大肠杆菌PCR检测方法

1、ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/XXXXXXXXX大肠杆菌PCR佥测方法MethodofPCRforthedetectionofEscherichiacoli点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXXXX-XX实施XXXXXX-XX发布辽宁省质量技术监督局DBXX/XXXXX-XXXX本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：赵凤菊，关淼，关乃鹏，李清竹，陈瑶DBXX/XXXXX-XXXX大肠杆

2、菌PCR检测方法i范围本标准规定了大肠杆菌PCR佥测方法的技术要求。本标准适用于大肠杆菌的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪粪便、脏器及纯培养物中大肠杆菌的检测。本标准中的试验操作应在生物安全n级(BSL-2)以上的实验室进行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。E.coli:大肠杆菌(Escherichiacoli)DNA脱氧核糖核酸(Diethylpyroca

3、rbonate)bp:碱基对(basepair)PCR聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)dNTP：脱氧核糖核甘三磷酸(Deoxy-ribonucleosidetriphosphate)Taq酶：ExTaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液(Trisacetate-EDTAbuffer)4原理根据E.coli保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA5仪器和器材本技术规范中需应用下列仪器和器材：高速台式冷冻

4、离心机(最大离心力12000g以上)、冰箱、PCRT增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管和0.2mL离心管、微量移液器和吸头等。6试剂和材料DBXX/XXXXX-XXXX6.1 DNAzol?Reagent:DN用由提试剂，外观为淡绿色，于48c保存。6.2 无水乙醇：-20C预冷。6.3 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20C预冷。6.4 DNAM合酶：ExTaqDNA聚合酶（5U/科L）。6.5 dNTP（2.5mmol/L）。6.6 引物：引物浓度为20mol/L;上游引物序列为5'-GCCTCGCCTGGAGAATGA-下游引物序歹U为5&#

5、39;-CCTGAGACTGCGGTGGAA-6.7 阴性对照：灭菌双蒸水6.8 阳性对照：E.coliATCC25922。6.9 无菌生理盐水。6.10 TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液，6.11 澳化乙锭。6.12 DL2000DNAMarker。注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无菌的容器分装。7操作步骤7.1 样品的采集、前处理、存放与运输7.1.1 采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2 采样工具药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121（士2）C均高压灭菌20min;剪刀、镣子经160C干热灭菌2

6、h。7.1.3 内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀猪主要脏器（肝脏、脾脏、肺脏）装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。称取1g病料进行研磨，然后加入1mL无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min,取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.4 内容物的采集与前处理采取病死或剖杀猪的小肠内容物，装入15mL灭菌离心管中，按1:5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min,取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.5 粪便的采集与前处理用药匙无菌采取发病猪新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1:5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min,

7、取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.6 血液DBXX/XXXXX-XXXX无菌采集心血，按1:1倍体积加入无菌生理盐水，混匀，转入1.5mL灭菌离心管中编号备用。7.1.7 大肠杆菌纯培养物挑取37c1824h培养的典型菌落，用1mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。然后转入1.5mL灭菌离心管中编号备用，待检。7.1.8 保存与运输采集或处理的样品在28c条件下保存应不超过24h;若需长期保存，应放置-70C冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在68h之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。

8、7.2 PCR佥测7.2.1 DN砥取7.2.1.1 取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对口管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号。7.2.1.2 每管加入800dLDNAzol,分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各200科L,颠倒混匀后,4C12000g离心10min。7.2.1.3 取与7.2.1.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，吸取900科L上清液转移至相应的管中，加入500科L无水乙醇混匀后。7.2.1.4 4C12000g离心5min,弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL75%乙醇，洗涤。7.2.1.5 4C12000g离心5min,弃上清，倒置于

9、吸水纸上，沾干液体。如此洗2次。7.2.1.6 4000g离心10s,用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥310min。7.2.1.7 加入20L经高压处理的水，轻柔混匀，溶解管壁上的DNA冰上保存备用；若需长期保存应放置-70C冰箱。7.2.2 PCR7.2.2.1 PCR应体系10xPCRBufferPC商用离心管中:17.3752.52.5mMdNTPExTaqDNA上游特异性下游特异性DNA2聚合酶PCR引物PCR引物20.1250.50.5建立25dL反应体系，按下列组分加入灭菌蒸储水7.2.2.2 PC或应条件94C预变性5min;94C变性45s,56C退火45s,72C延伸

10、50s,35个循环；72C终延伸10minDBXX/XXXX>XXXX7.2.2.3 电泳将PCFT增产物6dL与1科L上样缓冲液混合，点样于1%C脂糖凝胶（含0.5科g/mL澳化乙锭）孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000DNAMarker（分子质量标准物），缓冲液为1xTAE,以5V/cm电压电泳25min。8结果判定紫外凝胶成像仪下观察结果，当阳性对照出现在272bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果可作为判定依据。被检样品出现272bp扩增条带为E.coli核酸阳性，未出现272bp扩增条带的样品判为E.coli核酸阴性。DBXX/XXXXX-XXXXA.1电泳缓冲液（50倍）AA附录A（规范性附录）试剂配制A.1.10.5mol/L乙二俊四乙酸二钠（EDTA溶?夜（pH8.0）二水乙二俊四乙酸二钠（分析纯）灭菌双蒸水氢氧化钠灭菌双蒸水80mL18.61g调pH8.0力口至100mLA.1.2TAE（三羟甲基氨基甲烷一乙酸）电泳缓