酶、细胞、原生质体的固定化ppt课件

1、酶、细胞、原生质体的固定化酶、细胞、原生质体的固定化 徐彤砚 孟莉主要内容主要内容l酶的固定化酶的固定化l细胞的固定化细胞的固定化l原生质体的固定化原生质体的固定化l固定化酶与固定化细胞的性质与表征固定化酶与固定化细胞的性质与表征酶的固定化酶的固定化l作为一种生物催化剂，酶具有专注作为一种生物催化剂，酶具有专注 性强、催性强、催化效率高、反响条件温暖等优点，在食品工业化效率高、反响条件温暖等优点，在食品工业中发扬着重要的作用。中发扬着重要的作用。l然而，酶的稳定性差，在强酸、强碱、热及有然而，酶的稳定性差，在强酸、强碱、热及有机溶剂等作用下容易变性，从而使酶活性降低，机溶剂等作用下容易变性，从

2、而使酶活性降低，甚至失活；甚至失活；l其次，酶作用于底物后难以回收利用，在工业其次，酶作用于底物后难以回收利用，在工业上难以实现延续化、自动化，并且呵斥反响产上难以实现延续化、自动化，并且呵斥反响产物分别困难。物分别困难。固定化酶固定化酶l固定化酶是指经过各种方法将酶固定在载体上，固定化酶是指经过各种方法将酶固定在载体上，制备得到在一定的空间范围内呈闭锁形状存在制备得到在一定的空间范围内呈闭锁形状存在的酶，能延续进展反响，并且反响后的酶可回的酶，能延续进展反响，并且反响后的酶可回收后反复利用。收后反复利用。固定化酶的制备普通遵照以下几个根本原固定化酶的制备普通遵照以下几个根本原那么那么维持酶的

3、催化活性和专注性；维持酶的催化活性和专注性；固定化的载体必需有一定的机械强度，保固定化的载体必需有一定的机械强度，保证其在制备过程中不受破坏；证其在制备过程中不受破坏；固定化酶应有最小的空间位阻；固定化酶应有最小的空间位阻；所选载体应具有最大的稳定性，在运用过所选载体应具有最大的稳定性，在运用过程中不与废物、产物或反响液发生化学程中不与废物、产物或反响液发生化学反响。反响。酶固定化的方法酶固定化的方法l根据酶的性质及用途不同，可分为吸附法、结根据酶的性质及用途不同，可分为吸附法、结合法、交联法、包埋法合法、交联法、包埋法4种种l吸附法吸附法l 最简单、最经济的方法，可分为物理吸附最简单、最经济

4、的方法，可分为物理吸附法和离子交换吸附法，常用的载体有无机载体法和离子交换吸附法，常用的载体有无机载体如活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔玻璃、磷如活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔玻璃、磷酸钙、金属氧化物等、有机载体以及淀粉、酸钙、金属氧化物等、有机载体以及淀粉、白蛋白等天热高分子载体。吸附过程可到达纯白蛋白等天热高分子载体。吸附过程可到达纯化和固定化的目的，而且酶失活后可重新活化化和固定化的目的，而且酶失活后可重新活化再生。再生。l结合法结合法l 根据酶与载体结合的化学键不同，可分根据酶与载体结合的化学键不同，可分为离子结合法和共价结合法。为离子结合法和共价结合法。l 离子结合法是经过离子键结合于具有

5、离离子结合法是经过离子键结合于具有离子交换基因的水不溶性载体的固定化方法。常子交换基因的水不溶性载体的固定化方法。常用的阴离子交换剂载体：用的阴离子交换剂载体：DEAE-纤维素，纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶，葡聚糖凝胶，Amerlite IRA-193、IRS-410、IRA-900;阳离子交换剂载体有阳离子交换剂载体有CM-纤维纤维素，素， Amerlite CG-50、IRC-50、IR-120，Dower-50等。等。 共价结合法是利用酶蛋白中含有的反响基团与载体上的反响基团构成共价键而使酶固定化的方法。 偶联的基团主要是芳香氨基、羟基、羧基、羧甲基、氨基等非必需功能基团，常用的载体有纤

6、维素、甲壳素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物等。l交联法交联法l 利用双功能或多功能试剂使酶分子之间利用双功能或多功能试剂使酶分子之间或酶蛋白与其他惰性蛋白之间发生交联、凝聚或酶蛋白与其他惰性蛋白之间发生交联、凝聚成网状构造对酶进展固定的方法称为交联法。成网状构造对酶进展固定的方法称为交联法。l 常用的双功能或多功能试剂有戊二醛、常用的双功能或多功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯、异氰酸酯、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯、异氰酸酯、双重氮联苯胺等。双重氮联苯胺等。l包埋法包埋法l 包埋法是将酶包埋在多聚物内的一种方法。包埋法是将酶包埋在多聚物内的一种方法。

7、分为：分为：l 凝胶包埋法：将酶包埋在高分子凝胶细微凝胶包埋法：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中，常用的载体有明胶、琼脂、琼脂糖、网格中，常用的载体有明胶、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠等；聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠等；l 微胶囊法：将酶包埋在直径只需几微米至微胶囊法：将酶包埋在直径只需几微米至几百微米的高分子半透膜中，方法有界面沉淀几百微米的高分子半透膜中，方法有界面沉淀法、界面聚合法、二级乳化法以及脂质体包埋法、界面聚合法、二级乳化法以及脂质体包埋法。法。凝胶包埋法的特点凝胶凝胶包埋条包埋条件件酶活性酶活性强强度度天然凝天然凝胶胶琼脂、海藻琼脂、海藻酸钙、角叉酸钙、角叉

8、菜胶、明胶菜胶、明胶温和温和不变不变差差合成凝合成凝胶胶聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、光交联树脂光交联树脂聚合反聚合反应应部分失部分失活活高高微囊型包埋法微囊型包埋法 微囊型包埋法又称半透膜包埋法。微囊型包埋法又称半透膜包埋法。 将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内内 。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约约25nm。 半透膜孔径半透膜孔径酶分子孔径，小于半透膜孔径酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自在进出，被称为的小分子底物和产物可以自在进出，被称为“人工巧胞。人工巧胞。与凝胶型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：

9、与凝胶型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：固定化酶颗粒小，有利于底物和产物分散。固定化酶颗粒小，有利于底物和产物分散。半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可防半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可防止引起免疫过敏反响，也可使酶免遭蛋白水解酶的降止引起免疫过敏反响，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。解，具有较大的医学价值。 缺陷：反响条件要求高缺陷：反响条件要求高,制备本钱也较高。制备本钱也较高。 包埋法是目前运用最多的一种较理想的方法，与其它包埋法是目前运用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：固定化方法相比： 优点：不与酶蛋白氨基酸残基反响，很少改动酶的

10、高优点：不与酶蛋白氨基酸残基反响，很少改动酶的高级构造，酶活回收率高。级构造，酶活回收率高。 缺陷：只适宜作用于小分子底物和产物的酶。缺陷：只适宜作用于小分子底物和产物的酶。 吸附法吸附法 共价偶联法共价偶联法 交联法交联法 包埋法包埋法 酶的四种固定化方法酶的四种固定化方法各种固定化方法的优缺陷比较固定化方法固定化方法吸附法吸附法包埋法包埋法共价结共价结合法合法交联法交联法物理吸附法物理吸附法离子吸附法离子吸附法制备难易制备难易易易易易较难较难难难较难较难结合程度结合程度弱弱中等中等强强强强强强活力回收活力回收高，酶易流失高，酶易流失高高高高低低中等中等再生再生可能可能可能可能不能不能不能不

11、能不能不能费用费用低低低低低低高高中等中等底物专一性底物专一性不变不变不变不变不变不变可变可变可变可变耦合固定法耦合固定法l单一的吸附固定化酶存在酶和载体容易零落、结合不结实等问题。单一的吸附固定化酶存在酶和载体容易零落、结合不结实等问题。为处理上述问题，研讨者不断提出新的载体和固定化方法并在耦为处理上述问题，研讨者不断提出新的载体和固定化方法并在耦合固定化方面进展了大量的研讨，所谓耦合固定化是指几种固定合固定化方面进展了大量的研讨，所谓耦合固定化是指几种固定化方法或载体的结合运用，即添加稳定因子和促进因子的固定化化方法或载体的结合运用，即添加稳定因子和促进因子的固定化方法。耦合固定化技术可以

12、平衡和改善传统单一固定化方法的优方法。耦合固定化技术可以平衡和改善传统单一固定化方法的优缺陷，使酶在坚持原有活性的根底上，缺陷，使酶在坚持原有活性的根底上， 稳定性有所提高，稳定性有所提高， 还具还具有操作简单，本钱低廉等优点。有操作简单，本钱低廉等优点。吸附吸附-包埋包埋l包埋法具有操作方便、条件温暖、根本不会改动酶的构造、酶不包埋法具有操作方便、条件温暖、根本不会改动酶的构造、酶不易零落等优势、但也存在机械强度差、酶易走漏、传质阻力较大易零落等优势、但也存在机械强度差、酶易走漏、传质阻力较大等问题。利用耦合固定化技术可以很好地处理上述问题。等问题。利用耦合固定化技术可以很好地处理上述问题。

13、l包埋法运用的一些凝胶分子的间隙较大，容易呵斥酶在其中的疏包埋法运用的一些凝胶分子的间隙较大，容易呵斥酶在其中的疏漏，通常可以运用以下方法处理漏，通常可以运用以下方法处理:用交联或共价结合的方法处用交联或共价结合的方法处置包埋酶颗粒；将酶吸附在一些大分子颗粒上来增大酶分子的置包埋酶颗粒；将酶吸附在一些大分子颗粒上来增大酶分子的体积。将葡萄糖淀粉酶吸附在凝胶化的玉米淀粉颗粒上，再利用体积。将葡萄糖淀粉酶吸附在凝胶化的玉米淀粉颗粒上，再利用海藻糖包埋，处理了单一吸附呵斥的酶走漏问题，同时包埋海藻糖包埋，处理了单一吸附呵斥的酶走漏问题，同时包埋-吸吸附法改善了包埋法传质阻力大的缺陷，吸附剂的参与降低

14、了固定附法改善了包埋法传质阻力大的缺陷，吸附剂的参与降低了固定化细胞的疏漏，添加细胞在载体中的分散性化细胞的疏漏，添加细胞在载体中的分散性 。研讨阐明将吸附。研讨阐明将吸附剂添加到卡拉胶包埋体系中，与单一的吸附相比固定化细胞转化剂添加到卡拉胶包埋体系中，与单一的吸附相比固定化细胞转化 L-苯丙氨酸转化才干提高了苯丙氨酸转化才干提高了52%，处理了转化才干差的问题，处理了转化才干差的问题吸附吸附-交联交联l酶与吸附载体经过的物理吸附或离子吸附作用结合，结合力较弱，酶与吸附载体经过的物理吸附或离子吸附作用结合，结合力较弱，在高离子强度和高在高离子强度和高pH 值情况下容易解析，从而呵斥酶的走漏。值

15、情况下容易解析，从而呵斥酶的走漏。交联作用可以加强酶和载体之间的作用力，防止单一吸附固定化交联作用可以加强酶和载体之间的作用力，防止单一吸附固定化酶易零落呵斥产物污染的问题，提高固定化酶的稳定性。酶易零落呵斥产物污染的问题，提高固定化酶的稳定性。l利用纯化的海沙固定环胡精葡萄糖苷转移酶利用纯化的海沙固定环胡精葡萄糖苷转移酶( CGTase)，虽然吸，虽然吸附率可以到达附率可以到达 98%，但酶很容易从介质上零落，经过戊二醛交，但酶很容易从介质上零落，经过戊二醛交联之后加强了结合力，处理了酶容易零落的问题，交联之后酶在联之后加强了结合力，处理了酶容易零落的问题，交联之后酶在反响反响8 批次后，依

16、然可以维持批次后，依然可以维持80%的活性。的活性。l研讨发现用蛋壳吸附后用戊二醛交联固定化脂肪酶的方法机械强研讨发现用蛋壳吸附后用戊二醛交联固定化脂肪酶的方法机械强度好，可以抵挡较强的剪切力，比单一利用海藻酸包埋法更适宜度好，可以抵挡较强的剪切力，比单一利用海藻酸包埋法更适宜于催化搅拌罐中的油脂反响，于催化搅拌罐中的油脂反响， 能反复运用能反复运用8 批次。批次。l吸附吸附-交联法还具有操作简单、吸附容量大、资料来源广泛、本交联法还具有操作简单、吸附容量大、资料来源广泛、本钱低廉等优点。钱低廉等优点。细胞的固定化细胞的固定化l采用物理或化学的方法固定细胞，是利用酶或采用物理或化学的方法固定细

17、胞，是利用酶或酶系的一条捷径。酶系的一条捷径。l 优点：优点：l 免去破碎细胞提取酶的复杂过程。免去破碎细胞提取酶的复杂过程。l 酶在细胞内环境中，稳定性更高，固定酶在细胞内环境中，稳定性更高，固定后酶活损失较少。后酶活损失较少。l 可催化较复杂的反响复合酶系统。可催化较复杂的反响复合酶系统。 l 制备本钱低。制备本钱低。 缺陷：缺陷： 多适用于胞内酶；多适用于胞内酶； 对底物和产物有一定限制：要求底物、产物易对底物和产物有一定限制：要求底物、产物易透过细胞膜。透过细胞膜。 产物较复杂，有副反响，给提取添加了难度。产物较复杂，有副反响，给提取添加了难度。 固定化细胞的分类分类方式分类方式固定化

18、细胞固定化细胞分类方式分类方式固定化细胞固定化细胞细胞类型细胞类型微生物微生物植物植物动物动物生理状态生理状态死细胞死细胞: :完整细胞完整细胞, ,细胞碎片细胞碎片, ,细细胞器胞器活细胞活细胞: :增殖细胞增殖细胞, ,静止细胞静止细胞, ,饥饥饿细胞饿细胞细胞固定方法细胞固定方法l直接固定法直接固定法 l 不运用载体，借助物理如加热、冰不运用载体，借助物理如加热、冰冻、化学方法如柠檬酸、各种絮凝剂将冻、化学方法如柠檬酸、各种絮凝剂将细胞直接固定。普通只用于单酶或少数几种酶细胞直接固定。普通只用于单酶或少数几种酶催化的反响。催化的反响。l吸附法吸附法l 细胞外表带有电荷，因此可以经过离子细

19、胞外表带有电荷，因此可以经过离子交换或吸附作用结合于载体。该法简便，易于交换或吸附作用结合于载体。该法简便，易于再生，但结合力弱，易零落。工业运用上较少。再生，但结合力弱，易零落。工业运用上较少。l包埋法包埋法l同酶包埋法同酶包埋法l例：海藻酸钙例：海藻酸钙-聚赖氨酸聚赖氨酸ALG-PLL包埋技术包埋技术l 动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋聚赖聚赖氨酸处置，使胶粒外层包上一层聚赖氨氨酸处置，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜酸薄膜柠檬酸钠溶液处置，使海藻酸柠檬酸钠溶液处置，使海藻酸钙凝胶溶解钙凝胶溶解聚赖氨酸膜包被的近乎透聚赖氨酸膜包被的近乎透明的微囊型固定化动物细胞明的微

20、囊型固定化动物细胞原生质体的固定化 (1)固定化原生质体去除了细胞壁的分散妨碍，固定化原生质体去除了细胞壁的分散妨碍，有利于氧的传送，营养成分的吸收和胞内产物有利于氧的传送，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的维护作用，稳定性提高。由于载体的维护作用，稳定性提高。原生质体的固定方法原生质体的固定方法l普通采用凝胶包埋法。常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角普通采用凝胶包埋法。常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树脂。叉菜胶和光交联树脂。l留意：普通要加浸透压稳定剂，以防止原生质体破裂。留

21、意：普通要加浸透压稳定剂，以防止原生质体破裂。l原生质体的制备原生质体的制备l要求：坚持膜的完好性，不能使细胞内部的构造遭到破坏要求：坚持膜的完好性，不能使细胞内部的构造遭到破坏l制备：对数期细胞的搜集制备：对数期细胞的搜集高渗溶液中加酶破壁高渗溶液中加酶破壁分别除去细胞分别除去细胞碎片、完好的细胞及酶密度梯度离心碎片、完好的细胞及酶密度梯度离心原生质体原生质体l原生质体的固定原生质体的固定l 原生质体原生质体等渗缓冲液中配成一定浓度的原生质体悬浮液等渗缓冲液中配成一定浓度的原生质体悬浮液凝凝胶包埋胶包埋固定化酶与固定化细胞的性质与表征固定化酶与固定化细胞的性质与表征l酶经固定化后，催化作用由

22、均相反响转变为非均相反酶经固定化后，催化作用由均相反响转变为非均相反响，同时酶的构造在一定程度上发生改动，酶、底物、响，同时酶的构造在一定程度上发生改动，酶、底物、载体之间的静电相互作用带来的分散效应、空间位阻、载体之间的静电相互作用带来的分散效应、空间位阻、电荷效应、载体性质呵斥的分配效应等必然会对酶的电荷效应、载体性质呵斥的分配效应等必然会对酶的性质产生影响。性质产生影响。l评价固定化酶的参数主要有以下几点：评价固定化酶的参数主要有以下几点：活性与稳定性变化活性与稳定性变化l活力大多数情况下比天然酶小，其专注性也能活力大多数情况下比天然酶小，其专注性也能够会发生变化。够会发生变化。l热稳定

23、性，热稳定性，PH稳定性，储存稳定性，对各种稳定性，储存稳定性，对各种有机试剂、酶抑制剂及蛋白质的稳定性提高。有机试剂、酶抑制剂及蛋白质的稳定性提高。 缘由主要有：缘由主要有： 固定化酶与载体多点衔接，可防止酶分子的固定化酶与载体多点衔接，可防止酶分子的伸展变形；伸展变形； 酶活力释放缓慢；酶活力释放缓慢； 酶经固定化后，酶分子间相互作用时机丧失，酶经固定化后，酶分子间相互作用时机丧失，抑制了酶的自降解。抑制了酶的自降解。最适温度和最适最适温度和最适pH值值l最适温度最适温度l 大多数固定化酶热稳定性提高，最适大多数固定化酶热稳定性提高，最适反响温度也随之提高反响温度也随之提高l最适最适pH值值l 带负电荷的载体，催化反响的产物为带负电荷的载体，催化反响的产物为酸性：向碱性偏移；酸性：向碱性偏移；l 带正电荷的载体，催化反响的产物为带正电荷的载体，催化反响的产物为碱性：向酸性偏移；碱性：向酸性偏移；l 不带电荷的载体，催化反响的产物为不带电荷的载体，催化反响的产物为中性：不发生偏移。中性：不发生偏移。反响动力学反响动力学固定化酶