第二章第四节干细胞工程(6)

1、一个胚胎干细胞一个胚胎干细胞第四节干细胞工程第四节干细胞工程一、什么是干细胞？一、什么是干细胞？干细胞（干细胞（Stem cellStem cell）即起源细胞。在细胞的分化过）即起源细胞。在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能程中，细胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞。一不足，保留了一部分未分化的原始细胞。因此，因此，干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。胞。全能细胞全能细胞囊胚囊胚囊胚内层

2、细胞团囊胚内层细胞团多能干细胞多能干细胞原始胚胎细胞原始胚胎细胞 受精受精 卵裂卵裂 受精后受精后72h 受精后受精后5-7天天精子精子+卵子卵子 合子合子 卵裂球卵裂球 桑椹胚桑椹胚 囊胚囊胚 滋养层滋养层胎盘及胎儿附属结构胎盘及胎儿附属结构囊胚囊胚 内胚层内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。 内细胞群内细胞群 中胚层中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层外胚层体表结构；神经系统体表结构；神经系统它们是未分化的，但具有分化成各种特定细胞的能力；它们是未分化的，但具有分化成各种特定细胞的能力；

3、它们可无限地分裂产生大量后裔它们可无限地分裂产生大量后裔; ;其子细胞有两种命运，保持为干细胞或分化为特定细其子细胞有两种命运，保持为干细胞或分化为特定细胞。胞。干细胞的主要特征干细胞的主要特征： 全能干细胞全能干细胞 多能干细胞多能干细胞 单能干细胞单能干细胞按分化潜能按分化潜能按发育状态按发育状态胚胎干细胞胚胎干细胞成体干细胞成体干细胞干细胞的分类干细胞的分类全能干细胞全能干细胞： （Totipotent stem cell）具有形成完整个体的分化潜具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞能。如胚胎干细胞（ES细胞细胞）多能干细胞多能干细胞：（pluripotent stem cell）具

4、有分化出多种细胞组织的具有分化出多种细胞组织的潜能。如造血干细胞、神经潜能。如造血干细胞、神经干细胞。干细胞。单能干细胞单能干细胞：（multipotent stem cell）只能向一种或两种密切相关只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化。如上皮组的细胞类型分化。如上皮组织基底层的干细胞，肌肉中织基底层的干细胞，肌肉中的成肌细胞。的成肌细胞。胚胎干细胞 ES细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。 研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。在未来几年，ES细胞移植和其它先进生物技术的联合应用很可能在移植医学领域引发革命性进步。成

5、体干细胞 成年动物的许多组织和器官，比成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。平衡。 二二 胚胎干细胞胚胎干细胞胚胚胎胎干干细细胞胞研研究究的的进进展展情情况况 1981 年年， Evans 和和 Martin 分分别别成

6、成功功的的分分离离和和体体外外培培养养了了小小鼠鼠的的胚胚胎胎干干细细胞胞 1995 年年，Thomson 等等人人分分离离建建立立了了第第一一株株灵灵长长类类动动物物的的胚胚胎胎干干细细胞胞。 1998 年年，Thomson 等等建建立立了了第第一一株株人人类类胚胚胎胎干干细细胞胞 1998 年年，Shamblott 等等建建立立了了第第一一株株人人类类生生殖殖干干细细胞胞 2000 年年，Reubinoff 等等建建立立了了两两株株人人胚胚胎胎干干细细胞胞。 1.衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；2.永生化永生化(immortal)；3.能维持

7、稳定的正常的二倍体染色体结构；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；4.有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；5.能参与胎儿所有组织的发育过程；能参与胎儿所有组织的发育过程；1 胚胎干细胞的性质胚胎干细胞的性质2.人类干细胞的来源 成人细胞或脐血成人细胞或脐血/ /胎儿组织胎儿组织( (专能专能/ /多能多能) )。 人工流产后的人类胎儿生殖组织人工流产后的人类胎儿生殖组织( (全能全能) )。 用捐赠者的配子通过体外授精创造的人类胚胎用捐赠者的配子通过体外授精创造的人类胚胎( (全能全能) )。 通过体细胞核转移技术通过体细胞核转移技术( (克隆技术克隆技

8、术) )产生的人类产生的人类胚胎胚胎( (全能全能) )。 以上都必须获得当事人的知情同意。以上都必须获得当事人的知情同意。 分离囊胚的内细胞群 与成纤维细胞共培养，ES 细胞非分化增殖 分离胚胎生殖腺脊细胞 -胚胎干细胞的鉴定-定向诱导分化-成体干细胞-功能细胞 3 胚胎干细胞系的建立过程胚胎干细胞系的建立过程胚胎干细胞的培胚胎干细胞的培养养4 培养条件：培养条件：(1)特殊的培养液特殊的培养液：胎牛血清的浓度和质量很重：胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；要，还要加非必须氨基酸；-巯基乙醇。巯基乙醇。(2) 以人或胚鼠的以人或胚鼠的成纤维细胞成纤维细胞为饲养细胞。为饲养细胞。(

9、3) 必须加入必须加入LIF(白血病抑制因子白血病抑制因子)，抑制细胞分，抑制细胞分化。化。干细胞的分化干细胞的分化干细胞培养过程干细胞培养过程5 干细胞诱导分化的常用方法干细胞诱导分化的常用方法（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，）加入诱导细胞分化的因子或化学物质， 如如DMSO和和RA等等（2）将）将ES细胞与特定的细胞共培养细胞与特定的细胞共培养 （3）将某种分化诱导因子的基因转入）将某种分化诱导因子的基因转入ES细细 胞内胞内 胚胎干细胞的诱导分化胚胎干细胞的诱导分化： 胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞胚胎干细胞造血细胞造血细胞 RA胚胎干细胞胚胎

10、干细胞神经细胞神经细胞 DMSO胚胎干细胞胚胎干细胞肌肉细胞肌肉细胞 TGF-B1, bFGF胚胎干细胞胚胎干细胞血管和内皮细胞血管和内皮细胞 RA+胰岛素胰岛素+T3胚胎干细胞胚胎干细胞脂肪细胞脂肪细胞 BMP-2, BMP-4胚胎干细胞胚胎干细胞软骨细胞软骨细胞 地塞米松，磷酸甘油地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞胚胎干细胞骨细胞骨细胞 基因转染基因转染胚胎干细胞胚胎干细胞胰岛素分泌细胞胰岛素分泌细胞6 胚胎干细胞的鉴别胚胎干细胞的鉴别 胚胎干细胞具有以下特点：胚胎干细胞具有以下特点：(1) 细胞内碱性磷酸酶活性高细胞内碱性磷酸酶活性高(2) 端粒酶活性高端粒酶活性高(3)细胞膜表面有特殊的标记

11、：细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81(4)能分化成三个胚层的细胞，能分化成三个胚层的细胞，(5)将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤(6) 可诱导分化为各种成体干细胞可诱导分化为各种成体干细胞7 胚胎干细胞的胚胎干细胞的 胚胎干细胞 生殖干细胞 SSEA-1 SSEA-3 SEA-4 TRA-1-60 TRA-1-81 AKP Oct-4 未知 端粒酶活性 滋养细胞 滋养细胞 无血清培养 bFGF 鉴定干细胞的常用方法：鉴定干细胞的常用方法：（1）细胞形态与结构）细胞形态与结构（2）细

12、胞功能）细胞功能（3）细胞表面的特殊标志）细胞表面的特殊标志 （4）细胞内特异基因的表达）细胞内特异基因的表达 研究意义研究意义 人胚胎发育机制及影响因素的研究。人胚胎发育机制及影响因素的研究。 用于药物机理及毒性实验的研究，减少人体用于药物机理及毒性实验的研究，减少人体和动物的实验及临床研究。和动物的实验及临床研究。 将胚胎干细胞定向分化的细胞用于制造人体将胚胎干细胞定向分化的细胞用于制造人体细胞、组织和器官。细胞、组织和器官。 Culturing Hematopoietic Stem Cell 8 来源于干细胞的组织可能用于治疗的疾病来源于干细胞的组织可能用于治疗的疾病 细胞类型细胞类型

13、治疗的疾病治疗的疾病神经细胞神经细胞 中风、帕金森氏病、老年痴呆症、中风、帕金森氏病、老年痴呆症、 脊髓损伤、多发性硬化病脊髓损伤、多发性硬化病心肌细胞心肌细胞 心脏病发作、充血性心脏病心脏病发作、充血性心脏病产生胰岛素的细胞产生胰岛素的细胞 糖尿病糖尿病软骨细胞软骨细胞 骨性关节炎骨性关节炎血细胞血细胞 癌症、免疫缺乏症、遗传学血液癌症、免疫缺乏症、遗传学血液 病、白血病病、白血病肝细胞肝细胞肝炎、肝硬化肝炎、肝硬化皮肤细胞皮肤细胞烧伤烧伤骨细胞骨细胞骨质疏松症骨质疏松症视网视网(眼眼)细胞细胞黄斑症黄斑症骨骼肌细胞骨骼肌细胞 肌肉萎缩症肌肉萎缩症帕金森氏病帕金森氏病 帕金森氏病帕金森氏病又

14、称震颤麻痹，是中老年人最常见的中枢神经系统变性疾病。 震颤是指头及四肢颤动、振摇，麻痹是指肢体某一部分或全部肢体不能自主运动。 法首創幹細胞移植治療燒傷法首創幹細胞移植治療燒傷 法國格瑞諾布軍醫研究中心成功利用幹細胞移植，治癒一名因放射線照射，皮膚遭嚴重破壞的病人。 根據世界報報導，格瑞諾布軍醫研究中心在一個半月前，治療一名遭放射線燒壞右手皮膚的傷患，這名傷患受傷程度可導致截肢。 為避免截肢，醫師自傷患身上取出脊髓，分離出其中幹細胞，在實驗室中轉化為皮膚細胞並進行增生，然後移植到傷患手上。 傷患恢復情形良好，手部知覺已完全恢復，也不再疼痛。谁从干细胞研究中受益？谁从干细胞研究中受益？下面的疾病

15、一半以上没有有效的治疗办法下面的疾病一半以上没有有效的治疗办法 疾病疾病 发病率发病率肌肉萎缩症肌肉萎缩症 0.3/1000帕金森氏病帕金森氏病 1/500老年痴呆病老年痴呆病 65岁以上岁以上1/20糖尿病糖尿病 3/100心脏病心脏病 55岁以上岁以上1/3肝病肝病 1/12癌症癌症 74岁以上岁以上1/4骨质疏松症骨质疏松症 60岁以上岁以上1/3 成体干细胞研究是干细胞研究中最激动人成体干细胞研究是干细胞研究中最激动人心的部分。心的部分。 它可以有效地防止组织排斥，可以避免伦它可以有效地防止组织排斥，可以避免伦理学、法律系方面的争论理学、法律系方面的争论。 成体干细胞是否具有胚胎干细胞

16、那样的分成体干细胞是否具有胚胎干细胞那样的分化潜力？化潜力？ 大量的动物实验证明了成体干细胞具有很大量的动物实验证明了成体干细胞具有很强的分化能力。强的分化能力。9 成年个体的干细胞研究从成年小白鼠未发育的脑干细胞转变为肌肉细胞Angelo Vescovi 和 Giulio Cossu, 在 the Institute for Stem Cell Research in Milan 2000-9-20他们也用成年人志愿者的神经干细胞实现了同样的工作自身干细胞治疗肝病自身干细胞治疗肝病 2005年10月8日出版的新科学家杂志报道，英国科学家利用肝病患者自身骨髓干细胞对其进行治疗，取得了明显效果。

17、 伦敦大学帝国理工学院的一个小组首先向肝病患者注射粒细胞集落刺激因子（GCSF），诱使其骨髓产生更多的干细胞。 随后，再对患者骨髓细胞进行筛选，挑选出具有表面蛋白质CD34的细胞，该蛋白质是干细胞的标志。 最后，将这些干细胞浓缩并最后，将这些干细胞浓缩并注射到患者注射到患者的门静脉和肝动脉中的门静脉和肝动脉中，这两条血管直接，这两条血管直接向肝脏输送血液向肝脏输送血液. 但这些细胞很快便进入了患者肝脏的受但这些细胞很快便进入了患者肝脏的受损部位，并对其进行了修复。损部位，并对其进行了修复。 在连续治疗两个月后，在连续治疗两个月后，5名患者中的名患者中的3名名肝功能和身体素质都有了明显的改善肝功

18、能和身体素质都有了明显的改善.10 胚胎是胚胎是“人人”吗？吗？ 胚胎是人胚胎是人(person)？胚胎是生命？胚胎是生命？ 胚胎是人类生物学生命胚胎是人类生物学生命(human biological life)，但尚未但尚未成为人类人格生命成为人类人格生命(human personal life)。 胚胎具有一定价值胚胎具有一定价值，应得到一定的尊重应得到一定的尊重(due respect, 如如尸体尸体), 没有充分的理由不能操纵和毁掉。没有充分的理由不能操纵和毁掉。 毁掉胚胎要一定程序去做。毁掉胚胎要一定程序去做。胚胎胚胎对胚胎应有的尊重和应有的处理程序对胚胎应有的尊重和应有的处理程序

19、应有的尊重指适当的尊重：在完全尊重（人）与不必应有的尊重指适当的尊重：在完全尊重（人）与不必尊重（如一块孤立的石头）之间：非人动物、胎儿、尊重（如一块孤立的石头）之间：非人动物、胎儿、胚胎、尸体等。胚胎、尸体等。 人类胚胎用作研究必须是体外的，不能超过人类胚胎用作研究必须是体外的，不能超过1414天；天； 不用人类胚胎，重要研究的目的就不可能达到；不用人类胚胎，重要研究的目的就不可能达到； 不是商品，不能买卖；不是商品，不能买卖； 科学家应采取必要的行动纪念那些胚胎的贡献；科学家应采取必要的行动纪念那些胚胎的贡献； 必要的程序是指专门的埋葬或活化，也应有简单庄严必要的程序是指专门的埋葬或活化，

20、也应有简单庄严的仪式。的仪式。动物与人的嵌合问题动物与人的嵌合问题 人的配子与动物的配子制造嵌合体。后果会如人的配子与动物的配子制造嵌合体。后果会如何？出现一个何？出现一个“人头马人头马”怎么办？怎么办？ 广州某大学教授用一名广州某大学教授用一名7 7岁的男孩的皮肤体细胞岁的男孩的皮肤体细胞核植入去核兔卵母细胞内，克隆出核植入去核兔卵母细胞内，克隆出100100多个胚胎。多个胚胎。 目的是什么？因为人卵难得？为什么不用流产目的是什么？因为人卵难得？为什么不用流产胎儿卵或女尸的卵？这种嵌合体不是人类胚胎，胎儿卵或女尸的卵？这种嵌合体不是人类胚胎，获得的干细胞不是人类干细胞获得的干细胞不是人类干细

21、胞. .三 造血干细胞应用 造血干细胞造血干细胞是体内各种血细胞是体内各种血细胞( (白细胞白细胞 红红细胞细胞 血小板血小板) )的唯一来源，它主要存在于的唯一来源，它主要存在于骨髓、骨髓、外周血外周血、脐带血中。、脐带血中。 造血干细胞移植造血干细胞移植是骨髓移植、外周血造血是骨髓移植、外周血造血干细胞移植和脐带血移植的通称。干细胞移植和脐带血移植的通称。 造血干细胞的移植造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病最是治疗血液系统疾病最有效方法。有效方法。 骨髓含有大量的造血干细胞骨髓含有大量的造血干细胞, , 造血干细胞来源造血干细胞来源于红骨髓。于红骨髓。 骨髓移植是指骨髓移植是指將將健康的骨

22、髓健康的骨髓输入受体输入受体，取代原本有取代原本有病变病变骨髓，使其骨髓，使其发挥发挥正常的正常的骨髓功能。骨髓功能。 骨髓移植是治疗血液疾病的最早的方法，骨髓移植是治疗血液疾病的最早的方法，19681968年第一次骨髓移植成功年第一次骨髓移植成功。 如有适当的供髓者，骨髓移植已有百分之八十如有适当的供髓者，骨髓移植已有百分之八十至九十的长期存活率。至九十的长期存活率。1 1 骨髓移植骨髓移植: :骨髓移植缺点：骨髓移植缺点：全身麻醉抽骨髓全身麻醉抽骨髓抽取量：約抽抽取量：約抽10201020毫升毫升/ /公斤的骨公斤的骨髓。髓。 骨骨 髓髓 采采 集集骨骨 髓髓 采采 集集临床造血干细胞移植

23、的过程临床造血干细胞移植的过程 全身钴全身钴6060照的放射剂照的放射剂量监测量监测全身钴全身钴6060照射（照射（ TBITBI） 应用荧光显微镜进行白血病应用荧光显微镜进行白血病免疫分型免疫分型骨髓细胞学分析骨髓细胞学分析无菌层流病房无菌层流病房2 外周血造血干细胞移植外周血造血干细胞移植: 造血干细胞细胞由骨髓大量生成，造血干细胞细胞由骨髓大量生成，其中少量的干细胞被释放到血液中，其中少量的干细胞被释放到血液中，这就是外周血干细胞这就是外周血干细胞(PBSC）. 优点优点:1.采集安全简便采集安全简便, 避免骨髓穿刺痛苦。避免骨髓穿刺痛苦。2.造血及免疫功能恢复快造血及免疫功能恢复快3.

24、受肿瘤细胞污染机会减少。受肿瘤细胞污染机会减少。外周血造血于细胞移植在临床应外周血造血于细胞移植在临床应用时存在的问题：用时存在的问题： 外周血的造血干细胞量极少，不能满足移外周血的造血干细胞量极少，不能满足移植的需要，植的需要， 收集的外周血干细胞可能混杂有肿瘤细胞；收集的外周血干细胞可能混杂有肿瘤细胞； 移植物中存在大量移植物中存在大量T细胞，可能诱发严重细胞，可能诱发严重移植物抗宿主病移植物抗宿主病 (GVHD) ； 常用的是造血干细胞分离机，机型是常用的是造血干细胞分离机，机型是FewnalCS3000(或或CS3000Plus)。 一般情况下行大静脉穿刺即可。一般情况下行大静脉穿刺即可。采集成人时的血流速度为采集成人时的血流速度为5060m1min，每次分离，每次分离46循环循环(约约34h)，分离血液的总容积，分离血液的总容积9L，依据情况连续，依据情况连续或隔日采集。或隔日采集。 造血干细胞移植大约需采集捐献者克的造血干细胞造血干细胞移植大约需采集捐献者克的造血干细胞, 因此要对捐献者使用造血生长因子因此要对捐献者使用造血生长因子(HGF) ，加速骨髓造，加速骨髓造血干细胞的生成并