蛋白组学和肿瘤标志物2009

1、PowerPoint TemplatePowerPoint Template蛋白质组学技术在肿瘤标志蛋白质组学技术在肿瘤标志物检测中的应用物检测中的应用复旦大学附属华山医院 检验医学科中心实验室关 明2危害健康的头号杀手危害健康的头号杀手- -肿瘤肿瘤l世界卫生组织最新资料库显示：2005年，全球大约有760万人死于各种癌症，约1千1百万人被诊断患有癌症。l中国死于恶性肿瘤的人数约为130万人，约2百万人被诊断患有癌症。我国居民每死亡5人中，即有1人死于癌症。l美国从1960到1990的30年间，肿瘤患者的五年存活率由50上升为63，主要归功于早期诊断技术的发展，而中晚期的患者的五年存活率，几

2、乎没有提高。3最好的治疗方法就是早期诊断最好的治疗方法就是早期诊断l早期诊断可以治疗癌症，早期诊断癌症的最新、最有效的方法是验血诊断，寻找肿瘤标志，特别是其中的蛋白标志！ -Lee Hartwell博士，2004年第21届国际肿瘤标志学术会议l目前临床常用的肿瘤标志物有20多种，如PSA、CEA或CA125等，但大部分只能用于疗效的观察、评判预后及预报复发，能用于大规模人群的普查的肿瘤标志物寥寥无几。 4 Differential Protein Expression蛋白质蛋白质Functional Assays蛋白质功能蛋白质功能基因基因DNA Sequencing信使信使RNADiffer

3、ential Gene ExpressionDNA/RNAProteinsProteomics Technology P R O T O M I C SP R O T O M I C SEnabling TechnologyEnabling TechnologyThe phenotype at the molecular levelEnabling TechnologyEnabling TechnologyPCR GeneChip & Microarrays G E N O M I C SG E N O M I C SThe genotype at the molecular leve

4、l5mRNA表达表达蛋白质表达蛋白质表达5401326l蛋白质组学(Proteomics)是研究在特定时间或环境下某个细胞或某种组织的基因组表达的全部蛋白质。l它不是按照传统的方式孤立地研究某种蛋白质分子的功能，而是应用各种蛋白质组学技术研究某种蛋白质在复杂的细胞环境中的功能。l蛋白质组学旨在列出全部蛋白质的细目，弄清每一个蛋白质的结构和功能及蛋白质群体内的相互作用，对比在疾病和健康状态下它们的表达水平的变化。什么是蛋白组学7蛋白组学历史蛋白组学历史l“proteomics”始于1994年，与临床检验密切相关l第一个肿瘤标志物 Bence Jones protein 1847.l人类基因组有3

5、0000个左右基因，每个基因能编码数个蛋白产物l最高的分离技术仅仅能分离数千个成分l血清或者血浆中蛋白或者多肽的复杂性远远超过目前的分离技术l依赖多重分离手段8910蛋白组学技术蛋白组学技术l现代蛋白质组学的出现和发展，如双向电泳技术、蛋白芯片、飞行时间质谱等技术的发展，给临床肿瘤早期标志物的发现带来了划时代的革命。l传统一次只能测定一个蛋白 现在一次可测定数十个甚至数百 个蛋白l提高了诊断的灵敏度和特异性11蛋白组学研究手段蛋白组学研究手段l激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术l双向电泳双向电泳l荧光差异双向电泳系统荧光差异双向电泳系统 lSELDI-TOFlMALDI-TOFlMALD

6、I-Imaging12激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术l组织是多种细胞群体相互作用的三维空间结构， 但以往的各种技术所获得的细胞，其内既有肿 瘤细胞，又多少不等地含有一些其他细胞。l体外培养的细胞系虽能解决组织异质性问题，但其培养环境与组织内环境有一定差距，无法真实反映在体内复杂环境下生长的肿瘤细胞具有的各种特性。l而激光捕获显微切割技术(Laser capture microdissection, LCM)是一项在显微镜直视下从组织切片中确定、分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的技术，它成功解决了细胞异质性问题，是肿瘤学研究的一项革命性技术。13LCM的基础原理的基础原理l将制备好的

7、切片放在倒置是微镜载物台上，调整表面贴附一层乙烯乙酸乙烯醋(ethylene vinyl acetate,EVA)膜的塑料帽，使其覆于切片的组织表面，并使目的细胞(群)位于视野中心。l发射激光束，瞬间升温使EVA膜局部融化，渗透到目的细胞周围，随即迅速冷却固化，于是EVA膜与其下方的细胞便紧密粘合在一起。l揭起EVA膜，被捕获的目的细胞即和EVA膜一起脱离切片上的其他组织。14LCM的优点的优点l方法快速、简便、易行 每片转运膜可经受1000-3000次激光脉冲，捕获6000个以上的细胞。每次激发耗时不超过1秒l准确度高 激光定位的准确程度可以达到1um,捕获点范围达到3-5 um，因而足以捕

8、获单个细胞，l细胞形态保持完好 使用多聚体膜捕获目的细胞，无损伤破坏，保持了其完整的组织形态l细胞内分子结构保持完整 转运膜轻微、短暂的温度变化对细胞内DNA,mRNA以及蛋白质均无损伤l特异性强 LCM可以从免疫组化染色的组织切片中分离、纯化具有不同抗原表型的细胞群加以研究1516双向凝胶双向凝胶(2D gel)电泳电泳l分离蛋白质最基本的工具。l原理是：第一向是等电聚集电泳：用pH值呈梯度排列的凝胶，分离等电点不同的蛋白质。l第二向是十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)：由于带负电荷的SDS可与蛋白质多肽链结合，掩盖了蛋白质原有的电荷差别，故可分离分子量不同的蛋白质。l双向凝

9、胶电泳不仅用于蛋白质的分离，同时也用于蛋白质的纯化，一张凝胶可分离纯化出几百个甚至上千个蛋白质。1718经典蛋白质组研究技术路线样品(组织、细胞等)凝胶图象分析蛋白质鉴定二维数据库酶解HPLC-MS、MS/MS数据库检索二维凝胶电泳酶解肽混合物MS、MS/MS肽指纹谱肽序列标签测序样品分离蛋白鉴定鉴定原则pIMW一维SDS-PAGE2021l操作强度高，耗时，需要严格控制各种条件操作强度高，耗时，需要严格控制各种条件l肉眼判断表达强度，误差大肉眼判断表达强度，误差大l不适应于大规模筛查和临床检测不适应于大规模筛查和临床检测- -通量低通量低l低丰度、跨膜蛋白、以及疏水性蛋白很难被分离低丰度、跨

10、膜蛋白、以及疏水性蛋白很难被分离- -分离能分离能力差力差l胶上的蛋白质斑点很大部分包含一种以上蛋白胶上的蛋白质斑点很大部分包含一种以上蛋白- -分辨率低分辨率低l在样品制备过程中的蛋白修饰会产生一些假阳性点在样品制备过程中的蛋白修饰会产生一些假阳性点l高丰度蛋白会掩盖低丰度蛋白的存在高丰度蛋白会掩盖低丰度蛋白的存在双向凝胶双向凝胶面临的挑战面临的挑战2223242538个蛋白点的表达存在明显差异,其中新增蛋白点3个,缺失5个,20个明显上调,10个明显下调.26 荧光差异双向电泳系统 l凝胶差异蛋白质组分析的金标准，是唯一精确定量2D胶差异的技术，显著降低了重复实验和凝胶数量。 l这种方法将

11、待比较的两个样品的总蛋白分别用两种不同的荧光标记试剂(Cy3或Cy5)进行标记，并等量混合，上样进行双向电泳分离。l2D凝胶在成像仪上用两种不同的波长激发成像，并用分析软件进行定量分析，对差异的蛋白质点进一步用MALDI -TOF或其他方法鉴定。272829Tissue sample typical or ordinary PTC 5 matched normal tissue 5 normal tissue from patients 3 with benign adenomas (secondary control).30Proteins from poolsof non-tumor th

12、yroid tissue from patients with benign tumors (adenoma) were conjugated toCy3 and protein from pools of non-tumor thyroid tissue from PTC patients were conjugatedto Cy5.only 89 (6.3%) of 1414 spots were determined to have two-fold difference31Proteins from pools of non-tumor thyroid tissue from PTC

13、patients were conjugated to Cy3, and protein from pools of PTC tumor tissue from the same patients were conjugated to Cy5. Proteins overexpressed in PTC are shown in red, those underexpressed in green. 628 (34.2%) of the 1840 spots as two-fold different in volume ratio32l Protein spots (289) were pi

14、cked from the gel, digested with trypsin, and subjected to MALDI TOF MS analysis.lAnalysis focused on 192 spots which returned valid identifications，representing 90 distinct proteins. lNovel differentially expressed proteins include S100A6, moesin, HSP70 (BiP), peroxiredoxin 2, protein phosphatase 2

15、, selenium binding protein 1, vitamin D binding protein, and proteins involved in mitochondrial function. 3334荧光差异双向电泳系统的优点和缺点优点:l可以在同一块凝胶上比较两种不同来源或不同处理样本的蛋白质表达谱l能在较宽的动态范围内精确地对感兴趣的蛋白质进行定量缺点:l胶内的蛋白质离开荧光成像扫描后便无法显示l未被标记的分子与被标记的分子在凝胶上的位置略有不同,尤其是低分子量的蛋白35Application of Mass Spectrometry in Cancer Diagnos

16、is 36ProteinChip SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionisation time-of-flight) MS 蛋白蛋白质飞质飞行行质谱仪质谱仪37*SELDI: Surface Enhanced Laser Desorption/IonizationProteinChip Technology: SELDI TOF-MSSample is placed on a ProteinChip Array and processed.Sample proteins bind to chemical or biological “

17、docking sites” Non-binding proteins are washed away, eliminating sample “noise”.WASH38ProteinChip Technology: SELDI TOF-MSlRetained proteins are “eluted” from the ProteinChip Array by Laser Desorption/Ionization lIonized proteins are detected and their mass is accurately determined by Time-of-Flight

18、 Mass SpectrometryIntensityMolecular Mass (Da)Molecular Mass (Da)LaserTOF-MSTOF-MS39生物生物芯片芯片化学化学芯片芯片疏疏水芯片水芯片 阳阳离子交换离子交换金属金属芯片芯片亲水芯片亲水芯片PS10 or PS20 抗抗原原- 抗体抗体受受体体 配体配体DNA - Protein阴阴离子交换离子交换ProteinChip Arrays40lAu芯片是基于SELDI技术的未经任何化学或生物基团修饰的金属表面芯片，无需前处理可直接点加尿样检测，方法快速简便，干扰因素少，检测成本低(芯片经一定方法清洗后可重复使用)。41

19、n从未经提纯的生物或临床样品中直接捕获、检测和分析蛋白质, 不需任何标记n较高的检测灵敏度 (1-50 fmole的蛋白质)n可适用于小样品体积(0.5 l) n快速获取实验结果n获得蛋白质分子量42Biomarker Discovery by Protein Profiling应用蛋白质表达指纹图谱发现生物标志物应用蛋白质表达指纹图谱发现生物标志物lComparison of paired samples using the ProteinChip Software lData sets can be subtracted to create comparison maps, unique

20、and up- or down- regulated proteins are readily visualizedlData sets can be combined to create Averages of samplesCancerMassControlMassProtein differentiallyexpressed in diseasestate.43举例举例444546474849505152l由于质谱蛋白组技术与生俱来的优势：高灵敏度、高通量和高速度，起初大家对此技术持乐观态度，被认为是筛查生物标志物最有力的工具。l利用这一分析模式找寻诊断标志物渐渐受到了质疑，作为一个疾病

21、的早期诊断的标志物，其阳性预示值显然是偏低的，卵巢癌的研究中就存在这样的问题。l这些假设的标志物对于某种肿瘤而言可能并不特异，可能反映的仅仅是疾病的伴随状态。l随后的几年中， SELDI-TOF以及MALDI-TOF在血清或者血浆中寻找肿瘤标志物的应用受到了越来越多的质疑。批评的声音主要集中于以下三个方面：实验设计，质谱技术以及生物相关性。SELDI-TOF 缺点缺点5354实验设计实验设计l大多数的研究仅仅比较两组不同的样本 肿瘤标志物为急性时相反应蛋白？l模型出现过度拟合的现象l样本量偏小5556575859质谱技术质谱技术l血清（血浆）中的成分的微小变异会影响信号的强度。标本中的成分也会

22、影响某种蛋白质电离的有效性。事实上即使某种分子即使在两个样本中浓度相同，只要这两个样本的组成成分有所差异就会导致得到的信号的强度有所不同。l另外使用SELDI-TOF或者MALDI-TOF技术无法对候选的标志物进行直接鉴定。这样假阳性信号（急性时相反应，人工修饰造成的影响等）就无法去除。更有甚者，这些假阳性信号可能在比较质谱结果时被鉴定为标志物。为了能克服这个问题，串联质谱检测和或后续的纯化就显得十分必要了。SELDI-TOF技术尤其受到质疑，使用不同批次的芯片得到的质谱之间的差异、基线漂移以及噪音等都会降低检测结果的重复性。60数据的生物相关性数据的生物相关性l血液中的不同蛋白质的浓度至少相

23、差10个数量级，范围从白蛋白（35-50mg/ml）到IL-6(0-5pg/ml)。血浆中97%的蛋白质由下列七种主要的高丰度血浆蛋白质构成：白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、1-抗胰蛋白酶、2-巨球蛋白、转铁蛋白和脂蛋白。剩下的3%的蛋白质是一些中低丰度的蛋白质的混合物。l现行的质谱仪能检测的蛋白质的动态变化的范围（通常能检测2-3个数量级范围）不足以包括血液标本中的所有蛋白质。特别当疾病只累计很少的一些细胞时，血液中特定疾病所造成的组织释放的蛋白质的浓度常常太低导致无法被检测出来。这些高丰度的蛋白质常常能掩盖那些浓度低几个数量级的蛋白质所发出来的信号。而且，当非特异性的结合物质（例如树脂材料

24、），用来捕获样本中的蛋白质，高丰度的蛋白质往往会竞争和干扰低丰度的蛋白质的结合。而且一个低丰度的蛋白质的光谱信号的强度，可能仅仅因为血液中其他成分的存在而显示出差异。l循环血浆中蛋白质浓度因为一些因素而造成的内在变异而发生变化，例如个体的基因背景、性别、年龄、营养状态和生活方式（包括吸烟和饮食）、用药情况、以及其他一些因素。当然血液标本的收集过程也会影响最后的质谱的结果，如采集标本时的体位，或者使用止血带都会影响检测结果。标本的储存条件也影响血浆或者血清中的微量蛋白的稳定性，这一点也已经得到证实。61其他其他l无法对潜在的标志物进行鉴定。虽然，质谱技术找到的差异蛋白峰可以作为标志物，但是如果能

25、实现进一步的鉴定有很多优点。首先，这能为设计单独实验来验证质谱的结果提供一种可能（例如ELISA）。这些替代实验可能耗费更低并且更容易在临床检测中运用。而且，如果鉴定出这些差异的蛋白质，那么就非常清楚地知道这些分子可能非特异性还是特异性的标志物。对蛋白质的鉴定有利于正确的样本分组，为研究的疾病提供相关的生物学信息。l发现新标志物的研究的一个重要障碍是如何有效地评估这些潜在标志物的临床意义。没有独立的、多中心的、大型临床验证试验，将无法评估这些标志物是否能真正有效地用于疾病的诊断或者治疗监测的指标。626364Alpha-defensin 家族是由一组具有抗微生物、细胞毒、抗肿瘤活性的短肽组成,

26、分为主要存在于中性粒细胞和肠道Paneth 细胞中。 是一非肿瘤特异的，应激状态的蛋白。65 “Serum/plasma proteomic patterns obtained by SELDI may not be reproducible and that the discriminatory peaks are not consistent within a group or among groups of investigators for the same type of cancer, even when the general analytical methods or data

27、sets are the same.”Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarkeridentification by mass spectrometryJournal of Chromatography A, 1153 (2007) 25927666患者血清样品磁珠分离过程数据分析临床结果* * *疾病正常正常BindingWashingElutionMALDI TOF检测Clinprot 检测流程健康人67液体芯片工作原理液体芯片工作原理68ClinProt 磁珠试剂盒磁珠试剂盒疏水作用疏水作用MB-HIC 1MB-H

28、IC 3MB-HIC 8MB-HIC 18鳌合金属亲和鳌合金属亲和MB-IMAC-FeMB-IMAC-Cu离子交换离子交换MB-WCXMB-WAX糖蛋白试剂盒糖蛋白试剂盒G蛋白试剂盒蛋白试剂盒692079220427483260m/z 2079, 2204, 2748, 3260NormalCancerClinPort Analysis of Human Plasma Samples 70观察差异峰观察差异峰 Class 1Class 2生物信息数据处理软件 - ClinProTools 71ClinprotClinprot的优势的优势721.1. 超高灵敏度的质谱仪：超高灵敏度的质谱仪：fm

29、olfmol级，适合肿瘤早级，适合肿瘤早 期微量蛋白的发现。期微量蛋白的发现。 样品靶上加有疏水作用基团，中样品靶上加有疏水作用基团，中央是亲水基团，在溶剂蒸发时，收缩央是亲水基团，在溶剂蒸发时，收缩样品液滴集中在中央，可大大增加单样品液滴集中在中央，可大大增加单位面积样品的浓度位面积样品的浓度相对常规芯片，提高相对常规芯片，提高10-100 10-100 倍的灵敏度倍的灵敏度 一块芯片有一块芯片有9696点，处理量较一点，处理量较一般的芯片更大！般的芯片更大！10 fmol 普通干燥液滴1 fmol AnchorChip 目标靶优势一：灵敏度高优势一：灵敏度高73优势二：重复性好优势二：重复

30、性好 示例：某实验对比三个蛋白峰的重现性示例：某实验对比三个蛋白峰的重现性l0.0119l9278.5l0.0096l7760.0l0.0089l5902.9lCVlMeanlLocation (n= 4)l3l2l1lBrukerlPeaklPlatform74 每次检测只需每次检测只需5l5l血清血清滴血验癌滴血验癌优势三：血清用量少优势三：血清用量少75优势四：磁珠种类多、适于各类临床样品优势四：磁珠种类多、适于各类临床样品疏水作用疏水作用MB-HI C 1MB-HI C 3MB-HI C 8 MB-HI C 18离子交换离子交换MB-WCXMB-WAX鳌合金属亲和鳌合金属亲和MB-IM

31、AC-FeMB-IMAC-Cu临床样品：血清、血浆、尿液、临床样品：血清、血浆、尿液、脑脊液、羊水、唾液等。脑脊液、羊水、唾液等。76优势五：样品处理通量高优势五：样品处理通量高手动处理，每次可处理手动处理，每次可处理9696个样品个样品 利用机械臂每天可处理高达利用机械臂每天可处理高达3 3万个样品万个样品77美国斯隆美国斯隆-凯特琳癌症研究所凯特琳癌症研究所2006年年2月第月第6卷卷 Nature Reviews Paul Tempst应用液体蛋白芯片指纹图谱仪对前列腺应用液体蛋白芯片指纹图谱仪对前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌进行血清多肽指纹癌、乳腺癌和膀胱癌进行血清多肽指纹谱图研究，其中对前

32、列腺癌的盲性预测谱图研究，其中对前列腺癌的盲性预测准确率达准确率达100。7879Lisa H. Cazares, Shamina Mitchell-Green, Sau-Mei Leung, Brendan C. Stack Jr., J. Trad Wadsworth, Richard R. Drake, and O. John SemmesDepartments of Microbiology and Molecular Cell Biology, Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Eastern Virginia Medical School

33、Norfolk, VA应用实例应用实例 头颈头颈部部鳞鳞状状细胞癌细胞癌生物标生物标志志的发现与鉴定的发现与鉴定80实验目的与方案：实验目的与方案： 头颈部鳞状细胞癌在美国占所有癌症的头颈部鳞状细胞癌在美国占所有癌症的5%。 寻求早期诊断头颈部鳞状细胞癌的生物标记物。寻求早期诊断头颈部鳞状细胞癌的生物标记物。 血清样品：血清样品：24名患者，名患者，24 健康对照。健康对照。 亲和性亲和性 IMAC Cu 磁珠盒。磁珠盒。81头颈头颈部部鳞鳞状状细胞癌细胞癌生物标生物标志志的发现的发现m/z494049604980500050205040506050805100 6.0 6.5 7.0 7.5

34、 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5arb. u.m/z 5066.40m/z 1469.09m/z1375140014251450147515001525155015751600 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340arb. u.m/z 1469.09红色：疾病组红色：疾病组蓝色：正常对照；蓝色：正常对照；82Peptide ViewMS/MS Fragmentation of DSGEGDFLAEGGGVRFound in gi|2

35、29185, fibrinopeptide A Start - End Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta 2 - 16 1465.72 1464.72 1464.65 0.07 Sequence DSGEGDFLAEGGGVRMatched peptides shown in Bold Red 1 ADSGEGDFLA EGGGVR C.B.1469.091868.21208.21619.02675.61352.51780.82024.52557.22297.601234x10Intens. a.u.1200140016001800200022002400260

36、0m/zA.(A) Serum profile was generated(B) MS/MS spectrum for a peptide at m/z 1469.09(C) Fibrinopeptide A, with a Mowse score of 57头颈部鳞状细胞癌生物标志头颈部鳞状细胞癌生物标志(质量质量m/z 1469Da)的鉴定的鉴定- MALDI TOF/TOF技术的应用技术的应用83MALDI-IMAGINGl基质辅助激光解吸电离（matrix assisted laser desorptionionization，MALDI）质谱成像技术最早由Caprioli 等于199

37、7年 通过将MALDI MS 离子扫描技术与专业图像处理软件结合，直接分析生物组织切片，产生任意指定质荷比（m/z）化合物的二维离子密度图（ two-dimensional ion densitymaps），对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析。84MALDIMALDI质谱分子成像的原理质谱分子成像的原理lMALDI 质谱分子成像是在专门的质谱成像软件控制下，使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。被用来研究的组织首先经过冰冻切片来获得极薄的组织片，接着用基质封闭组织切片并将切片置入质谱仪的靶上。通过计算机屏幕观察样品，利用MALDI

38、系统的质谱成像软件，选择拟成像部分，首先定义图像的尺寸，根据尺寸大小将图像均分为若干点组成的二维点阵，来确定激光点轰击的间距。激光束通过这个光栅图案照射到靶盘上的组织切片，软件控制开始采集质谱数据，在质谱仪中，激光束对组织切片进行连续的扫描，组织样品在激光束的激发下释放出的分子被质谱仪所鉴定从而获得样品上每个点的质荷比（m/ z）信息，然后将各个点的分子量信息转化为照片上的像素点。在每个点上，所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。仪器逐步采集组织切片的质谱数据，最后得到具有空间信息的整套组织切片的质谱数据。这样就可以完成对组织样品的“分子成像”。 8586MA

39、LDIMALDI质谱分子成像的技术操作流程质谱分子成像的技术操作流程 l1. 组织制备在组织切片前，切除的新鲜组织立即置液氮中冷冻23分钟后，在恒温冷冻切片机上进行切割，切割平台的温度根据组织类型保持在-5到-25之间，如高脂肪含量的组织就要求更低的温度。切片厚度一般在5到12m，保证质谱分析时足够的组分浓度。组织切片的优劣是影响图像质量的关键因素之一。切片制备需要满足以下几个条件：防止形成冰晶，维持化合物的空间排布，避免分析物的移位和降解；避免切片打卷、起皱褶；适宜的切片厚度等 87l2. 覆盖基质常用的基质有3，5-二乙氧基-4-羟基肉桂酸（又称芥子酸，SA）、-氰基-4-羟基肉桂酸（HC

40、CA）和2，5-二羟基苯甲酸（DHB）。其中，SA主要适用于高分子量的蛋白；HCCA适用于多肽和低分子量蛋白，DHB 主要适用于小分子药物。在ImagePrep工作站，在可控条件下振荡蒸发产生基质微粒，然后轻柔的置于组织样品之上。基质溶液在均匀地覆盖于组织切片表面的过程中，要尽可能满足以下几个条件：组织切片上的蛋白无扩散或移位现象；基质与蛋白形成良好的共结晶；晶体的尺寸必须小于质谱成像的分辨率。 88l3. 质谱的获得良好质谱的获得依赖于所使用的质谱仪，Smartbeam技术则将N2激光和YAG激光相结合，可获得较好质量和较高重复性的质谱，空间分辨率为10 m，可获得200Hz激光频率的谱图，

41、其XY平面的精度为5 m。89l4. 成像数据分析采用软件将选定质量、质量范围或重叠在显微图像上的质谱群的强度分布可视化，分析不同种类生物分子的空间分布，如多肽、蛋白或小分子等，峰的强度可用色彩饱和度来表示。有一些专业软件，如ClassImaging可通过组织生物标志物的多变量统计分析，自动化分类组织的分子状态。90 未经包埋的冷冻组织；未经包埋的冷冻组织； 常规切片（常规切片（10-20 10-20 微米）；微米）； 组织切片放置在导电玻璃上，用乙醇清洗组织切片放置在导电玻璃上，用乙醇清洗除去盐和脂；除去盐和脂； 切片表面喷基质用于切片表面喷基质用于MALDI TOF MALDI TOF 测

42、定。测定。 同时备有未同时备有未喷基质的切片用于组织染色。喷基质的切片用于组织染色。MALDI分子成像技术分子成像技术 样品制备样品制备91导电玻璃片导电玻璃片样品靶样品靶基质喷瓶基质喷瓶MALDI分子成像技术分子成像技术 样品装置样品装置92放置组织切片的导电玻璃片可直接放置组织切片的导电玻璃片可直接放入放入MALDI TOF质谱仪中测定：质谱仪中测定：从组织到成像从组织到成像93flexImaging SoftwareflexImaging SoftwareMeasuring areasResult filterImage of sample and result94Spatial Res

43、olution10 mMicroscopic Image63m letter burned into 400m PAC calibration spot.63 mMALDI Image (m/z 1297 Da) SmartBeamLaser spot sizeabout 10 mStep size5 mTechnical limit of Ultraflex II with smartbeam (changeable focus) 5 to 10 mCurrent practical limit on tissue 30 40 m (due to matrix preparation)95M

44、ALDIMALDI质谱分子成像的特点质谱分子成像的特点l无需事先知道所研究疾病或药物相关生物分子的信息，而且不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，它可在组织切片中找到每一种蛋白质分子，并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息，同时可对这些蛋白质分子含量进行简单的定量，为寻找、阐明和鉴定重要蛋白提供了更快分析结果以及可视化结果。l通过组织样品以扫描的模式捕获谱图，即可提供代表多肽、蛋白质、代谢物或其他分子的质谱信号，这些数据产生的彩色图像完全可以取代显微镜图片。l获得图像不需要对组织中的生物分子进行标记或染色，操作方便和简单。l高通量：同时根据蛋白指纹图谱（肽指纹图谱）鉴定成百上千的蛋白

45、质并观测感兴趣的目标蛋白在组织和细胞中的分布。高兼容性：可直接以组织切片或细胞（细胞团）进行分析。高灵敏度：可分析含量低至amol的调节蛋白，如蛋白质的各种异构体、不同修饰状态和不同的代谢片段。96l基于以上特点，MALDI质谱分子成像技术可以在药物研发过程中，在分子水平上监测药物的有效性，如当药物被用于疾病组织，就可检测组织样品外形的变化，跟踪特定药物在靶体组织中的定位即空间分布，揭示化合物是如何在不同组织中发挥作用的。l在临床蛋白质组学研究中，MALDI分子成像能够在疾病进程中，在组织中研究潜在生物标志物的空间分布以及表达的上调或下调，在诊断、癌症病程监控、外科切除有效性评价中具有重要价值

46、。MALDI质谱分子成像的应用质谱分子成像的应用97Lisa H. Cazares, Shamina Mitchell-Green, Sau-Mei Leung, Brendan C. Stack Jr., J. Trad Wadsworth, Richard R. Drake, and O. John SemmesDepartments of Microbiology and Molecular Cell Biology, Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Eastern Virginia Medical School Norfolk, VA应用实例

47、应用实例 头颈头颈部部鳞鳞状状细胞癌细胞癌生物标生物标志志的发现与鉴定的发现与鉴定98胃癌差异蛋白胃癌差异蛋白Reference section Hematoxylin/Eosin stained肿瘤肿瘤粘膜粘膜强感染强感染/零星肿瘤细胞零星肿瘤细胞上皮细胞上皮细胞MALDI-ImageMatrix deposition:Small dropletsSample courtesy of: C. Rcken, PathologyM. Ebert, GastroenterologyUniversity of Magdeburg99不同颜色代表不同蛋白不同颜色代表不同蛋白/ /多肽的分布多肽的分布光

48、学图片光学图片m/z 780m/z 744m/z 770m/z 805m/z 1754MALDI TOF组织成像组织成像 大鼠脑组织大鼠脑组织100不同颜色代表不同蛋白不同颜色代表不同蛋白/ /多肽的分布多肽的分布MALDI 分子成像分子成像 大鼠脑组织大鼠脑组织101m/z 7054, 7943 and 20026Lens provided by K Schey, Medical University South Carolina不同颜色代表不同蛋白不同颜色代表不同蛋白/ /多肽的分布多肽的分布MALDI 分子成像分子成像 牛眼球晶状体牛眼球晶状体102Chaurand et al. AJP

49、 2004, 165(4)103104105106 快速直观的发现组织中的生物标志物。快速直观的发现组织中的生物标志物。 在临床病理诊断中在临床病理诊断中克服了人为因素，医克服了人为因素，医生生, ,有可能用真实的数据来评判病情。有可能用真实的数据来评判病情。 同时可分析数千个蛋白同时可分析数千个蛋白( (不论其抗体是否不论其抗体是否可得到可得到) )病理组织染色领域的一个新里程碑。病理组织染色领域的一个新里程碑。 可分析小分子物质可分析小分子物质( (药物或代谢物药物或代谢物) )。 为医学为医学临床诊断学的研究提供了一个具临床诊断学的研究提供了一个具有前瞻性的医学平台。有前瞻性的医学平台。

50、MALDI分子成像技术优势分子成像技术优势 107蛋白质的鉴定l组织切片经MALDI MS 分析获得的质谱图经处理（如消除背景、高斯平滑及校准刻度等）和统计学意义分析后，鉴定出组织中差异表达的质谱峰，将所有的差异峰归属到列表中（按m/ z 排列），这些差异峰所对应的蛋白质或多肽可能在疾病发展进程中起到显著的调节作用。l从二维离子密度图像中得出这些蛋白质在组织中的精确位置，切取该区域组织，匀浆后提取分离蛋白质，蛋白质提取物由高效液相色谱分离，采用电喷雾（ESI）质谱定位目的蛋白并收集纯化馏分；或者由一维电泳进行分离，根据胶上标准蛋白的分子量对目的蛋白进行定位。然后进行酶解，质谱分析和数据库查询从而鉴定蛋白质。l通过免疫化学等方法，采用特异的抗体对鉴定的蛋白质进行验证。108Perspective and Future applicationslIdentifying the site of origin for tumorlRapid evaluation of surgical marginlMeasuring susceptibility and response to therapeutic agents in tumor an