亡发生在缺血后这种凋亡发生在缺血后1-21-2天，并在缺血周边天，并在缺血周边区域出现区域出现bcl-2bcl-2蛋白的表达。而且，不仅在神经细蛋白的表达。而且，不仅在神经细胞，在胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和血管胞，在胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和血管壁中也有表达，这提示非致死性的损伤导致细胞壁中也有表达，这提示非致死性的损伤导致细胞产生产生bcl-2bcl-2，以抵抗细

39、胞的凋亡。此外，在缺血后，以抵抗细胞的凋亡。此外，在缺血后的脑组织中检测到的脑组织中检测到FasFas抗原抗原mRNAmRNA明显增加，提示明显增加，提示FasFas在凋亡中起一定在凋亡中起一定(ydng)(ydng)作用。作用。第41页/共105页第四十二页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：缺血性脑损伤和缺血性心脏病： 除了细胞坏死以外，凋亡也是缺血性心肌除了细胞坏死以外，凋亡也是缺血性心肌细胞死亡的重要方式。在体心脏实验表明，再细胞死亡的重要方式。在体心脏实验表明，再灌注损伤和心肌梗死均能诱发心肌细胞凋亡，灌注损伤和心肌梗死均能诱发心肌细胞凋亡

40、，尤其尤其(yuq)(yuq)在梗死早期。心肌梗死的大小取在梗死早期。心肌梗死的大小取决于细胞凋亡的严重程度，凋亡可能是缺血性决于细胞凋亡的严重程度，凋亡可能是缺血性心脏病演化为心力衰竭的细胞学机制。心脏病演化为心力衰竭的细胞学机制。第42页/共105页第四十三页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病感染性疾病：感染性疾病： HIV HIV感染可导致感染可导致AIDSAIDS。其感染的细胞学特征。其感染的细胞学特征是特异性破坏是特异性破坏CD4+TCD4+T淋巴细胞，造成相关免疫功淋巴细胞，造成相关免疫功能缺陷，导致感染和肿瘤。在能缺陷，导致感染和肿瘤。在HIVHIV感染过程中，

41、感染过程中，从从HIVHIV对对CD4+TCD4+T淋巴细胞黏附、病毒颗粒进入细淋巴细胞黏附、病毒颗粒进入细胞、胞、HIVHIV基因组在细胞中复制和装配以及出芽释基因组在细胞中复制和装配以及出芽释放等环节放等环节(hunji)(hunji)，都与细胞凋亡密切相关，都与细胞凋亡密切相关。第43页/共105页第四十四页，共105页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)与疾病与疾病其他其他(qt)(qt)疾病：疾病： 肾小球肾炎和狼疮肾炎动物模型中均肾小球肾炎和狼疮肾炎动物模型中均发现凋亡细胞，这些凋亡细胞可能与肾小发现凋亡细胞，这些凋亡细胞可能与肾小球硬化和肾功能衰竭有关。血管动脉粥样球硬化和肾功能衰

42、竭有关。血管动脉粥样硬化形成过程中，平滑肌细胞的增殖与凋硬化形成过程中，平滑肌细胞的增殖与凋亡同时存在，凋亡对内皮损伤、增殖抑制亡同时存在，凋亡对内皮损伤、增殖抑制、粥样病灶的形成和斑块的剥脱有一定的、粥样病灶的形成和斑块的剥脱有一定的影响。影响。 第44页/共105页第四十五页，共105页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病 通过对各种疾病细胞凋亡通过对各种疾病细胞凋亡(dio wn(dio wn) )的研究，使我们对疾病的发生机制有了新的认的研究，使我们对疾病的发生机制有了新的认识，同时也为疾病的治疗提供了新的思路。识，同时也为疾病的治疗提供了新的思路。 第45页/共105页第四十六页

43、，共105页。流式细胞分析流式细胞分析(fnx)细胞凋亡细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时最可靠的证据，其直接亡时最可靠的证据，其直接(zhji)(zhji)检检测方法主要是通过对组织或细胞进行各种测方法主要是通过对组织或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子显微镜下染色，然后在光学显微镜或电子显微镜下观察。观察。 第46页/共105页第四十七页，共105页。流式细胞流式细胞(xbo)分析细胞分析细胞(xbo)凋亡凋亡形态学特征检测形态学特征检测 凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时最凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时

44、最可靠的证据可靠的证据(zhngj)(zhngj)，其直接检测方法主要是，其直接检测方法主要是通过对组织或细胞进行各种染色，然后在光学显通过对组织或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子显微镜下观察。如通过苏木素微镜或电子显微镜下观察。如通过苏木素- -伊红（伊红（HE)HE)染色、吉姆萨（染色、吉姆萨（Giemsa)Giemsa)染色、甲基绿染色、甲基绿- -哌诺宁哌诺宁染色在普通光学显微镜下观察；通过荧光染料如染色在普通光学显微镜下观察；通过荧光染料如丫啶橙（丫啶橙（AO)AO)、Heochst33258Heochst33258染色在荧光显微镜下染色在荧光显微镜下观察；或制成超薄切片用电

45、子显微镜观察，以区观察；或制成超薄切片用电子显微镜观察，以区别凋亡和坏死。别凋亡和坏死。 第47页/共105页第四十八页，共105页。流式细胞分析流式细胞分析(fnx)细胞凋亡细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 FCM FCM可间接观察可间接观察(gunch)(gunch)凋亡细胞形凋亡细胞形态学变化，主要是根据未经染色的凋亡细胞态学变化，主要是根据未经染色的凋亡细胞的光散射特征进行检测。的光散射特征进行检测。 第48页/共105页第四十九页，共105页。流式细胞分析流式细胞分析(fnx)细胞凋细胞凋亡亡形态学特征检测形态学特征检测 FCM FCM提供的散射光参数主要提供的散射光参数主要(z

46、hyo)(zhyo)包括前包括前向散射光（向散射光（FSCFSC）和测向散射光（）和测向散射光（SSCSSC）。）。FSCFSC主要主要(zhyo)(zhyo)与细胞大小有关，对同一个细胞群体与细胞大小有关，对同一个细胞群体，散射光强的，其细胞大一些，散射光弱的，其，散射光强的，其细胞大一些，散射光弱的，其细胞小一些。细胞小一些。SSCSSC主要主要(zhyo)(zhyo)与细胞内部颗粒与细胞内部颗粒密度有关，颗粒密度越大，密度有关，颗粒密度越大，SSCSSC就越大，而颗粒密就越大，而颗粒密度越小，度越小，SSCSSC就越小。就越小。 第49页/共105页第五十页，共105页。流式细胞分析流式

47、细胞分析(fnx)细胞凋亡细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 当细胞发生凋亡的早期，细胞膜完整、细胞当细胞发生凋亡的早期，细胞膜完整、细胞皱缩，因此这一阶段皱缩，因此这一阶段(jidun)(jidun)凋亡细胞凋亡细胞FSCFSC较较活细胞小，而活细胞小，而SSCSSC较之增强或无明显变化。较之增强或无明显变化。 第50页/共105页第五十一页，共105页。流式细胞流式细胞(xbo)分析细胞分析细胞(xbo)凋亡凋亡形态学特征检测形态学特征检测 当细胞凋亡进一步发展时，细胞皱缩更当细胞凋亡进一步发展时，细胞皱缩更加明显加明显(mngxin)(mngxin)，核质的变化导致细胞，核质的变化导致

48、细胞内颗粒密度明显内颗粒密度明显(mngxin)(mngxin)增强，增强，FSCFSC进一进一步变小，而步变小，而SSCSSC却明显却明显(mngxin)(mngxin)增大。最增大。最终，当凋亡小体形成时，终，当凋亡小体形成时，FSCFSC明显明显(mngxin)(mngxin)缩小。缩小。 第51页/共105页第五十二页，共105页。流式细胞流式细胞(xbo)分析细胞分析细胞(xbo)凋亡凋亡形态学特征检测形态学特征检测 此外，也可通过此外，也可通过FSCFSC区分坏死细胞和凋区分坏死细胞和凋亡细胞。细胞坏死时，由于细胞肿胀亡细胞。细胞坏死时，由于细胞肿胀(zhngzhng)(zhngz

49、hng)，其，其FSCFSC增大，增大，SSCSSC在细胞在细胞坏死时也增大。但晚期凋亡细胞的坏死时也增大。但晚期凋亡细胞的FSCFSC和和SSCSSC与坏死细胞区分不明显。当坏死细胞的与坏死细胞区分不明显。当坏死细胞的细胞膜破裂，核质丢失，细胞成为碎片时细胞膜破裂，核质丢失，细胞成为碎片时，其，其FSCFSC和和SSCSSC均明显变小。均明显变小。第52页/共105页第五十三页，共105页。流式细胞分析流式细胞分析(fnx)细胞凋亡细胞凋亡第53页/共105页第五十四页，共105页。流式细胞分析流式细胞分析(fnx)细胞凋亡细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 但实际上，由于被检测细胞形态上

50、的均一但实际上，由于被检测细胞形态上的均一性和核性和核/ /质比例不同，凋亡不同阶段的细胞，质比例不同，凋亡不同阶段的细胞，其光散射其光散射(snsh)(snsh)参数的变化不同，有时很参数的变化不同，有时很难准确检测到凋亡细胞。但将光散射难准确检测到凋亡细胞。但将光散射(snsh)(snsh)参数与荧光标记的抗体或荧光染料参数与荧光标记的抗体或荧光染料结合起来检测细胞凋亡，可以克服单纯的光散结合起来检测细胞凋亡，可以克服单纯的光散射射(snsh)(snsh)参数的缺点。参数的缺点。第54页/共105页第五十五页，共105页。流式细胞流式细胞(xbo)分析细胞分析细胞(xbo)凋亡凋亡细胞对染

51、料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 凋亡细胞的一个重要特点是很长一段时间里凋亡细胞的一个重要特点是很长一段时间里细胞膜结构未受影响，其主要表现为：维持细胞膜结构未受影响，其主要表现为：维持(wich)(wich)膜的基本功能，如离子和大分子的屏膜的基本功能，如离子和大分子的屏蔽作用和具有功能的通道泵。蔽作用和具有功能的通道泵。第55页/共105页第五十六页，共105页。流式细胞分析流式细胞分析(fnx)细胞凋亡细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 根据不同功能状态下的细胞对染料的吸收根据不同功能状态下的细胞对染料的吸收或排斥作用不同，可用流式细胞仪定量或排斥作用不同，

52、可用流式细胞仪定量(dngling)(dngling)检测活细胞、凋亡细胞和坏死检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的百分比。细胞的百分比。第56页/共105页第五十七页，共105页。流式细胞流式细胞(xbo)分析细胞分析细胞(xbo)凋亡凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 处于早处于早/ /中期的凋亡细胞，仍然保持着完整中期的凋亡细胞，仍然保持着完整的质膜及其基本功能，阻碍大分子物质的质膜及其基本功能，阻碍大分子物质(wzh)(wzh)及离子进入细胞内。而晚期凋亡细胞及离子进入细胞内。而晚期凋亡细胞或坏死细胞，其质膜完整性受到破坏，使某些大或坏死细胞，其质膜完整性受到破坏，使某些

53、大分子物质分子物质(wzh)(wzh)及离子可以进入细胞内。因及离子可以进入细胞内。因此，根据对此，根据对DNADNA染料通透性的不同，可区分处于染料通透性的不同，可区分处于不同阶段的细胞。不同阶段的细胞。第57页/共105页第五十八页，共105页。流式细胞流式细胞(xbo)分析细胞分析细胞(xbo)凋亡凋亡细胞对染料细胞对染料(rnlio)(rnlio)吸收能力的检测吸收能力的检测 PI PI和和EBEB均属于插入性荧光染料均属于插入性荧光染料(rnlio)(rnlio)，可选择性的定量嵌入核酸双螺，可选择性的定量嵌入核酸双螺旋的碱基之间，其荧光发射均为橙红色，如果旋的碱基之间，其荧光发射均

54、为橙红色，如果使用氩离子激光使用氩离子激光488nm488nm激发，激发，PIPI的发射光谱波的发射光谱波长在长在610-620nm610-620nm范围，范围，EBEB的发射光谱波长在的发射光谱波长在603-610nm603-610nm之间，二者可互相替代，但之间，二者可互相替代，但EBEB毒性毒性较大。较大。第58页/共105页第五十九页，共105页。流式细胞分析流式细胞分析(fnx)细胞凋亡细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 7- 7-氨基氨基- -放线菌素放线菌素D D（7-AAD7-AAD）主要以插入方）主要以插入方式与式与DNADNA链的链的G-CG-C碱基对

55、结合，其激发波长约为碱基对结合，其激发波长约为580nm580nm，最大发射波长为，最大发射波长为660nm660nm，由于其发射波长，由于其发射波长较大，可与藻红蛋白（较大，可与藻红蛋白（PEPE）结合，通过单一）结合，通过单一(dny)(dny)光谱光谱488nm488nm的激光光源激发，可以进行的激光光源激发，可以进行定量定量DNADNA和免疫荧光的双参数分析。和免疫荧光的双参数分析。第59页/共105页第六十页，共105页。流式细胞流式细胞(xbo)分析细胞分析细胞(xbo)凋亡凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 由于由于(yuy)EB(yuy)EB、PIPI和和7-

56、AAD7-AAD不能进入不能进入具有完整细胞膜的活细胞中，即正常细胞和具有完整细胞膜的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在未固定时对这些染料是拒染的，凋亡细胞在未固定时对这些染料是拒染的，而坏死细胞胞膜完整性已破坏，可被染色。而坏死细胞胞膜完整性已破坏，可被染色。因此，这些染料可被用来鉴别死细胞和活细因此，这些染料可被用来鉴别死细胞和活细胞。胞。第60页/共105页第六十一页，共105页。流式细胞分析流式细胞分析(fnx)细胞凋细胞凋亡亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 赫斯特类染料（特别是赫斯特类染料（特别是HO33342)HO33342)检测检测细胞凋亡的原理与上述染料不同。细

57、胞凋亡的原理与上述染料不同。HO33342HO33342是双苯并咪唑家族成员之一，能特异与是双苯并咪唑家族成员之一，能特异与DNADNA螺旋中富含螺旋中富含A-TA-T重复序列结合。重复序列结合。HO33342HO33342用用氪激光激发氪激光激发(jf)(jf)紫外线荧光，激发紫外线荧光，激发(jf)(jf)光波长为光波长为352nm352nm，发射光波长为，发射光波长为400-500nm400-500nm，产生蓝色荧光。，产生蓝色荧光。第61页/共105页第六十二页，共105页。流式细胞流式细胞(xbo)分析细胞分析细胞(xbo)凋亡凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 H

58、O33342 HO33342能被活细胞摄取，而其从细胞内排能被活细胞摄取，而其从细胞内排出是一个耗能的主动过程，依赖细胞膜上的出是一个耗能的主动过程，依赖细胞膜上的P-P-糖糖蛋白泵。活细胞染色时，应考虑是否存在细胞抗蛋白泵。活细胞染色时，应考虑是否存在细胞抗药性问题药性问题(wnt)(wnt)，如有耐药性，则染色效果，如有耐药性，则染色效果不佳。不佳。HO33342HO33342进入凋亡细胞比正常细胞多，将进入凋亡细胞比正常细胞多，将其与其与PIPI结合对凋亡细胞进行双染，可将正常细胞结合对凋亡细胞进行双染，可将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区分开来。、凋亡细胞和坏死细胞区分开来。第62页/共

59、105页第六十三页，共105页。流式细胞分析流式细胞分析(fnx)细胞凋亡细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测(jin c)(jin c) 在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现为：正常细胞低蓝光胞表现为：正常细胞低蓝光/ /低红光，凋亡细胞低红光，凋亡细胞为高蓝光为高蓝光/ /低红光，坏死细胞为低蓝光低红光，坏死细胞为低蓝光/ /高红光。高红光。第63页/共105页第六十四页，共105页。流式细胞分析流式细胞分析(fnx)细胞凋亡细胞凋亡caspasecaspase的流式细胞仪检测的流式细胞仪检测 caspase caspase

60、家族在细胞凋亡过程中起着重要作家族在细胞凋亡过程中起着重要作用，通过用，通过caspasecaspase对大分子结构的瀑布级联水解对大分子结构的瀑布级联水解反应，导致凋亡发生。其中反应，导致凋亡发生。其中caspase-3caspase-3是最重要是最重要的指示蛋白酶，活化的的指示蛋白酶，活化的caspase-3caspase-3可以可以(ky)(ky)蛋白水解切割和激活其他的蛋白水解切割和激活其他的caspasecaspase、相关胞质、相关胞质的靶位点（的靶位点（CK18CK18）等。）等。Caspase-3Caspase-3切割细胞因子切割细胞因子，尤其是，尤其是CK18CK18，是凋亡